Está en la página 1de 7

Universidad de Chile.

Bioqumica.
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular.
Prof. Christian Wilson M.
Semestre Otoo 2017

Informe Trabajo Prctico N3:


Anlisis de protenas por electroforesis en geles denaturantes
de poliacrilamida.

Integrantes:
GianFranco Rubio E.
Valeria Trincado F.
Fernanda Valenzuela.

Grupo De Trabajo N3
8 de Junio de 2017
Introduccin
La bioqumica es una disciplina cientfica que aborda el estudio de biomolculas, su
interaccin y su efecto sobre sistemas biolgicos. Para lograr esta comprensin la
bioqumica hace uso de conocimientos qumicos, biolgicos y fsico-qumicos, integrando
estas disciplinas para abordar problemas que aquejan a nuestra sociedad, en mbitos como
la medicina, la farmacologa, la agricultura, entre muchos otros.
Uno de los focos de estudio de la bioqumica son las protenas, biopolmeros conformados
por aminocidos y/o sus derivados, las cuales cumplen funciones primordiales en los seres
vivos. Durante el anlisis de estas molculas rara vez se logra obtener una muestra
completamente pura de nuestra protena de inters, es por esto que se han debido
desarrollar numerosas tcnicas de separacin de molculas. Una de estas tcnicas es la
electroforesis en gel, que se basa en la separacin de las especies segn su tamao y carga
elctrica. Para lograr este efecto es necesaria la preparacin de un gel de poliacrilamida, un
polmero formado por el entrecruzamiento que se genera entre molculas de acrilamida y
N,N Metilen-bis-acrilamida en un medio con presencia de Persulfato de amonio (APS) y
TEMED como catalizadores redox. Este entrecruzamiento genera una red por la cual se
desplazarn las muestras y cuyo tamao de poro depender en gran medida de la
concentracin de acrilamida y bis acrilamida, obtenindose poros de menor tamao
mientras mayor sea la concentracin de acrilamida.
Debido a que este mtodo de separacin se basa en la relacin carga/masa de las muestras
es que el anlisis de protenas presenta una dificultad mayor, ya que estas molculas
presentan propiedades elctricas, tamaos y formas distintas unas de otras, en contraste del
caso de los cidos nucleicos. Este problema puede ser sorteado con el uso de agentes
denaturantes como el dodecil sulfato de sodio (SDS), que logran escindir las uniones no
covalentes de la cadena peptdica, desarticulando la conformacin nativa de la protena.
Para lograr un completo desplegamiento es necesario agregar tambin sustancias reductoras
como el -mercaptoetanol (-me) o Ditiotreitol (DTT), estas molculas son capaces de
eliminar los enlaces disulfuro inter e intracatenarios presentes en la muestra debido a la
presencia de aminocidos cistena.
La finalidad de este trabajo practico es servir como un acercamiento a la tcnica de
electroforesis en gel, para la determinacin del peso molecular de una muestra proteica
problema mediante la confeccin de una curva de calibracin, basada en el desplazamiento
obtenido con patrones de peso conocido.

2
Materiales y Metodologa

Materiales e Instrumentos:
Reactivos:
Solucin acrilamida/ bis 30% / 0.8% Materiales:
acrilamida. Unidad de electroforesis.
Amortiguador gel 1.5M Tris-HCl pH 8.8 Bao de agua.
separador
Fuentes plsticas con tapas para
Amortiguador gel 0.5M Tris-HCl pH 6.8
concentrador teir y desteir
SDS 10% Agitador rotatorio
Amortiguador de 0.025M Tris, 0.192M glicina,
corrida 0.1% SDS pH 8.3 Metodologa: Para la primera parte de
10%
este trabajo practico se debe preparar
Persulfato de amonio
(APS) una solucin en base a la muestra
problema. Esta solucin debe contener
Amortiguador de carga 0.125 M Tris-Cl, 4% SDS, una masa de 30 g de protena, as
20% v/v glicerol, 0.02% azul como tambin un volumen suficiente de
de bromofenol, pH 6.8. amortiguador de carga 4X, de modo que
la mezcla final quede a una
Solucin de tincin concentracin 1X del amortiguador.
0.025% azul de Coomasie R-
Una vez preparada la muestra debe ser
250, 7% cido actico, 40% puesta en un bao de agua hirviendo
metanol durante 5 minutos, tras los cuales se
Solucin de desteido I 7% c. actico, 40% metano procede a cargar el gel previamente
preparado por el equipo docente. Es
Solucin de desteido II 7% c. actico, 5% metanol
importante que a la hora de cargar la
n-butanol saturado en muestra en el gel esta se introduzca
agua ntegramente en el pocillo designado, a
-mercaptoetanol modo de no perder muestra o
contaminar otros pocillos. Junto con
TEMED (Tetrametiletilendiamina)
cargar la muestra es tambin necesario
Estndares de peso PageRuler Prestained cargar un estndar de pesos moleculares,
molecular. Protein Ladder, de modo que sea posible comparar la
FERMENTAS solucin problema con el fin de estimar
el peso de esta. Completados estos
pasos se debe conectar el equipo de electroforesis a su fuente de poder, comenzando as la
separacin de las muestras. Durante el tiempo que toma la separacin se proceder a
realizar la segunda parte de la experiencia, que tiene como fin la preparacin de los geles
necesarios para la electroforesis. El primero de estos es el conocido como gel separador,
que debe ser preparado segn las especificaciones de la Tabla 1, cuidando de agregar APS
como ltimo reactivo, puesto que este inicia la reaccin de polimerizacin.

3
Una vez agregado el APS se debe traspasar la Tabla 1: Volmenes requeridos para
solucin rpidamente a los vidrios gel separador
previamente limpiados y ajustados en el Solucin Acril/Bisacril 2,000 ml
equipo de electroforesis, cuidando de no Amortiguador Gel 1,300 ml
generar burbujas dentro del gel. El llenado Separador
debe ser hasta 1 cm por debajo del nivel de la ddH2O 1,600 ml
peineta plstica, de modo de dejar espacio SDS 10% 50 L
para el gel concentrador y los pocillos. Sobre TEMED 5 L
esta solucin se debe agregar una capa de APS 10% 50 L
Volumen Total 5 ml
Isopropanol que debe ser eliminada una vez
se complete la gelificacion. Completado este paso se procede a lavar el gel con agua
destilada y a preparar la solucin del gel concentrador, que ha de seguir los volmenes
indicados en la Tabla 2, teniendo en cuenta las
mismas precauciones que en caso anterior.
Tabla 2: Volmenes requeridos para
gel concentrador Una vez preparada la solucin rpidamente
Solucin Acril/Bisacril 830 L debe ser puesta sobre el gel separador
Amortiguador Gel 630 L previamente realizado, llenando el recipiente
Concentrador hasta el borde, e inmediatamente colocando la
ddH2O 3,400 ml peineta con el cuidado de no dejar burbujas en
SDS 10% 50 L
la solucin. Cuando la gelificacion se
TEMED 5 L
encuentre completa se debe retirar la peineta,
APS 10% 50 L
con la precaucin de no daar los bolsillos
Volumen Total 5 ml
Posterior al trabajo practico el equipo docente proceder a la tincin del gel cargado
utilizado en la primera parte del laboratorio, para esto se colocar el gel en una solucin de
tincin por un periodo de 4 a 5 horas, tras lo cual se utilizarn las soluciones de desteido I
y II hasta lograr ver claramente las bandas sin una tincin excesiva del gel.

Resultados
Para la preparacin de la solucin problema se Tabla 3: Volmenes utilizados para
utiliz una muestra proteica con una preparacin de solucin problema
concentracin de 10 g/L. Los volmenes de
reactivos utilizados se encuentran resumidos en la Muestra Problema 3 L
tabla 3. Amortiguador de carga 5 L

Tras el proceso electroforesis, tincin y desteido ddH2O 12 L


del gel se obtuvo el patrn de desplazamiento que Volumen Total 20 L
se observa en la imagen 1.

4
En esta imagen se pueden observar los patrones de peso
molecular en el carril demarcado como 1, mientras que
el carril numero 2 corresponde a la carga de la muestra
problema. Utilizando el programa de anlisis ImageJ en
su distribucin FIJI se procedi a medir el
desplazamiento relativo tanto de los patrones como de
las muestras, con la intencin de realizar una curva de
calibracin que permitiera estimar el peso molecular de
la protena problema. El desplazamiento relativo est
dado por el cociente entre la distancia desde el comienzo
del gel separador a la mitad de la banda de inters y la
distancia desde el comienzo del gel separador al frente
de migracin. Los resultados obtenidos se resumen Imagen 1: Gel Obtenido tras electroforesis y tincin. Se
en la tabla 4, los que luego fueron convertidos en el incluye tambin los pesos moleculares de los estndares.
grafico 1.
Obtenida la curva de calibracin se
calcul la relacin matemtica entre Tabla 4: Peso Molecular y desplazamiento de los patrones
Patrn Peso Molecular [kDa] Log (PM) Rf
las variables, obtenindose la
A 170 2,23044892 0,25652091
ecuacin:
B 130 2,11394335 0,3332722
log = 1.2207 + 2.5329 C 95 1,97772361 0,4579078
D 72 1,8573325 0,54185846
Esta ecuacin presenta un coeficiente E 55 1,74036269 0,66663011
de correlacin lineal R de 0,996, F 43 1,63346846 0,7289491
indicndonos que existe una relacin MP - - 0,6024512
directa entre las variables.
Con estos datos es ahora posible hacer la Curva de Calibracin
interpolacin que nos permitir estimar el peso 2,5
molecular de nuestra muestra problema:
2
Log (PM) = 1.2207 0,6024 + 2.5329
Log MM

1,5

PM = 62.73 1

0,5
Discusin 0
Al momento de la realizacin de una purificacin 0 0,2 0,4 0,6 0,8
de protenas por electroforesis se deben tener en y = -1,2207x + 2,5329 Rf
cuenta diversos factores que pueden afectar en la R = 0,996
interpretacin de la migracin de las protenas. Una de Grafico 1: Curva de calibracin elaborada con los
ellas es el tamao del poro del gel, el cual tiene relacin desplazamientos de los patrones
con la concentracin de poliacrilamida utilizada, ya que
esto podra afectar en la separacin de las protenas si es que estas tuviesen pesos
moleculares muy cercanos, lo ideal es utilizar entre una concentracin de 5 a un 10% de
poliacrilamida, ya que dentro de este rango se puede lograr una separacin cualitativa entre

5
las protenas a analizar. Otro factor a considerar en la sensibilidad del mtodo es el
compuesto con el cual se tie la muestra, en este caso se utiliz el reactivo de Coomasie el
cual, a pesar de no ser el reactivo ms sensible, logr con su objetivo.
Tomando en cuenta lo anterior al analizar los resultados obtenidos en la experiencia
pudimos determinar el peso molecular de la muestra problema, calculando un valor de
62,73 kDa, valor muy cercano al tamao de 66,38 kDa que presenta la Albmina de suero
bovino o BSA, por lo que podramos especular que nuestra muestra problema se tratara de
esta protena.
En la fotografa de la electroforesis realizada, en el carril donde fue cargada la protena
problema se observa la presencia de dos bandas, una de ellas de menor tamao y ms
desplazada hacia el nodo, a la altura del patrn F, esta banda corresponde al azul de
bromofenol, que en la electroforesis, por su menor tamao, se mueve ms rpido que la
mayora de molculas de protenas, es decir, marca el "frente de avance". Gracias a que su
color azul-violeta es fcilmente visible, permite detener la electroforesis con la confianza
de que las molculas no se hayan salido del gel.

Conclusin
Debido al gran papel que juegan las protenas en casi la totalidad de los procesos biolgicos
es que gran nmero de tcnicas se han desarrollado para poder estudiar sus propiedades.
Lamentablemente el conseguir una muestra pura a partir de un organismo es prcticamente
imposible, es por esto que diversas tcnicas de purificacin han sido desarrolladas con el
paso del tiempo. Durante este trabajo practico se buscaba comprender la tcnica de
separacin por electroforesis en gel, para este propsito se fij como meta el cumplir con
ciertos objetivos. Entre estos se encontraba el comprender el proceso de fabricacin de los
geles necesarios para la tcnica, as como la preparacin del equipamiento de electroforesis
y su funcionamiento, con la finalidad de conocer el peso de una muestra problema con la
ayuda de patrones de peso conocido. En vista a las experiencias realizadas y los resultados
obtenidos de cada una de ellas, expresados en las tablas y grficos mostrados anteriormente,
consideramos que el propsito de este laboratorio fue satisfactoriamente cumplido,
entregndonos nuevas herramientas que muy probablemente nos sern de mucha ayuda en
futuras actividades de investigacin cientfica.
Si bien el tiempo del que se dispona para la realizacin de este trabajo practico era bastante
acotado, ya que como se discuti anteriormente esta tcnica conlleva varias horas de
procesos, se lograron comprender los puntos claves sobre esta tcnica que es ampliamente
utilizada en diversas reas de estudio. Como grupo nos gustara expresar a modo de
sugerencia que en futuras versiones de esta experiencia se considerara el dedicar un horario
extendido a esta actividad, o de ser posible dividir el trabajo practico en 2 partes.

6
Referencias

Gua de Trabajos Prcticos 3. Anlisis de protenas por electroforesis en geles denaturantes de


poliacrilamida. FCQYF. Universidad de Chile. Mayo., 2017.
GARFIN, D. Essential Cell Biology. Oxford UK. Oxford University Press. 2003. Volume 1:
Cell Structure, A Practical Approach.
BARWICK, V. (2003) Preparation of Calibration Curves: A Guide to Best Practice. LGC Limited
2003.
Amersham Biosciences Inc. Protein Electrophoresis Technical Manual. Buckinghamshire,
England. Amersham Biosciences UK Limited. 1999.