UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE HUAMANGA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA VETERINARIA

Determinación de la integridad de la membrana espermática mediante la prueba de Host y tinción Hoesch 33342/pi en semen
fresco, refrigerado y post descongelado de alpacas (Vicugna pacos), Ayacucho, 2018.
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA INTEGRIDAD DE LA MEMBRANA ESPERMATICA EN SEMEN FRESCO,
REFRIGERADO Y CONGELADO DE ALPACAS, EVALUADAS CON DOS MÉTODOS

PROYECTO DE TESIS

PRESENTADO POR:

Ever Linares Motta

Ayacucho – Perú

2018
 ÍNDICE

I. GENERALIDADES............................................................................................................3
II. PLAN DE INVESTIGACION........................................................................................3
2.4 Marco teórico................................................................................................................3
III. METODOLOGIA...........................................................................................................3
IV. PRESUPUESTO..............................................................................................................3
VI. MATRIZ DE CONSISTENCIA.....................................................................................4
I. GENERALIDADES

I.1 Titulo

Determinación De La Integridad De La Membrana Espermática Mediante La Prueba De Host Y Tinción Hoesch

33342/PI En Semen Fresco, Refrigerado Y Post Descongelado De Alpacas (Vicugna Pacos), Ayacucho, 2018.

I.2 Autor
Ever Linares Motta
I.3 Asesor
M.V.
I.4 Línea de investigación
Biotecnología Reproductiva
I.5 Localidad
El presente trabajo se llevará acabo en la Estación Experimental Agraria CANAAN, ubicado en el distrito Andrés
Avelino, av. ++++ S/N Ayacucho.
I.6 Duración de la investigación
La presente investigación tendrá una duración de tres meses calendarios

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

2.1 Descripción del problema y justificación

La evaluación convencional del semen en las diferentes especies incluye diversos parámetros macroscópicos
(volumen, color) y microscópicos (concentración, motilidad y viabilidad). Pero los valores obtenidos a partir de un
 espermatograma básico no son indicadores de fertilidad, sino que son indicadores de la funcionalidad del macho,
así como de su ciclo hormonal y espermatogénico (Calamera, 2004). Sin embargo, la mayoría de estudios realizados en
nuestro medio orientados al manejo y conservación de espermatozoides en animales domésticos incluyen limitados
parámetros de referencia. No obstante, existen técnicas especializadas diseñadas con la finalidad de estimar la
potencial capacidad fecundante de una muestra de espermatozoides. En ese sentido, la evaluación de la integridad
funcional y estructural de la membrana plasmática, pueden representar indicadores de la funcionalidad de los
espermatozoides de alpaca. La integridad y actividad funcional de la membrana espermática es de gran importancia
en el proceso de fecundación, siendo éste parámetro un indicador de la capacidad fertilizante de los
espermatozoides (Gonzáles, 1992).

2.2 Formulación del problema

a. Problema general

b. Problemas específicos
 Jhdjkdhgk
 sfhjsf

2.3 Formulación de los objetivos

a. Objetivo general
Determinar la integridad de la membrana espermática utilizando dos pruebas: Host y tinción Hoechst 33342/PI en
semen de alpacas.
b. Objetivos específicos
  Determinar la integridad de la membrana espermática utilizando la prueba de host en semen fresco,
refrigerado y congelado.

 Determinar la integridad de la membrana espermática utilizando la tinción Hoesch 33342/PI en semen fresco,
refrigerado y post descongelado.

 Determinar el efecto de cambio de temperatura en la integridad de membrana espermática.

2.4 Marco teórico

2.4.1 CAMELIDOS SUDAMERICANOS
Los Camélidos Sudamericanos (CSA) resisten ambientes adversos como el del Altiplano andino, donde no es posible
la producción económica de otras especies de animales domésticos. La producción de CSA es el principal medio de
subsistencia de las comunidades campesinas que habitan en esas zonas. Pertenecen a la Familia Camelidae y forman
los géneros Lama y Vicugna. Presentan particularidades anatómicas y fisiológicas probablemente relacionadas con
su adaptación a las condiciones de escasez de oxígeno y de forrajes de las grandes alturas en las que habitan
(Wheeler, J.C. 1991).

2.4.2 POBLACIÓN ESTIMADA DE CAMELIDOS SUDAMERICANOS PAÍSES ANDINOS (NÚMERO ESTIMADO)

2.4.3 RAZAS DE ALPACAS
2.4.3.1 Huacaya
Son animales que a nivel de Perú se encuentran en mayor proporción superando el 85% de la población nacional.
Presentan un fenotipo característico de mayor fortaleza frente a la otra raza.
2.4.3.2 Características:
Presentan contornos, curvos y armoniosos.
Su apariencia es el de ser corpulento y de mayor talla que la Suri.
La superficie externa de su fibra es áspera, opaca y esponjoso por la disposición de sus mechas.
Las fibras y mechas se disponen perpendicularmente a la superficie de su cuerpo.
Presencia de rizos a lo largo de la extensión de la mancha.
La cara interna de su fibra es suave y brilloso.
La línea superior del dorso, están muy bien cubiertos y esponjosos de manera que los hacen muy resistentes a las
condiciones climáticas y la altitud.
2.4.3.2 Suri
 Son animales que se encuentran en vías de extinción, su población es menos de 5% de la población nacional, su
característica fenotípica es que presenta una belleza de la naturaleza alto andina, sobre todo, cuando tiene un
crecimiento de fibra de 3 años.
2.4.3.2.1 Características:
Son de contornos lineales, angulosos y armoniosos.
Su apariencia es de ser menos corpulento y de menor talla que el Huacaya por la forma y disposición de sus
mechas.
La superficie externa de su fibra es suave y resbaladiza.
Las fibras y mechas del Suri crecen y se mantienen paralela a la superficie de su cuerpo.
Las mechas presentan ondulaciones suaves y largas, desde la nariz hasta el primer tercio (1/3), para luego hasta la
punta de la mecha formar rulos colgantes a ambos lados del cuerpo y también a nivel del copete.
Las mechas no presentan rizos.
La cara de su fibra es bien lustroso, brilloso y resbaladiza.
La línea superior del dorso (lomo), esta descubierto y como tal es susceptibles a enfermar por las condiciones
climáticas y a la altitud.

2.4.4 HÁBITAT
El Hábitat de los camélidos sudamericanos en general, está constituido principalmente por las formaciones ecológicas
de Puna y Altos Andes que se distribuyen desde el Norte del Perú hasta el Norte de Argentina, incluyendo las
respectivas áreas alto andinas de Bolivia y Chile; teniendo como características generales de ser más húmeda hacia el
Norte donde se continúa hacia el Páramo, y más seca hacia el Sur .La altitud de las Punas oscila entre los 3,800 y
4,500 m.s.n.m. con una temperatura promedio de 6ºC a 8ºC y 400 y 700 mm de precipitación (Wheeler, J.C. 1991).
 En general, los camélidos pueden vivir desde el nivel del mar hasta más de 5,000 m. de altitud. La Alpaca puede vivir
alrededor de las zonas húmedas; la Vicuña en cambio prefiere las praderas altas y la Llama habita en todos los niveles
prefiriendo los lugares secos (Wheeler, J.C. 1991).

2.4.5 REPRODUCCIÓN
Debe usarse durante el empadre machos de edad similar, no debe existir variaciones de edad por que causan riñas y
como consecuencia estrés, tención y dominio de los mayores.
Machos 2.3 años.
Hembras 2-10 años se ha demostrado que con buena alimentación se puede lograr reproducir a un 1 año de edad.
Las hembras tienen ovulación inducida, con una gestación de aproximadamente 11, 5 meses y placenta de tipo difuso.
El macho, por su parte, puede copular por 5 a 50 minutos, depositando semen en los cuernos uterinos. Su semen es
viscoso, lo que impide la evaluación rápida (Wheeler, J.C. 1991).

2.4.6 PROBLEMÁTICA DE LA FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA.

La fisiología reproductiva de las alpacas difiere de la de otros animales domésticos y queda pobremente entendida, por
ello se busca establecer tecnologías para el manejo y preservación de sus gametos.
Poseen una estacionalidad reproductiva, incluyendo el apareamiento y el parto los cuales se producen durante los
meses de Diciembre a Marzo, coincidiendo con los periodos de lluvias abundantes y presencia de forraje.
Las técnicas de reproducción asistida como la crio preservación de gametos y embriones son una herramienta clave
para el manejo sostenible y estudio a nivel molecular del comportamiento de éstas células, con la finalidad de la
producción, manejo y mejoramiento de esta especie (Smith et al., 1994).
En los últimos años se ha venido realizando trabajos sobre el manejo de semen para su preservación, pero las
características que presenta este tipo de muestra son muy desalentadoras, ya que la técnica de extracción seminal no ha
 sido estandarizada y sólo se obtienen eyaculados con bajo volumen, alta viscosidad y una baja concentración de
espermatozoides. Una alternativa que se ha presentado es el uso de espermatozoides del epidídimo ya que estos
espermatozoides se encuentran en un nivel de maduración notable y su manejo en el laboratorio es muy satisfactorio.
(Smith et al., 1994).
El uso de estos espermatozoides es principalmente para establecer un protocolo de preservación que sea manejable y el
cual permita la obtención de espermatozoides post descongelamiento que presenten una alta tasa de fecundación
(Smith et al., 1994).

2.4.7 ANATOMÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA MACHO.

2.4.7.1 Testículos.
Son órganos pares, de forma ovoide redondeada. Se encuentran en las bolsas escrotales localizadas en la región
perineal, en posición similar a la del cerdo (Bravo et al, 2000), ambos testículos tienen el mismo tamaño.
En la alpaca adulta, el peso promedio es de 18 gramos y mide de 3,5 a 4,5 cm de largo por 2 a 3 cm de ancho. En
alpacas y llamas es frecuente el descenso incompleto del testículo, anormalidad conocida como criptorquidismo y
puede ser unilateral o bilateral. En otras especies, este defecto es considerado hereditario, debido a genes recesivos. Si
en el momento del nacimiento los testículos no están en el escroto, el descenso puede ocurrir posteriormente, ya sea en
forma parcial o completa. Sin embargo, el descenso lento debe ser considerado una anormalidad, que es
probablemente una variación de la expresión de los mismos factores que determinan fallas en el descenso. Los machos
con criptorquidismo bilateral son estériles, pero la mayoría muestra deseo sexual y los efectos unilaterales; su conducta
sexual y producción de semen es normal. Estos animales no deben ser usados para la reproducción, debido a la
naturaleza hereditaria del defecto (Huanca, 1996).
2.4.7.2 Epidídimo y conducto deferente.
 Macroscópicamente, el epidídimo presenta tres porciones bien diferenciadas: la cabeza, relativamente voluminosa, que
se inserta en la parte posterior del testículo; la porción intermedia, de forma aplanada, y la cola o porción terminal. La
parte posterior, próxima a la uretra, muestra cierto engrosamiento. La longitud total del conducto es de 40 cm y su
diámetro cerca de 174 a 237 micrómetros (Bravo et al., 2002).
2.4.7.3 Glándulas sexuales accesorias.
En alpacas y llamas, se ha descrito dos glándulas: la próstata y las glándulas bulbouretrales. La próstata está ubicada
dorsalmente sobre el cuello de la vejiga. Consta de un cuerpo con dos lóbulos unidos entre sí, que están próximos al
primer segmento de la uretra; presenta, adicionalmente, una porción diseminada que penetra en el músculo uretral. Las
glándulas bulbouretrales son pares, de forma ovoide. Están ubicadas a 7 cm u 8 cm de la próstata y lateralmente a la
uretra, en la salida pélvica. Cada glándula tiene un promedio de 1 cm de diámetro. En alpacas y llamas, no existen
glándulas vesiculares (Bravo et al., 2000).

2.4.8 FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LA ALPACA MACHO.

2.4.8.1 Pubertad.
Se define como la edad en la que se inicia la espermatogénesis o cuando se encuentran espermatozoides en el
eyaculado. Los niveles de testosterona sérica a los 9 a 11meses se logran valores alrededor de 60 a 90 picogramos/ml
(Bravo et al, 2002), esto revela que a esta edad se inicia la pubertad, asimismo, estudios demuestran la correlación con
el peso corporal que alcanza el animal, así se ha visto la presentación de libido sexual en algunos machos de un año de
edad (Fernández-Baca et al., 1971).
La alpaca inicia su vida reproductiva plena con la desaparición de la adherencia pene - prepucio, ya que esta condición
es una limitante, esto se logra a los tres años en su totalidad.
2.4.8.2 Espermatogénesis.
 La regulación hormonal para la producción de espermatozoides está dada por GnRH que estimula la adenohipófisis
que libera la LH, que en las células testiculares intersticiales provoca la producción de andrógenos. También es
liberada FSH (Hormona Folículo estimulante), cuyo blanco de acción celular son las células de Sertoli con la
consecuente producción de ABP y andrógenos que ayudan en la formación y la maduración espermática (Bravo et al.,
2002).
Las colonias celulares a partir de la pubertad son los espermatogonio tipo A1 los cuales tras una división progresiva
dan lugar las de tipo A2, A3 y A4. Estos últimos dan lugar a los de tipo intermedio (In), que tras una división se
convierten en los de tipo B y a su vez se dividen y originan a los espermatocitos tanto primarios y secundarios que al
dividirse se convierten esta vez en células haploides llamándose espermátides.
Desde aquí la metamorfosis espermática es muy marcada observándose hasta cuatro etapas en los cuales se producen
cambios como la condensación de los gránulos celulares, formación del axonema, encasquetamiento celular para la
formación del acrosoma, orientación de la cola hacia la luz tubular del conducto seminífero; la última etapa de la
formación del espermatozoide es la modelación de la morfología espermática propia de cada especie, se puede decir
que este proceso es común a todas las especies (Bravo et al., 2002).
El proceso descrito se denomina ciclo epitelial del túbulo seminífero y su etapas varían ligeramente según especie, así
se habla de los camélidos sudamericanos la ocurrencia de 8 etapas divididas en 4 estadios A con etapas del 1 al 4 y 4
estadios B con etapas del 5 al 8, los cuales abarcan entre espermatogonios, espermatocitos y espermátides. La primera
parte del ciclo (etapas del 1 a 4) generan hasta 54.6% de los espermátides (Bravo et al., 2002).
La última etapa testicular es la liberación del espermatozoide y su consiguiente almacenamiento y maduración en los
depósitos epididimarios conocido como espermiación.
2.4.9. EL ESPERMATOZOIDE DE ALPACA
Los espermatozoides son células haploides que tienen la mitad de los cromosomas que una célula somática. Se
originan inicialmente a partir de las espermatogonias, que son las primeras células germinativas del testículo adulto y
están localizadas en la membrana basal del epitelio seminífero. Después de varias mitosis dan origen a los
espermatocitos, que son células que entran en meiosis.
Los espermatozoides maduros son células alargadas consistentes en una cabeza aplanada portadora del núcleo y una
cola que contiene el aparato necesario para la movilidad celular. El espermatozoide entero está cubierto por la
membrana plasmática. Durante la maduración final del espermatozoide en el epidídimo los espermatozoides
experimentan cambios en su maduración, que se presentan durante 10 a 15 días a través de su paso por el epidídimo
donde se llevan a cabo los cambios metabólicos y estructurales, siendo principalmente la cola del epidídimo su lugar
de depósito natural. En este sitio se concentran, debido a la enorme resorción del líquido testicular, y se ha calculado la
relación espermatozoide / plasma que es de 1:1 en la cabeza del epidídimo y en la región de la cola es de 70: 1. Uno de
los cambios más notorios del espermatozoide durante la maduración epididimaria es el desarrollo de la movilidad
espermática, la inhabilitación del espermatozoide para moverse es debida al menos en parte a la inmadurez de la
membrana plasmática del espermatozoide.
En la biotecnología reproductiva, uno de los principales objetivos es contar con machos de fertilidad comprobada,
mediante la evaluación de su calidad espermática. La morfología espermática es una característica útil para predecir la
capacidad fecundante, basándose en las formas y medidas de las estructuras corporales espermáticas para poder
clasificarlas, permitiendo detectar anormalidades en la cabeza, pieza intermedia y cola, defectos acrosomales
específicos o variaciones del tamaño de las cabezas.20
La capacitación es un proceso del espermatozoide que comprende una serie de cambios previos a la fecundación, se
desarrolla en el aparato reproductor femenino en vertebrados de fecundación interna, y requiere de la comunicación
entre el espermatozoide y los ambientes que recorre en su tránsito hacia el sitio de fertilización. 21Durante la
capacitación el espermatozoide experimenta muchos cambios físicos así como cambios en la composición lipídica de
su membrana plasmática siendo el más importante la disminución de la relación colesterol: fosfolípidos afectando la
permeabilidad de la membrana; el colesterol es el esteroide presente en mayor concentración en el eyaculado con un
 conocido efecto estabilizador sobre las membranas celulares, este elemento es desprendido de la membrana plasmática
por acción de las lipoproteínas de alta densidad presentes en las secreciones del tracto reproductor femenino.22
2.4.9.1. Estructura del espermatozoide de alpaca
El espermatozoide de los mamíferos consta de 3 regiones; cabeza, cuello y flagelo en el cual se encuentran la pieza
intermedia, pieza principal y pieza terminal. Desde el punto de vista funcional, es un transportador de la información
genética. Por ello, debemos destacar la presencia de un núcleo muy condensado, una membrana plasmática muy
sensible a los cambios térmicos y osmóticos.
2.4.9.2. Cabeza espermática
La cabeza del espermatozoide es aplanada y está formada por el núcleo, el acrosoma, estructuras del citoesqueleto y
una pequeña cantidad de citoplasma. El núcleo está constituido por cromatina altamente condensada, el acrosoma, el
segmento ecuatorial y la fosa de implantación.
La Cromatina se encuentra compactada mediante proteínas específicas (protaminas) que se unen entre sí mediante
puentes disulfuro.
El acrosoma se localiza en la porción anterior del núcleo y es una vesícula especializada que contienen enzimas
hidrolíticas, necesarias para la penetración de la zona pelúcida del ovocito en la fecundación. Este orgánulo se forma
durante la espermatogénesis (espermatohistogénesis) a partir del complejo de Golgi de las espermáticas. En el
acrosoma distinguimos la membrana acrosomal interna y la membrana acrosomal externa (próxima a la cara interna de
la membrana plasmática). Durante el proceso de reacción acrosómica, la membrana acrosomal y la membrana
plasmática se fusionan liberando al exterior el contenido acrosomal. Dicho contenido está constituido
mayoritariamente por enzimas hidrolíticas, siendo desde el punto de vista funcional, las principales la acrosina y la
hialuronidasa, (necesarias para denudar las capas que rodean al ovocito).
La acrosina es una proteasa que está presente en el acrosoma en forma de proacrosina, la cual es convertida a su forma
activa durante la reacción acrosómica. Esta proteína se diferencia de las enzimas similares de otros tejidos en el peso
molecular y en el sustrato, indicando que se trata de una isoenzima específica del espermatozoide. Por su parte, la
hialuronidasa es una glicosidasa y parece ser una enzima específica del espermatozoide ya que es diferente de la forma
común de la hialuronidasa lisosomal de las células somáticas.23

Figura 1. Vista dorsal de la cabeza de espermatozoide.24

Los daños en la membrana plasmática o del acrosoma son irreversibles y puede originarse por diversas causas entre las
que se encuentran cambios osmóticos, shock térmico o cambios de pH. Estos cambios pueden causar una perdida
prematura del contenido acrosómico. El segmento ecuatorial es una invaginación de la membrana plasmática del
espermatozoide localizada en la porción media de la cabeza. Su función con la membrana plasmática del Ovocito es
fundamental para la fecundación.23
 Figura 2. Estructura del espermatozoide de mamífero.24
2.4.9.3. El cuello del espermatozoide
El Cuello es la unión entre la cabeza y la pieza intermedia. Está constituido por el capítulo, mitocondrias, el centriolo
proximal y una serie de columnas laminadas que proporcionan gran flexibilidad al espermatozoide para moverse
lateralmente durante la batida flagelar. Estas estructuras están alineadas con el centriolo, estructura desde la que se
originan las fibras y microtúbulos de la cola y sirve como centro organizativo en la formación del axonema y las
columnas estriadas. Sin embargo, la presencia del centriolo no es necesaria para la iniciación o propagación del
movimiento ondulatorio de la cola.23
2.4.9.4. El flagelo del espermatozoide
El flagelo es el responsable del movimiento y lo constituyen tres regiones: la pieza intermedia, la pieza principal y la
pieza terminal. El flagelo está constituido en su totalidad por el “axonema” que es la estructura que le confiere el
 movimiento. El axonema está formado por una serie de microtúbulos agrupados en dobletes y se distribuyen en uno
central y nueve periféricos.25
Pieza intermedia se caracteriza por la presencia de una doble hélice de mitocondrias. Estas Organelas, además de ser
las responsables del metabolismo energético y de la regulación de muerte celular, se comprobaron recientemente que
son la mayor fuente intracelular de especies reactivas de oxígeno. Las mitocondrias se disponen alrededor de nueve
pares de fibras longitudinales denominadas “fibras densas”, que rodean al axonema. La pieza intermedia queda
limitada caudalmente por el anulus que es la zona donde la membrana plasmática se condensa.
La pieza principal constituye la porción mayor de la cola .está formada por las nueve fibras densas y el axonema que
se continúan desde la zona intermedia. Las fibras van reduciendo su tamaño hasta desaparecer al final de la pieza
principal.
La pieza terminal constituye la pieza final de la cola, y está formada por el axonema, sin vaina fibrosa.25
2.4.10. Viabilidad espermática
La integridad de la membrana plasmática y acrosomal reflejan la viabilidad espermática, y el proceso de
criopreservación podría afectar estas membranas ocasionando daños como hinchamiento y disrupción de las mismas,
cambios en la fluidez, alteración del flujo de calcio y cambios en la actividad enzimática que pueden inducir una
capacitación espermática anticipada, viéndose afectada la fertilidad.26
El estudio de la viabilidad espermática normalmente se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática
de los espermatozoides, mediante el uso de dos fluorocromos combinados: uno de ellos sólo es capaz de atravesar las
membranas plasmáticas dañadas o degeneradas, y por tanto permite identificar a las células muertas o en proceso de
degeneración, mientras que el otro es capaz de atravesar membranas celulares intactas y por tanto permite identificar la
población de células viables.27
La evaluación de la viabilidad espermática es importante sobre todo cuando se trabaja con muestras seminales que van
ser sometidas a procesos de manipulación, tales como la capacitación espermática in vitro, procedimientos de sexado
 espermático y procedimientos de criopreservación en pajillas, ya que todos ellos ocasionan efectos negativos o de
estrés en la estructura celular, como ejemplo, los procedimientos de capacitación buscan alterar la composición de la
membrana plasmática para permitir el ingreso de iones de calcio y ocasionar cambios de pH interno además del
incremento del metabolismo celular.
Respecto a la viabilidad espermática o capacidad fecundante, se toma la motilidad espermática progresiva como la
principal característica al momento de efectuar dicho análisis, sin embargo ésta se emplea erróneamente para
determinarla, porque esta es el resultado de procesos complejos, y depende de otras características además de la propia
motilidad del espermatozoide, entre los que se puede mencionar: presencia de acrosoma intacto, integridad de ADN
espermático, integridad de la membrana plasmática, por citar algunas de estas.
Las características generales que son tomadas en cuenta para efectuar la evaluación de la viabilidad y calidad
espermática en esta investigación son la vitalidad o proporción de espermatozoides vivos y muertos, motilidad
progresiva individual, funcionalidad de membrana plasmática e integridad acrosómica; la razón por la cual fueron
considerados y se detallan a continuación.4

2.4.11. Acrosoma
El acrosoma es una organela membranosa de doble capa ubicada en la parte apical de la cabeza espermática, que
contiene distintas enzimas hidrolíticas, como la hialuronidasa y la acrosina.28
La formación de este organelo, a partir del aparato de Golgi, es un proceso altamente sincronizado y bastante lento en
comparación con la biogénesis de otras vesículas secretoras y, en mamíferos, está asociada con la diferenciación de
espermátidas durante la espermatogénesis.29
Este orgánulo contiene los enzimas que permiten al espermatozoide atravesar las envolturas que recubren al ovocito.
Dichos enzimas se liberan al exterior mediante un proceso de exocitosis denominado Reacción Acrosómica. Un nuevo
parámetro, empleado para la evaluación morfológica del eyaculado consiste en la descripción de la secuencia de
 alteraciones que presenta el acrosoma del espermatozoide del toro con el transcurso del tiempo. A partir de aquí, la
integridad del acrosoma se ha utilizado como prueba de evaluación de la calidad seminal en la mayoría de las especies
de animales mamíferos. El acrosoma juega un papel fundamental en la fecundación. En el acrosoma se puede
distinguir tres regiones claramente diferenciadas: la zona acrosomal con su borde apical, la zona post acrosomal y el
segmento ecuatorial entre ambas, los mismos que tienden a romperse en el proceso de refrigeración, congelación y
descongelamiento. Muestras seminales con alta proporción de alteraciones acrosomales suelen tener una fertilidad
baja.
La reactividad de la membrana acrosomal representa un requisito absoluto para la fertilización y sólo los
espermatozoides que pueden realizar la reacción acrosomal de manera sincronizada con la fase de penetración del
oocito, tienen la habilidad de pasar a través de la zona pelúcida y, como consecuencia, fusionarse con este para formar
un embrión.7

2.4.12. Membrana plasmática del espermatozoide

Todo el espermatozoide está contenido en la membrana plasmática, la cual se ensancha en áreas especializadas y
forma el componente más externo del espermatozoide. Permanece intacta, excepto en la región del acrosoma previo a
la fertilización o como resultado de la muerte del espermatozoide.
Estructuralmente se compone de tres capas o zonas: bicapa lipídica, interfase fosfolípidos-agua y glycocalix. La bicapa
lipídica esta subdividida en fosfolípidos polares, que se orientan de tal forma que los grupos de cabezas polares
hidrofílicas están situadas externamente y las cadenas de ácidos grasos orientadas internamente unas a otras. La
mayoría de los lípidos presentes son fosfolípidos y colesterol, en una razón de 0.64:0.36. La cantidad de colesterol,
relativo al fosfolípido, determina la fluidez de la membrana. En general mientras más alta la concentración relativa de
los fosfolípidos, más fluida es la membrana. El colesterol, por lo tanto, actúa junto con proteínas integrales, como un
 estabilizador asegurando una configuración laminar de los fosfolípidos y de la bicapa. Es sabido que la concentración
de colesterol varía entre las zonas de la membrana plasmática, siendo más alta en la región del acrosoma.
El glycocalix es una capa externa de polisacáridos del espermatozoide de alpaca. Su función exacta no es clara, pero se
piensa que está involucrado en antigenicidad, adherencia celular y permeabilidad específica. Es sabido que dentro del
glycocalix existen uniones para proteínas periféricas. Estas proteínas son provenientes del plasma seminal y actúan
estabilizando al espermatozoide durante su paso por el tracto masculino y femenino. También pueden estar
involucradas en la capacitación.36
2.4.12.1. La integridad de membrana espermática
La integridad de la membrana espermática es un pre-requisito fundamental para el apropiado metabolismo y funciones
espermáticas como la unión a la zona pelúcida, penetración y la fusión con el oolemma durante la fecundación. El
grado de lesión de las membranas plasmática y acrosomal está relacionado con la fertilidad de la muestra procesada,
pero solamente en los casos en que el daño sea extenso.37
La integridad de esta membrana es el requerimiento mínimo para que el espermatozoide sea móvil. El espermatozoide
con la membrana plasmática afectada no es capaz de mantener las concentraciones citoplasmáticas de iones y de
cofactores esenciales como el nucleótido adenina, imprescindible para el movimiento flagelar. Es posible que algunas
células inmóviles puedan aparentemente mantener algún grado de integridad de la membrana por lo cual, son todavía
capaces de excluir los marcadores que indican la muerte celular pese a que otras alteraciones hacen que este inmóvil.
Por estos motivos, cuando la célula esta fluorescente pude ser calificada con toda seguridad como célula muerta; sin
embargo, cuando la célula no adquiere fluorecencia se califica como célula viva aunque esto no es tan seguro.38
Una de las técnicas de valoración de la integridad de la membrana plasmática es la usencia de inclusión de colorantes,
porque la membrana esta íntegra; estas técnicas son conocidas como recuentos de vivos y muertos y para ellas se
necesitan combinaciones de colorantes como eosina/nigrosina/guiemsa, Hoescht 33342/Yoduro de Propidium y
SYBR-14/Yoduro de Propidium.39
2.4.12.2. Funcionalidad de membrana plasmática
La funcionalidad de la membrana plasmática ha sido utilizada para valorar la viabilidad y calidad seminal, por ser
responsable de hacer efectiva la interacción celular y participar en su metabolismo; sin embargo no solo es importante
para efectuar el metabolismo espermático, sino que un correcto cambio en las propiedades físicas de la membranas
celulares es necesario para que se de la unión entre el espermatozoide y el Ovocito.
La propiedad de la membrana celular permite el transporte selectivo de moléculas entre el líquido intracelular y líquido
extracelular; en ese sentido cuando una célula es sometida a condiciones de medio hipo-osmótico el agua ingresa al
interior de esta con el fin de lograr el equilibrio entre el medio interno y externo, lo que se denomina equilibrio
osmótico. Los espermatozoides que han sido sometidos a un medio hipo-osmótico presentan un cambio en la
morfología celular expresada en un hinchamiento del flagelo celular.4
2.4.12.3. Técnicas para la evaluación de la integridad de membrana espermática
2.4.12.3.1. Tinción de Hoechst 33342/Ioduro de Propidio
Para el examen de la integridad de la membrana plasmática se utiliza una doble tinción fluorescente con Hoechst
33342/PI o SYBR14/PI.
El colorante Hoechst 33342 penetra las membranas plasmáticas y se adhiere específicamente al ADN. Todos los
espermios son marcados de azul. El colorante PI (yoduro de propidio) sólo penetra las membranas dañadas. Se
sobrepone al colorante Azul Hoechst. Los espermios con membranas dañadas se tiñen de color rojo/ violeta. Sobre esta
base, AndroVision® determina el porcentaje de espermios con membranas defectuosas o intactas. Para el examen de
integridad de acrosomas se utiliza una doble tinción de fluorescencia con H33342/FITC-PNA. Todos los espermios
son teñidos de azul (H33342). Acrosomas dañados de estas células se tiñen de verde (FITC-PNA).40
Uno de los fluorocromos más utilizados para identificar células muertas es el ioduro de propidio. Este compuesto entra
en espermatozoides con la membrana plasmática dañada, se une al núcleo y, al ser excitado por la longitud de onda
apropiada (510-560 nm), emite fluorescencia roja. Además del ioduro de propidio, existen otros marcadores
 fluorescentes específicos para células muertas cuyo mecanismo de acción es similar, como por ejemplo, el Hoechst
33258.41
Un fluorocromo con un mecanismo de acción similar al del SYBR-14, capaz de identificar espermatozoides vivos, es
el Hoechst 33342. Este compuesto también entra en células vivas y se une al ADN espermático, sin embargo, su uso
está limitado por la longitud de onda de su espectro de excitación, que está en el rango UV. La mayoría de los
citómetros disponen de un láser con una longitud de onda de 488 nm, y para evaluar las muestras marcadas con
Hoechst 33342, es preciso disponer de un láser de menor longitud de onda.41
Los espermatozoides bovinos se tiñeron con Hoechst 33342. La distribución de fluorescencia de los espermatozoides
teñidos era compleja. Los espermatozoides no móviles mostraron una fluorescencia más alta que los espermatozoides
móviles. El perfil de fluorescencia de los espermatozoides móviles fue bimodal.42

2.4.13. Androvisión sistema CASA (Análisis de esperma asistido por computadora) para uso en fluorecencia
AndroVision® es un Sistema CASA de alta precisión para el análisis estandarizado e interactivo de semen.
AndroVision® no sólo ofrece el análisis automático clásico de motilidad, concentración y morfología, sino también
diversas opciones de análisis de la funcionalidad espermática basados en tinción de fluorescencia. El módulo básico
con PC y accesorios se complementa con módulos opcionales de software.
AndroVision® se puede combinar con una serie de microscopios, preferiblemente; Zeiss AxioLab y AxioScope, Cada
microscopio necesita objetivo negativo contraste de fase y mesa calefactada. Para los módulos de Viabilidad,
Integridad de Acrosoma, Actividad Mitocondrial e Integridad de ADN se necesita un equipo de fluorescencia.
Las muestras teñidas con los colorantes específicos de fluorescencia emiten luz de una longitud de onda o de un color
específico. Los colorantes son activados por una luz con una longitud de onda específica. Los colorantes tiñen
estructuras específicas del espermatozoide, dependiendo de la integridad y el estado funcional de las mismas.
 Los diferentes colores son detectados y evaluados por el software AndroVision®. Debido a la rapidez del análisis,
pueden evaluarse cientos de espermios en muy corto tiempo. Puede valuar tinciones fluorescentes para determinar la
viabilidad, integridad de acrosomas, actividad mitocondrial e integridad del ADN espermático.

2.4.14. EVALUACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES.

El éxito de las inseminaciones artificiales y los procesos de fertilización in vitro tienen enormes repercusiones tanto
económicas como biológicas y depende tanto de la calidad como de la cantidad de espermatozoides depositados en el
tracto reproductivo de la hembra.
La estimación de la calidad o de la evaluación de espermatozoides requiere la contrastación y correlación con datos de
viabilidad, parámetros de motilidad espermática, morfología celular y grado de integridad celular (especialmente del
acrosoma) (Bravo et al., 2002).
El desarrollo de pruebas de laboratorio que puedan anticipar de forma precisa el poder fecundante de los
espermatozoides en las especies domésticas y salvajes ha sido un gran reto para los investigadores dedicados a las
tecnologías reproductivas. La evaluación de los parámetros fisiológicos y morfológicos que presentan los
espermatozoides es fundamental, ya que proporciona criterios sobre el destino de las muestras, su forma de
conservación y su forma de aplicación. Hoy en día no existe un método universal que pueda predecir la fertilidad de las
muestras de espermatozoides (Bravo et al., 2002).

2.4.15. CARACTERÍSTICAS SEMINALES DE LA ALPACA.

2.4.15.1. Macroscópicas.
 Las características macroscópicas del semen de camélidos sudamericanos, entre las cuales se consideran, color,
volumen, filancia, y pH. Estas características del eyaculado dependerán del tipo de colección y de la manipulación,
así como de las características (Bravo et al., 2000).
Color. Observado directamente a través del tubo Falcón, la gama de colores normales que se tiene que observar es
entre blanco claro o blanco cremoso según la concentración que tenga (Bravo et al., 2000).
Volumen. Se observa en el mismo tubo graduado que puede ser de 1 a 10 ml dando un promedio de 3.5 (Bravo et al.,
2000).

2.4.15.2. Microscópicas.
Las características microscópicas más importantes que se evalúan en el semen son concentración, motilidad, vitalidad
y porcentaje de anormalidades.
Motilidad espermática. La movilidad espermática se considera el primer parámetro de calidad ya que el transporte
espermático en el tracto femenino y la capacidad de penetración del ovocito, dependen en gran medida de este
parámetro. Sin embargo, la movilidad no es sinónimo de capacidad fecundante ya que refleja únicamente una de las
funciones del espermatozoide, que es la actividad flagelar, mientras que otras estructuras espermáticas (acrosoma,
membrana espermática) también intervienen en el proceso de la fertilización. Por tanto, a pesar de ser indispensable
para la fertilización, no pronostica de forma precisa la capacidad fecundante del espermatozoide, debido
fundamentalmente a la valoración subjetiva de dicho parámetro, por lo que su correlación con la fertilidad oscila
entre valores que van de 0 a 0,6 (Bravo et al., 2002).
Vitalidad. Es el porcentaje de espermatozoides vivos
2.4.16. TEST DE ENDOSMOSIS
La evaluación convencional del semen en las diferentes especies incluye diversos parámetros macroscópicos
(volumen, color) y microscópicos (concentración, motilidad y viabilidad). Pero los valores obtenidos a partir de
un espermatograma básico no son indicadores de fertilidad, sino que son indicadores de la funcionalidad del
macho, así como de su ciclo hormonal y espermatogénico (Calamera, 2004). Sin embargo, la mayoría de estudios
realizados en nuestro medio orientados al manejo y conservación de espermatozoides en animales domésticos
incluyen limitados parámetros de referencia. No obstante, existen técnicas especializadas diseñadas con la
finalidad de estimar la potencial capacidad fecundante de una muestra de espermatozoides. En ese sentido, la
evaluación de la integridad funcional y estructural de la membrana plasmática, así como de la integridad
acrosomal puede representar indicadores de la funcionalidad de los espermatozoides ovinos. De esta manera,
Didion y Graves (1986) diseñaron la técnica de doble tinción que permite evaluar en simultáneo la viabilidad
espermática con la integridad acrosomal para diferentes especies domésticas, entre ellas el ovino. Por otro lado, se
ha desarrollado una técnica (prueba hipo osmótica) para evaluar la integridad funcional de la membrana
plasmática en espermatozoides humanos (Jeyendran et al., 1984), la cual ha sido relacionada.
El test hipo osmótico (HOST) es una prueba funcional, donde los espermatozoides vivos son sometidos a
incubación en solución hipo osmótica, los espermatozoides con membrana funcional permiten el ingreso de agua
por osmosis, lo cual seevidenciará por hinchamiento y enrollamiento de la cola (endosmosis) (Jeyendran et al.,
1984). El proceso de fecundación no puede ser atribuido solamente al número de espermatozoides vivos, mótiles y
normales depositados dentro de la hembra sino especialmente a su funcionalidad (Petrunkina et al., 2007).
Estudios previos indican que espermatozoides de alpaca colectados del epidídimo sometidos al test hipo osmótico
a una osmolaridad de 100 mOsmol, obtienen una respuesta de 89.08% (Rodríguez, 2009), evidenciando una
mayor respuesta en espermatozoides libres de plasma seminal. En semen de alpaca obtenido por electro
eyaculación el rango de porcentaje de endosmosis utilizando solución hipo osmótica de 100mOsmol es de 20 a 62
% (Giuliano et al., 2010), mientras que en semen entero de alpacas utilizando solución hipo osmótica de 150
 mOsmol el porcentaje obtenido fue de 23.5 % (Pacheco et al., 2011). En eyaculados de llamas obtenidas por
vagina artificial, y sometidos a dicha prueba, se han observado porcentajes de endosmosis del 40 % utilizando una
solución de 100 mOsmol (Giuliano et al., 2007). Otros reportes en llamas indican 33.48 % en semen colectado por
electro eyaculación y 30.15 % en semen colectado por vagina artificial usando solución hipo osmótica ajustada a
50 mOsmol (Giuliano et al.2008).
2.4.17. TINCIÓN HOESCHST.

El Hoechst es un colorante fluorescente de ADN empleado en la microscopía de fluorescencia y en la separación celular por
citometría de flujo (FACS). Por su capacidad de tinción de ADN, también se emplea para visualizar núcleos y mitocondrias.
Se emplean habitualmente dos bisbenzimidazoles muy relacionados: Hoechst 33258 y Hoechst 33342.1 Ambos colorantes
son excitados por luz ultravioleta con una longitud de onda cercana a los 350 nm y emiten fluorescencia azul/cían con un
máximo de emisión de alrededor de 461 nm.

El Hoechst puede usarse tanto en células vivas como fijadas, y se emplean a menudo en sustitución de otro tinte de ácidos
nucleicos: el DAPI. Se diferencian de éste en el grupo etilo adicional del Hoechst 33342, que le da un comportamiento más
lipófilo, por lo que puede atravesar más fácilmente la membrana celular.

2.4.17.1. Características de la mancha fluorescente Hoechst 33342.

 Tinción fluorescente de colorante azul Hoechst específica para ADN (es decir, núcleos de células eucariotas)
 Proporcionado convenientemente como una solución de colorante Hoechst fácil de usar (20 mM)
 El colorante celular permeable a las células es eficaz para la tinción de células fijas y células vivas
 Counterstain: ideal para usar junto con la detección de dianas específicas con anticuerpos fluorescentes para microscopía
de fluorescencia o detección de alto contenido (HCS)

Hoechst 33342 (2 '- [4-etoxifenil] -5- [4-metil-1-piperazinil] -2,5'-bi-1H-bencimidazol trihidrocloruro trihidratado) es una
tinción de ADN permeable a las células que se excita con luz ultravioleta y emite fluorescencia azul a 460 a 490 nm.
 Hoechst 33342 se une preferentemente a las regiones adenina-timina (A-T) del ADN. Esta tinción se une al surco menor del
ADN y muestra distintos espectros de emisión de fluorescencia que dependen de las relaciones del colorante: par de bases.

2.4.17.2. Propiedades del tinte fluorescente Hoechst

Como colorante de contraste en las imágenes fluorescentes, el colorante Hoechst es compatible con anticuerpos y otras
sondas marcadas con fluoresceína y colorantes de rodamina, así como con Thermo Scientific DyLight Fluors. La solución
madre acuosa estable 20 mM está esencialmente lista para usar.

Hoechst 33342 se utiliza para teñir específicamente los núcleos de células y tejidos vivos o fijos. Esta tinción se usa
comúnmente en combinación con la marcación 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) para distinguir la cromatina compacta de
los núcleos apoptóticos, para identificar las células replicantes y para clasificar las células en función de su contenido de
ADN. Hoechst 33342 y el yoduro de propidio se utilizan con frecuencia conjuntamente para el análisis simultáneo de
imágenes de fluorescencia y citometría de flujo de las etapas de la apoptosis y la distribución del ciclo celular.

2.5. Hipótesis

3. METODOLOGÍA

3.1 Variables
Variable independiente:
 Semen Fresco
 Semen Refrigerado
 Semen Congelado
 Variable dependiente:
 Integridad de membrana espermática
3.2 Indicadores
 Respuesta positiva a la prueba de host
 Viabilidad espermática con tinción hoechst

3.3 Método procedimental

3.3.1. Definición de la población y tamaño de muestra

a) Población
Plantel de reproductores de alpacas macho del INIA – Ayacucho
b) Muestra
30 muestras de semen de alpaca colectada por vagina artificial, a partir de 7 machos.
3.4. Métodos y procedimientos para la recolección de datos
3.4.1. Lugar de ejecución
El trabajo se realizará en la Estación Experimental Agraria “Canaán”, del INIA- Ayacucho, Laboratorio de Biotecnología
Reproductiva Animal, ubicado en la provincia de Huamanga, departamento de Ayacucho.

3.4.2. Punto de muestreo

La recolección de las muestras de semen, será por el método de la vagina artificial, a partir de cinco machos, por triplicado.
3.4.3. Determinación de la integridad espermática
La integridad espermática se determinara en espermatozoides de semen fresco, refrigerado y descongelado previa colección y
análisis del semen.
3.4.4. Recolección de semen de alpaca
 En el Tubo de PVC (vagina artificial) se pasará el jebe de látex por el interior de la vagina (Látex doblada se introduce en la
vagina artificial).
 La bolsa cortada de polietileno se fijará al tubo Falcon antes de la recolección de semen.
 La bolsa con el tubo Falcon se fijará al tubo de PVC en la mañana antes de la colección de semen.
 Antes de echar agua se jalará el látex en el extremo posterior, luego se agregará agua de 45 a 46ºC. Se procederá con un
ligero jalón al látex antes de echar agua caliente, después se fijará con las cinta de jebe.
 Se colocará aire por el pitón, para una ligera presion en el interior de la vagina.
 Se colocará la tapa protectora al tubo Falcon (capuchón) para mantener la temperatura y evitar la exposición a la luz para
que los espermatozoides recolectados puedan sobrevivir.
 Se envolverá la vagina armada con una bolsa de agua que contenía agua caliente y se cubrirá con una franela exteriormente
para mantener la temperatura.
 Se procederá a limpiar la zona del periné del maniquí y adicionará gel para facilitar la entrada de la vagina artificial, se
colocará la vagina armada al maniquí.
 Se procederá a la copula y monta de los machos seleccionados controlando el tiempo y la efectividad de la eyaculación.
 Una vez que el macho ha penetrado, se tomará el tiempo de cópula de 15 a 40 minutos/macho en promedio, luego se retirará
la vagina del maniquí. Inmediatamente se retirará el tubo Falcon protegido, y se empezará con la evaluación de semen
primero macroscópicamente y luego microscópicamente.
3.4.5. Análisis microscópico del semen
 Después de la recolección de semen el tubo con la muestra se colocará inmediatamente a Baño María a 37°C.
 Se observará el eyaculado en laboratorio, tratando de evitar el contacto directo con la luz solar, siendo las siguientes
características macroscópicas.
3.4.5.1. Motilidad individual
 Se tomará una gota de semen puro usando una micropipeta
 En semen fresco se evaluara la motilidad sin usar diluyente y se observará directamente al microscopio
 Solo se usará el dilutor Andromed para evaluar la motilidad a diferentes tiempos.
 Luego se tomará una gota de la dilución y colocará en la lámina portaobjetos.
 Se observará al microscopio óptico de campo claro a 40x, la motilidad con valores de porcentaje de 0 a 100% de acuerdo a su
movilidad.

3.4.5.2. Vitalidad
 Para efectuar la coloración, se usará la solución acuosa de Eosina al 5% y de Nigrosina al 10%, como medio de contraste
(mezcla).
 Es muy recomendable que antes de que estos colorantes tomen contacto con el semen sean previamente calentados en una
platina térmica a 37 - 39°C
 Se tomará con una micropipeta de 10 ul de semen se espera unos 20 seg y se agrega una gota de colorante mezclado que se
colocarán en lámina portaobjeto, se mezclará para luego hacer un frotis espermático.
 Se dejará secar y después de 2 h luego se observará al microscopio óptico de campo claro 40X o 100X con aceite de
inmersión
 Luego se observará espermatozoides muertos de color rojo o violeta y los vivos color transparentes.
 Se evaluarán cinco (05) campos, en los cuales se contó el número de espermatozoides muertos presentes, dicho valor se sumó
y se estimó el número total de células muertas, se contara hasta un mínimo de 200 espermatozoides. Este parámetro se
expresó en porcentaje (%) de espermatozoides vivos.
3.4.5.3. Refrigeración del semen
 Primeramente en Baño María a 37°C se preparará el diluyente Andromed en un tubo Falcon y se atemperará por 5 minutos
 Se usará una proporción 4:1, 4 ml de agua ultra Pura o bidestilada y 1 ml de Andromed, se mesclará siempre añadir el agua
al Andromed.
 Se procederá a efectuar la dilución de un solo paso para la refrigeración y congelación del semen, dicha dilución se realizará
en una proporción de 1:1 de la muestra del semen y diluyente andromed.
 Una vez terminada la dilución, se procederá al enfriamiento o refrigeración del semen, con el objetivo de lograr que el semen
baje de una temperatura de 37°C a 5°C en un tiempo promedio de 2 horas.

3.4.5.4. Congelación del semen

 Primeramente se evaluará la motilidad y concentración mayor al 50% para poder congelar.
 Se diluirá el semen en una proporción de 1 a 1:1 ml de semen y 1 ml de diluyente andromed, siempre manteniendo la
temperatura.
 Al mismo tiempo las pajillas se colocarán en la refrigeradora a 5 ° C por 10 min para adaptar a la misma temperatura del
semen.
 Para el llenado se utilizará una jeringa de tuberculina con adaptador que coincidirá con el extremo posterior de la pajilla.
 Se absorberá el semen en las pajillas de 0.5 ml y finalmente se sellará con alcohol polivinílico haciendo 3 a 4 golpes y se
sumergirá rápidamente en el agua a 5°C este proceso se realizará lo más rápido posible para evitar cambios de temperatura
 En un frasco se preparará agua con cubos de hielo 5 °C para adaptar las pajillas con el semen que se congelará evitando el
shock térmico, se esperará unos 15 min.
 Se llevará al tanque de nitrógeno líquido que no contenga las canastillas, se abrirá la tapa, se sacará el tapón y con una regla
se medirá hasta donde llegue el nitrógeno.
 De la medida se medirá 10 cm hasta donde llega la base de los cilindros del tanque.
 Se introducirá una canastilla con las pajillas y se congelará, luego se bajará la canastilla 3 cm por 5 min, se repetirá 3 veces,
la última vez aparte de las 3 veces se bajará hasta el fondo del tanque y se contará 10 segundos para luego sacarlo
rápidamente o permanecerlo en el mismo tanque.
 Se cambiará a otro tanque apto para congelar y se sumergirá en el nitrógeno líquido a -196°C por 72 horas.
3.4.5.5. Descongelación
 Para la descongelación de semen se sacará al azar una pajilla del tratamiento correspondiente y se sumergirá inmediatamente
en agua tibia a 37º C contenida en un termo de descongelación, las pajillas de 0.50mL serán sumergidas por un tiempo de 30
seg.
 Cumplido el tiempo se sacará la pajilla del agua se secará con ayuda de papel toalla.
 Se cortará un extremo de la pajilla con ayuda de una tijera y se colocará una gota de semen sobre una lámina portaobjetos
temperada a 37°C.

3.4.5.6. Evaluación del semen descongelado

Una vez descongelado el semen se procederá a la evaluación de integridad de membrana espermática (Hoechst 33342/PI), y la
prueba de HOST (test endosmótico), además se realizará las pruebas de motilidad, vivos y muertos.

3.4.5.7. Evaluación de la integridad de la membrana espermática (Tinción fluorescente Hoechst 33342/PI)

 Se atemperará las muestras de semen de alpaca a 37°C
 Se usará la Cantidad de un tubo color café con 250 ul Hoechst 33342/PI
 Para 10 ul de la muestra de semen precalentada se agregará 2 ul de la mezcla colorante de Hoechst 33342/PI.
 Se Mezclará de la forma más correcta sobre un tubo eppendorf
 Se Incubará la muestra de 10 ul de semen más 2 ul de Hoechst 33342/PI por 15 min a 37°C durante este lapso se protegerá de
la luz con papel aluminio
 Se colocará una gota sobre portaobjetos y cubrir con cubreobjetos
 Se observará a 10x y 20x de aumento en Androvisión (Sistema CASA)
 Se entrará al sistema Androvisión CASA luego en “análisis avanzado” después modulo “viabilidad”
 El análisis de integridad de membrana se realizará en semen fresco, refrigerado y congelado
Se analizará en cinco campos para sacar un promedio, luego se observará los espermatozoides con membrana dañada
aparecen de color rojo y los espermatozoides de color azul tienen membrana intacta.Los datos se organizarán en tablas y
figuras, se realizará el Análisis estadístico de *******con el diseño *******, se aplicará análisis de varianza con una
confianza de 95% (α=0,05).

3.5. Cronograma de trabajo

4. PRESUPUESTO
DESCRIPCIÓN Monto S/.

1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1.1 Libros 200
1.2 Internet 100
1.3 Revistas 50
2 EQUIPO y otros
2.1 Microscopio 250
2.2 Equipo CASA 750
2.3 Tinción eosina nigrosina 48.60
2.4 Tinción hoesch 450
3 MATERIALES CAMPO
3.1 Cronómetro 84
3.2 Maniquís 4220
3.3 Animales 4620
3.4 Termómetro 90
4 MATERIALES ESCRITORIO
4.1 Cuadernos de apunte 120
4.2 Impresión de fichas técnicas 300
5 TRANSPORTE 500
6 VIÁTICOS 200
7 IMPREVISTOS 500
TOTAL 12,482.60
5. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
1. Calamera, J.C. 2004. El laboratorio de andrología como ayuda diagnóstica. En: Curso Teórico-Práctico: Entrenamiento en
técnicas de análisis seminal. International Society of Andrology. Chile, 12-14 enero.
2. Gonzáles, G.F. 1992. Pruebas de laboratorio para el diagnóstico del factor masculino. En: Andrología, Fertilidad e
Infertilidad. Perú.
3. Wheeler, J.C. 1991. Origen, evolución y status actual. En: Avance y perspectivas de los camélidos sudamericanos.
Ed. Saúl Fernández-Baca. Oficina Regional de la FAO para América Latina y el Caribe.
4. Smith, C.L., A.T. Peter, D.G. Pugh. 1994. Reproduction in llamas and alpacas: a review. Theriogenology, 41:
573-596.
5.

6. MATRIZ DE CONSISTENCIA
TITULO: Determinación De La Integridad De La Membrana Espermática Mediante La Prueba De Host Y Tinción
Hoesch 33342/PI En Semen Fresco, Refrigerado Y Post Descongelado De Alpacas (Vicugna Pacos), Ayacucho, 2018.
Problema Objetivo Marco teórico Hipótesis Variables e Metodología
indicadores
PROBLEMA GENERAL . Antecedentes Los valores Variable Diseño de investigación:

PRINCIPAL .Evaluar la integridad de la . Importancia social y económica integridad de independiente: Experimental.

¿Existirán membrana plasmática en . Reproducción membrana Tipo de semen: Tipo de investigación:

diferencias en la espermatozoides de alpaca en . El Espermatozoide de alpaca espermática son fresco, Básica.

integridad de la semen fresco, refrigerado y . Estructura del espermatozoide diferentes en refrigerado y Tamaño de la muestra:

membrana congelado. . Viabilidad espermática espermatozoides congelado 30 muestras de semen de alpaca

plasmática en ESPECÍFICOS . Acrosoma evaluados en semen Variable colectados por vagina artificial, a

espermatozoides .Determinar la integridad . Integridad acrosomal fresco, refrigerado y dependiente: partir de 7 machos

de Vicugna pacos acrosomal en espermatozoide .Técnicas para la evaluación del congelado de alpaca, Integridad Técnicas:

“alpaca” alpaca usando el Método Triple acrosoma por lo cual el proceso integridad de . Determinación de la integridad

recuperados de Tinción Azul de Tripán, Rojo . La integridad de membrana de refrigeración y membrana espermática

semen, fresco Neutro y Giemsa en semen espermática descongelación espermática . Recolección de semen

refrigerado y fresco, refrigerado y congelado. . Funcionalidad de membrana tienen efecto sobre la . Análisis microscópico del semen

congelado? .Determinar la integridad de plasmática membrana . Refrigeración del semen

membrana espermática usando la . Técnicas para la evaluación de la espermática del . Congelación del semen

tinción fluorescente de Hoechst integridad de membrana espermática espermatozoide de . Evaluación de membrana

33342/PI con el Módulo . Androvisión sistema CASA alpaca. Análisis estadístico.

Androvisión (Sistema CASA), en . Semen de alpaca Los datos se organizarán en tablas y

semen fresco, refrigerado y . Características del semen figuras, se realizará el Análisis

congelado. . Tipos de semen estadístico de ANVA con el diseño

.Correlacionar la integridad . Descongelación del semen de alpaca completamente aleatorizado (DCA),

acrosomal y la integridad de la . Alteraciones de los espermatozoides se aplicará análisis de varianza con

membrana plasmática con la durante el proceso de congelación una confianza de 95% (α=0,05).

motilidad espermática. . Importancia del semen.

I.1. PRESUPUESTO
I.1.1. BIENES
I.1.1.1. Materiales de escritorio
 02 cuadernos A4 de 100 hojas………………………………………………...S/20.00
 02 unidades de marcadores (negro)…………………………..…....................S/2.00
 01 USB de 8G…………………………………………………………………...S/15.00
 1/2 millar de papel bond A-4 de 75g…………………………………………..S/13.00
 Otros……………………………………………………………………………...S/30.00
I.1.1.2. Materiales de laboratorio
 Materiales de plástico……………………………………………………….…S/400.00
 Materiales de vidrio…………………………………………………………….S/200.00
 Reactivos………………………………………………………………………S/1000.00
 Equipos…………………………………………………………………….….S/6200.00
I.1.2. SERVICIOS
 Impresiones y fotocopias ………………………………………………...…..S/190.00
 Movilidad……………………………………………………….…………….....S/250.00
 Otros………………………………………………………………………....….S/180.00
I.1.3. RESUMEN DEL PRESUPUESTO
 Bienes………………………………………………………………………...S/ 7880.00
 Servicios…………………………………………………………………….....S/ 620.00
 Total………………………………………………………………………...…S/ 8500.00
I.2. FINANCIAMIENTO
Autofinanciamiento…………………………………………………….………..S/ 1000.00
INIA- Ayacucho……………………………………….…………………..….….S/ 7500.00
Total……………………………………………………………………….….….S/ 8500.00