DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR MÉTODO KJELDAHL

I. INTRODUCCIÓN
El término proteína fue utilizado por primera vez por el químico Alemán Gerardus
Johannes Mulder, en 1838, para nombrar a un grupo específico de sustancias muy
abundantes en todas las plantas y animales. Mulder pronosticó correctamente la
importancia de las proteínas; tomó este nombre del vocablo griego proteios que
significa primordial o de nivel primario. (Boyer, 2000). En 1883 el investigador
danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el
análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno
orgánico.
En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los
alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores.  El
nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de
amonio.  La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente.
El amoniaco liberado es arrastrado por destilación y recogido en una solución de
ácido bórico.  Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado
para determinar   el nitrógeno contenido en la muestra (Bohinski, 1991).
El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos
métodos. El método Kjeldahl se basa en la determinación del nitrógeno. La
determinación del contenido de nitrógeno en muestras de naturaleza orgánica es
importante en muchos campos de análisis, como los relacionados con las industrias
agroalimentaria o farmacológica o con el medio ambiente, entre otros (Dominic et
Wong, 1995).
La forma más habitual es su cuantificación de forma indirecta y aproximada, bien a
partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a
partir del contenido de uno o dos aminoácidos particulares que conforman la
proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por su reactividad química específica.
Este segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace más de 100
años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación del nitrógeno en una
amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el
cálculo del contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la
determinación de nitrógeno en aguas residuales y suelos.
Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO,
Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias (Morrison et Boyd, 1998).
 OBJETIVOS
 Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del
contenido en proteína de un alimento.
 Conocer el procedimiento experimental del análisis de proteínas por el
método de Kjeldahl, recogiendo el nitrógeno sobre ácido bórico y
valorándolo con una disolución de ácido clorhídrico o sulfúrico.
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Método
El método más tradicional de determinación de nitrógeno fue desarrollado hace
más de 130 años por el dinamarqués Johan Kjeldahl, que estudiaba proteínas en
granos. Titulado como Método Kjeldahl, es ampliamente utilizado en la
determinación de nitrógeno total, que, indirectamente, posibilita la
determinación de la proteína bruta. A pesar de algunos cambios a lo largo de los
años, la esencia de la metodología permanece la misma hasta los días actuales
(Agrícola, 2020).

Se fundamenta en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico

concentrado, en presencia de un catalizador con acción de calor, con posterior
destilación y titulación del nitrógeno proveniente de la muestra (Agrícola,
2020).

2.1.1 Etapas

El método de Kjeldahl es el que más se emplea y también se toma como

referencia de comparación con otros métodos, el método consiste en que
todo el nitrógeno orgánico presente en la muestra es convertido en
nitrógeno amoniacal mediante una digestión con un reactivo que esta
denominado como reactivo de digestión, en presencia de calor y
catalizadores, luego le sigue un proceso de destilación en donde el
Nitrógeno amoniacal formado es destilado mediante la adición de
reactivos como el NaO (Navea, 2015).

2.1.1.1 Digestión
La muestra ya homogeneizada (después de molida) que seguirá para
la digestión es previamente pesada en la balanza analítica y
mezclada en la proporción necesaria de ácido sulfúrico concentrado
en un tubo en borosilicato. Es adicionado catalizador que actuará en
la aceleración de la digestión (Gerhardt, 2015).

Figura 1.1 Esquema de la digestión

Los catalizadores normalmente utilizados son:

 Ácido sulfúrico. - Para que la muestra dentro del bloque

digestor presenten reacciones de manera efectiva.
 Selenito de sodio. -Para minimizar detonaciones dentro del tubo.
 Sulfato de sodio. -Para elevar el punto de ebullición del ácido
sulfúrico para aproximadamente 360°C.

La mezcla preparada es colocada en el bloque digestor. La

temperatura mínima del bloque para que la reacción ocurras es de
350°C, sin embargo, normalmente, es fijada en 400°C, para
garantizar la eficiencia del proceso.
 Figura 1.2 Bloque digestor TE-0081/50

Con el calentamiento del bloque digestor (Figura 1.2) juntamente

con la mezcla ácida, el carbono contenido en la muestra es oxidado,
el dióxido de carbono se desprende y el nitrógeno es transformado en
sulfato de amonio, transformando la muestra oscura en una solución
translúcida, normalmente, verde claro. En este momento, la digestión
es finalizada.

2.1.1.2 Destilación

Después de la digestión de la muestra, la solución de sulfato de

amonio obtenida en el tubo es enfriada a temperatura ambiente y,
posteriormente, es llevada al destilador de nitrógeno. Antes de
comenzar la destilación. es necesario que sea colocado un
Erlenmeyer en la salida del condensador del equipo, que deberá
contener ácido bórico y un indicador, generalmente, rojo de metilo.

El tubo de borosilicato es colocado en el destilador, donde es

dosificado hidróxido de sodio para la neutralización. El sulfato de
amonio, presente en el tubo, en contacto con el hidróxido de sodio
dosificado y el vapor de agua de la caldera del equipo, es
transformado en hidróxido de amonio y, así, liberado en estado
gaseoso.

Cuando el hidróxido de amonio es liberado, éste pasa por el sistema

de destilación del equipo y condensa dentro del Erlenmeyer que fue
preparado previamente con ácido bórico (Gómez, 2011).
 Figura 1.3 El destilador de nitrógeno TE-0364 marca TECNAL

2.1.1.3 Titulación

En la etapa de titulación, es colocado en una bureta, normalmente,

ácido clorhídrico y un indicador, verde de bromocresol o azul de
bromotimol, que son titulados en el borato de amonio, que fue
formado en la etapa de destilación.

El ácido clorhídrico es titulado hasta que alcance el punto de cambio

del destilado, lo que altera su coloración para incolora/gris. Cuando
esa coloración es identificada, la titulación está finalizada. Y el
indicador, formando el borato de amonio en una coloración que pasa
de rojo pálido para verde (Churión, 2016).

Determinación

Después de finalizar la titulación, la proteína bruta es mensurada por

medio del cálculo:

 V= Volumen de la solución de ácido clorhídrico usado para titular

la muestra - Volumen de la solución de ácido clorhídrico usado para
titular el blanco
 F= Factor de la solución de ácido clorhídrico
 N= Normalidad de la solución de ácido clorhídrico
 6.25= Factor de transformación de nitrógeno en proteína bruta
 14.008= Equivalente en gramo de nitrógeno
 P= Peso de la muestra

En el caso de alimentos, de acuerdo con el tipo de muestra, el factor

de conversión varía de 3.24 la 6.26.

III. MATERIALES Y METODO:

III.1 Materiales
III.1.1 Reactivos
 Sulfato de cobre
 Sulfato potásico
 Ácido sulfúrico concentrado.
  Hidróxido sódico 50%.

 Indicador Shiro-Tashiro.

 Ácido bórico 4%.

 Ácido clorhídrico 0.250 M.

III.1.2 Instrumentos
 Tubo de ensayo con tapón.
 Tubo para digestión Kjeldahl.
 Agua destilada.
 Micro bureta automática de 10 mL graduada de 0.05 mL en
0.05 mL.
 Matraz Erlen Meyer.
 Baso de precipitado.
III.1.3 Equipos
 Balanza analítica.
 Unidad de digestión Kjeldahl.
 Destilador Kjeldahl.
III.2 Métodos
Se utilizó el método Kjeldahl para determinar el contenido de nitrógeno en la
muestra de leche, y luego se multiplicó por el factor de conversión de %
nitrógeno a % de proteína para leche (6,38). Se siguieron las 3 etapas
principales.
III.2.1 Preparación de la muestra y digestión o mineralización
Se pesan 10 gramos de sulfato potásico que sirven para elevar el punto
de ebullición del ácido sulfúrico y así favorecer la mineralización de la
leche. Se adiciona 1 mL de disolución de Sulfato de cobre al 5 % que
va a actuar como catalizador en la reacción de mineralización. En una
probeta, agitar la leche con cuidado de no hacer espuma para que la
grasa este perfectamente repartida. Verter 5 mL de leche en un tubo de
ensayo con tapón para pesarlo por diferencia en la balanza analítica y
luego verter la leche en un tubo de digestión.
Se añade 20 mL de ácido sulfúrico concentrado en el tubo de digestión,
y al reaccionar con la leche se produce una carbonización parcial de la
muestra y se torna color marrón negruzco. Los tubos de digestión se
 conectan a una bomba de básico que es la encargada de arrastrar los
vapores de agua y ácido sulfúrico y hacer burbujear en una disolución
de hidróxido sódico (NaOH) para neutralizarlos.
Se disponen los tubos de digestión en una unidad de digestión Kjeldahl
“Buchi K-435”. La etapa de digestión o mineralización dura
aproximadamente 4 horas. Durante la mineralización de la muestra se
forma espuma y hierve hasta que el líquido pierde todo su color. Se
dejan enfriar y una vez en temperatura ambiente se añaden 100 mL de
agua destilada.
III.2.2 Destilación
El destilador Kjeldahl “Buchi K-350” se encarga de la adición de
hidróxido sódico para la formación del amoniaco y de la destilación
del mismo. Se añaden 50 mL de ácido bórico al 4% para recoger todo
el amoniaco destilado, se añade un exceso de ácido bórico para que
reaccione con todo el amoniaco desprendido. Lo que sucede se plasma
en la siguiente ecuación química.

Se hace uso del indicador Shiro-Tashiro, es una mescla de indicador

rojo de metilo y azul de metileno. Este indicador tiene un color rojo
violáceo en medio débilmente acido (pH < 5) y verde en medio neutro
o básico (pH > 7).
III.2.3 Valoración
Una vez formado el borato amoniaco se realiza la valoración con
ácido clorhídrico 0.250 M. Con una micro bureta automática de 10
mL se enraza hasta 0 y se va adicionando poco a poco la disolución de
HCl hasta que la disolución del Erlen Meyer tome un color
débilmente violáceo. Con el volumen de ácido clorhídrico gastado
podemos calcular la cantidad de proteína en la muestra de leche. La
situación se describe en la siguiente ecuación química.

III.2.4 Cálculo de las proteínas en la muestra de leche.

 Se procede a realizar los cálculos con la siguiente formula.
 Porcentaje de N%

 Porcentaje de proteína en la leche

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

IV.1 Resultados
Porcentaje de proteína en la leche a través del método de Kjeldah
Fórmula para el porcentaje de nitrógeno:
N ( HCl )∗[ G ( HCl ) muestra−G ( HCl ) blanco ]∗0.014∗100
%N =
Wmuestra

Datos:

 W muestra = 4.8919
 G(HCl) muestra =6.75
 G(HCl) muestra = 0.2
 N(HCl) = 0.25
Remplazamos datos para hallar el porcentaje de nitrógeno:

0.25∗[ 6.75−0.2 ]∗0.014∗100

%N =
4.8919

0.25∗[ 6. 55 ]∗0.014∗100
%N =
4.8919

%N =0.469

Fórmula para el porcentaje de nitrógeno:

% Proteina=%N∗(6,38)

Porcentaje de proteína en la leche:

%Proteina=0.469∗( 6,38 )
 %Proteina=2.99

IV.2 DISCUSIONES
 Según Jhonás A. Vega, (2016):

“En la práctica de determinación de proteínas, el procedimiento consiste en que

al obtener las valoraciones de la muestra se pueden calcular el número de
equivalentes de nitrógenos recogidos, y con este dato se consigue el porcentaje
de nitrógeno en la muestra”. Para ello se necesita de la siguiente formula:

V∗N∗0.014∗100
%Nitrogeno=
m

Donde:

V: Volumen de ácido clorhídrico empleado en la titulación, en ml.

N: Normalidad de ácido clorhídrico.

M: Masa de muestra en gramos

0.014: mili equivalente del Nitrógeno.

 En la clase práctica, se nos explicó el mismo procedimiento que tiene el artículo

mencionado anteriormente cuyo autor es Jhonás A Vega, para la determinación
de nitrógeno y proteína total. Pero en nuestra practica solo lo realizamos con
leche como muestra y al obtener sus valoraciones, elaboramos el procedimiento
y las fórmulas en Excel, y obtuvimos como resultado 0,469% de nitrógeno y
2.99% de proteína total de la muestra.
 La calidad de una proteína alimenticia, en términos nutritivos, solo puede
establecerse realmente mediante ensayos de alimentación (Madl, 1993; Suarez
et al. 2006), pero hoy se sabe lo suficiente con respecto a la digestión de las
proteínas y a los efectos de las técnicas de procesados como para poder realizar
experimentalmente bastante precisos. Para ello, es necesario conocer tanto el
contenido proteínico total de alimento como la composición aminoacídica de su
proteína (Madl, 19939).
 En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína total
que las proteínas o aminoácidos individuales. En general, el procedimiento de
 referencia Kjeldhl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las
no proteínas cono las proteínas verdaderas (Aurand et al, 1987).
 La determinación de nitrógeno total por el método Kjeldahl aun hoy en día es
uno de los métodos mas utilizados en el análisis químico (Souza et al., 2000;
Moller, 2005). Aceptado por la A.OA.C. (1984). No requiere de un equipo
sofisticado y se adapta con facilidad a los análisis de rutina de gran numero de
muestras.

 Puede ser dividido, en tres fases la digestión o mineralización, destilación y

valoración. El procedimiento a seguir es diferente en función de si en la etapa de
destilación el nitrógeno liberado es recogido sobre una disolución de ácido
bórico o sobre un exceso conocido de ácido clorhídrico o sulfúrico patrón. Ello
condicionará la forma de realizar la siguiente etapa de valoración, así como los
reactivos empleados. (Nielsen. S; 2003).

V. CONCLUSIONES:

 A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el método Kjeldahl

para la determinación de proteínas de un alimento a partir de la
cuantificación del nitrógeno, empleando ácido bórico como medio para
atraparlo y ácido clorhídrico o sulfúrico para su valoración. Además, se
han expuesto los cálculos necesarios para obtener el porcentaje de
proteína a partir del contenido en nitrógeno de la muestra y se ha
ejemplificado el procedimiento con un caso real.

 Se determino la el porcentaje de %N de la muestra con el método Kjeldahl,

siendo 0.469 y con este dato se obtiene el porcentaje de la proteína en la
leche.

 El porcentaje de la proteína que se encuentra en 5 ml de leche es 2.99% que

se determinó por método Kjeldahl.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Agrícola, PT (2020). DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL /
PROTEÍNAS MEDIANTE EL MÉTODO KJELDAHL. ProainShop .
 https://proain.com/blogs/notas-tecnicas/determinacion-de-nitrogeno-total-
proteinas-mediante-el-metodo-kjeldahl
 Bohinski, R. C., 1991. Bioquímica. 5ª edición, Ed.Pearson, Edo. De México, pp
113-117.
 Boyer, r., 2000. Conceptos de Bioquímica, capítulo 4: Aminoácidos péptidos y
proteínas. Ed Internacional Thomson Editores, S.A de C.V., México DF.
 Dominic, C.; Wong, V. S., 1995. Química de los alimentos, mecanismos y
teoría. Ed. Acribia S. A., Zaragoza, España.
 Gerhardt. (2015). ANÁLISIS DE NITRÓGENO EL MÉTODO DE JOHAN
KJELDAHL. Recuperado de
https://www.gerhardt.de/fileadmin/Redaktion/downloads/Stickstoffanalyse__Di
e_Methode_von_Johan_Kjeldahl_gekuerzt_f_Homepage-spa-ES.pdf
 Gómez, F. (2011). DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO
KJELDAHL. Recuperado de http://www.grupo-
selecta.com/notasdeaplicaciones/analisis-alimentarios-y-de-aguas-nutritional-
and-wateranalysis/determinacion-de-proteinas-por-el-metodo-de-kjeldahl-
kjeldahl-method-for-protein-determination/
 Lanza, J. G., Churión, P. C., & Gómez, N. (2016). Comparación entre el método
Kjeldahl tradicional y el método Dumas automatizado (N cube) para la
determinación de proteínas en distintas clases de alimentos. Saber, 28(2), 245-
249.
 Navea, J. (2015). Determinación de Nitrógeno y proteína bruta en una muestra
de alimento por el método de kjeldahl. Recuperado de
https://www.academia.edu/7813005/Determincacion_de_Proteina_en_Leche_Po
r_Metodo_Kjeldahl
 Nielsen, S.: “Food Analysis”, Ed. Kluwer Academic/Plenum Publ, 2003, pág.
131- 142.
 Souza, A.V.C.;Lopez,D.C.;Pacheco,B.M.;Vieites, F.M. 2000.Comparação entre
as metodologias de kjeldahl e de dumas para determinação de nitrogênio em
amostras de alimentos e fezes de suínos. Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Zootwcnia.pp.262
 Vega, J. A. (2016). Determinación de proteínas. Obtenido de:
https://es.slideshare.net/vegabner/determinacion-de-proteinas-mediante-el-
metodo-de-kjeldahl-nutricion