UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INFORME N° 1 LABORATORIO:

BIOQUIMICA DE ENTEROBACTERIACEAE

Curso: Microbiología de Alimentos

Docente: Blgo. Mcblgo. Jaime Fernández Ponce M.Sc.

Alumnas:
Meca Córdova, Janelly Pierina
Mechan Pinillos, Victor Ignacio

Mogollón Venegas, Sonia Maribell

22 de enero del 2021

 RESUMEN
Objetivo:
Desarrollar correctamente los procedimientos de todas las pruebas planteadas para
la identificación de las especies de la familia Enterobacteriaceae y explicar sus
fundamentos.
Material y métodos:
Se detalló de manera virtual los materiales, instrumentos, las condiciones del cultivo
a utilizar, los medios (líquido, sólido o semisólido) y métodos de siembra (asadas,
picadura o estría), reactivos (indicando su respectiva concentración), el periodo de
incubación (cantidad de horas y temperatura), los resultados (cambio en sustratos,
cambios de coloración de medio, etc.) y la forma en cómo se da lectura e interpreta
los resultados de cada prueba bioquímica empleada para la identificación de
bacterias de la familia Enterobacteriaceae.
Resultados:
Se conoció el fundamento por el cual las pruebas bioquímicas estudiadas cambian,
produciendo la fermentación de lactosa, glucosa, producción de gas, etc. Además
de variar el color original del medio como manifestación de estos procesos.

Conclusiones:
Se conoció y aprendió el correcto procedimiento para cada prueba bioquímica
estudiada además de entender sus fundamentos.

Palabras claves: Enterobacteriaceae, coliformes, pruebas bioquímicas.

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 INTRODUCCION
La Familia Enterobacteriaceae constituye el conjunto de bacterias más grande y
heterogéneo de bacilos gramnegativos con importancia clínica. Se han descrito más
de 50 géneros y cientos de especies y subespecies. Estos géneros se han
clasificado en función de sus propiedades bioquímicas, estructura antigénica,
análisis molecular de sus genomas mediante secuenciación génica y composición
de proteínas mediante espectofotometría de masas. (Forbes B., Sahm D. y
Weissfeld A. 2009)
Las enterobacterias son microorganismos ubicuos, se encuentran de forma
universal en el suelo, el agua y la vegetación y son parte de la flora intestinal normal
de muchos animales, incluido el ser humano. La mayoría de los miembros de la
familia Enterobacteriaceae son microorganismos que fermentan la glucosa, no
producen oxidasa, crecen en agar MacConkey y con raras excepciones, reducen
los nitratos a nitritos. (Forbes B., Sahm D. y Weissfeld A. 2009)
Algunas pruebas bioquímicas como la prueba de la Catalasa; en los ambientes
acuosos, que contienen oxígeno disuelto, como el citoplasma de las células,
aparecen formas toxicas derivadas del oxígeno. Las bacterias que viven en
ambientes aerobios necesitan un equipo enzimático capaz de neutralizar estas
formas toxicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el
peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno molecular. El agar Kligler (KIA); este
medio diferencial complejo es muy útil, ya que demuestra varias características
enzimáticas de la bacteria, está compuesto principalmente por dos azucares en
distinta proporción (glucosa al 0.1% y lactosa al 1%), tiosulfatosodico, citrato ferrico
y rojo fenol como indicador de pH. Prueba del Indol; esta prueba se emplea para
detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias, esta enzima
degrada el aminoácido triptófano a indol, que es el compuesto que se detecta en
este ensayo (Velasco, 2003).
La taxonomía de la Familia Enterobacteriaceae es compleja y está cambiando con
rapidez conforme se realizan estudios de homología de ADN y así constantemente
presenta una nueva clasificación y lo que hoy se afirma mañana se recomienda
modificar para reinstalar un grupo en su antiguo lugar o cambiarlo. No obstante, se
utilizan los mismos principios básicos: las propiedades bioquímicas (citocromo
oxidasa negativos, reducción de nitratos a nitritos, fermentación de glucosa), las
reacciones serológicas, la susceptibilidad a bacteriófagos específicos de Género y
especie, y los patrones de sensibilidad a los antibióticos. (García y Zamudio, 1998)
Los objetivos de esta práctica fueron desarrollar correctamente los procedimientos
de todas las pruebas planteadas para la identificación de las especies de la familia
Enterobacteriaceae y explicar sus fundamentos.

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II. MATERIALES Y METODOS
1. COLORACION GRAM
1.1 Materiales:
• Mechero
• Laminas
• Agua destilada
• Alcohol acetona
• Colorantes: cristal violeta, safranina y Lugol
• Aceite de inmersión

1.2 Procedimiento:

• Se colocó una gota de medio liquido con bacterias sobre un portaobjeto

• Luego se fijó la muestra pasándola por calor suave.
• Después, se cubrió con cristal violeta manteniéndose por 30 a 60
segundos.
• Posteriormente se lavó con agua.
• Se cubrió con lugol durante 1 minuto.
• Luego se lavó con alcohol acetona hasta que no se desprendió mas
colorante de la lámina.
• Después, se coloreo con safranina durante 30 segundos.
• Se volvió a lavar con agua y se secó.

2. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICACION DE FAMILIA

ENTEROBACTERIACEA:

2.1 Materiales:

• Tubos con agar TSIl

• Tubos con caldo nutritivo KCN
• Tubos con agar nutritivo
• Tubos con caldo nitrato
• Tubos con agar fenil alanina
• Tubos con agar citrato
• Tubos con agar Taylor y tubos con medio testigo sin lisina
• Tubos con caldo urea
• Tubos con agar nutritivo en columna
• Tubos con caldo arginina
• Tubos con agar salicilina con PBC
• Tubos con caldo malonato
• Tubos con caldo triptonado

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 • Tubos con caldo MRVP
• Tubos con caldo lactosado bilis verde brillante
• Reactivos:
- De la oxidasa
- De Gries
- De la prueba de fenil alanina: Sulfato de amonio, alumbre férrico y
ácido sulfúrico ONPG y tolueno
- Kovac
- Rojo de metilo
- Alfa naftol (5%) y KOH (4%)

2.3 Procedimiento:

A) Reacción de oxidasa:
- Se inoculó una asada en tubos que contenían agar nutritivo.
- Se incubó a 30ºC durante 24 horas.
- Se colocó en una placa de petri vacía, un papel de filtro de 6 cm 2 y se
depositó 3 gotas del reactivo 1-naftol al 1% y en otro papel filtro se
añadió solución de dimetil P-fenilendiamina diclorhidrato al 1%.
- Con la ayuda de un asa se hizo una extensión de la bacteria en el
papel impregnado con el reactivo.
- Se incubó por 2 minutos.

B) Reducción de los nitratos:

- Se inoculó una asada del microorganismo, en tubos que
contenían caldo nitrato.
- Se incubó a 30ºC durante 24 horas.
- Se añadió el reactivo de Gries + mezcla 1% alfa-Naftalina, 10% ácido
sulfanílico y 89% acido tartárico.

C) Formación de H2S y fermentación de la glucosa y lactosa:

- Con aguja de Kolle se inoculó por picadura central profunda y por

estría en superficie en medio Kliger o TSI.
- Se incubó los tubos a 37ºC por 24 horas.

D) Prueba de tolerancia al KCN

- Antes de sembrar, se agregó 0.1 ml de KCN sobre agar nutritivo en

tubo, se agitó e inoculó tres asadas del microorganismo
- Se incubó a 37ºC durante 24 horas a 48 horas.

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 E) Transformación de la Fenil Alanina en ácido fenil pirúvico.

- Se inoculó los tubos con agar fenil alanina con la cepa del cultivo
fresco y se incubó a 35°-37ºC por 24 horas.
- Luego de la incubación, se cubrió el cultivo con la mezcla del reactivo y
se dejó rodar varias veces.

F) Descarboxilación de la lisina

- Se inoculó los tubos con agar Taylor y el medio testigo (sin lisina) con la
cepa del cultivo fresco y se incubó a 35°-37ºC por 24- 48 horas.

G) Investigación de beta-galactosidasa

- A partir de un cultivo en A/N, se realizó una suspensión densa del

cultivo agregando 0.25 ml de solución salina.
- Se adicionó 1 gota de tolueno a la suspensión densa de
cultivo.
- Luego, se adicionó 0.25 ml de ONPG (orto-nitro-phenil
beta D-galacto-piranosida) al 0.6%
- Se incubó a 35ºC por unos minutos.
- Finalmente, se llevó a baño maría a 37ºC por 20 minutos a 24 horas.

H) Hidrólisis de la urea

- Se inoculó una asada del microorganismo, en tubos que

contenían caldo urea.
- Se incubó a 37ºC durante 24 horas.

I) Motilidad

- Se sembró con filamento a 5 mm de la superficie agar

Nutritivo en columna.
- Se incubó a 37ºC durante 24 – 48 horas.

J) Ataque de la arginina

- Se inoculó los tubos con caldo arginina y el medio testigo (sin arginina)
con la cepa del cultivo fresco y se incubó a 35°-37ºC por 24- 48 horas.

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 K) Ataque a la Salicilina

- Se inoculó los tubos con agar salicilina con PBC, por puntura profunda,
con la cepa del cultivo fresco y se incubó a 35°-37ºC por 24- 48 horas

L) Asimilación del Malonato

- Se inoculó los tubos con caldo malonato con la cepa del cultivo fresco y
se incubó a 35°-37ºC por 24 horas.

M) Aglutinación con suero polivalente Salmonella

- Se colocó sobre un portaobjetos, 3 gotas separadas de suero
polivalente Salmonella y se marcó A, B y C
- Agregar:
o A= cepa patron de Salmonella.
o B= cepa a examinar
o C= gota de solución salina.

3. PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICACION DE COLIFORMES:

A) Asimilación del citrato

- Se sembró (a partir de la cepa de un medio sólido) trazando una línea

central en superficie. Se incubó a 35°-37ºC por 24 horas.

B) Formación de Indol
- Se tomó una asada, se sembró la cepa en el caldo Triptonado
- Luego, se incubó a 35°-37ºC por 24 - 48 horas.
- Luego, se adicionó 0.5 ml de reactivo de Kovacs.

C) Rojo de Metilo

- Se inoculó los tubos con caldo MR-VP y se incubó a 35ºC por 3 a 5

días.
- Después, se adicionó unas gotas de rojo de metilo al 0.04%
- Finalmente, se agitó el tubo

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 D) Voges Proskauer

- Se inoculó los tubos que contenían caldo MR-VP y se incubaron a

37ºC por 48 horas.
- Se pipeteó por separado 1 mL del cultivo a un tubo de prueba
vacío, se adicionó 0.6 mL de solución de α- naftol (5%) y 0.2 mL
de solución de KOH (40%).
- Finalmente, se agitó el tubo, se dejó en reposo por 2-4 horas.

E) Test de Mackenzie Gilbert y Taylor

- Se sembró la cepa en estudio en caldo lactosado bilis verde

brillante.
- Luego, se incubó a 44ºC +- 0.1ºC 24-48 horas.

F) Prueba de termotolerancia de Eijkman

- Se sembró cepa en estudio en caldo triptonado.

- Se incubó a 44ºC +- 0.1ºC 24-48 horas.
- Finalmente, se adicionó 0.5 ml de reactivo de Kovacs

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 III. RESULTADOS

ITEM PRUEBA RESULTADO

1 Oxidasa Oxidasa negativa: Papel se torna incoloro
2 Reducción de nitratos Nitritos positivo: coloración roja en caldo nitrato
3 Formación de H2S y fermentación H2S (+): coloración negruzca en superficie y base.
de glucosa y lactosa Fermentación lactosa: viraje a amarillo en
superficie. Fermentación glucosa: viraje amarillo
en profundidad
4 Prueba de tolerancia al KNC Tolerancia (+): formación de disco blanco en
superficie
5 Transformación de la Fenil alanina Transformación (+): coloración verde
en ácido fenil pirúvico

6 Descarboxilación de la lisina Descarboxilación (+): aparición de color purpura

en medio Taylor y color amarillo en medio testigo
7 Investigación de beta- Prueba positiva: coloración amarilla
galactosidasa
8 Hidrólisis de la urea Prueba positiva: coloración rosada
9 Motilidad Motilidad positiva:desarrollo semejante a nebulosa
en parte inferior
10 Ataque de la arginina Prueba positiva: color purpura en medio Taylor y
color amarillo en medio testigo
11 Ataque a la salicilina Prueba positiva: viraje al color amarillo
12 Asimilación del malonato Prueba positiva: viraje del verde a azul marino
13 Aglutinación con suero polivalente Prueba positiva: Aglutinación en A y B, y no
Salmonella aglutinación en C

14 Asimilación del citrato Prueba positiva: Viraje del verde a azul marino
15 Formación de Indol Prueba positiva: formación de anillo rojo
16 Rojo de metilo Prueba positiva: color rojo
17 Voges Proskauer Prueba positiva: coloración rojo carmín o rosado
Test de Makenzie Gilbert y Taylor
Prueba positiva: formación de gas en campana de
Durham, viraje de color verde a amarillo
18 Prueba de termotolerancia de Prueba positiva: formación de anillo color rojo
Eijkman

Tabla 1: Se detalla el cambio que hubo en la muestra, sustrato y/o medio que demostró que
el resultado era positivo para su prueba bioquímica correspondiente.
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IV. DISCUSION
La reducción del nitrato tiene lugar generalmente en condiciones anaeróbicas, en
las cuales un organismo obtiene su oxigeno del nitrato. En la reducción del nitrato,
los citocromos bacterianos transportan electrones a moléculas aceptoras
específicas, los productos finales de la reducción del nitrato son: nitrito, amoniaco,
nitrógeno molecular, dióxido nitrico, oxido nitroso e hidroxidolamina. (Valera, 2012)
El producto final obtenido depende de la especie bacteriana, debido a que, si el
microorganismo con el que se trata no asimila en su metabolismo celular al nitrato,
entonces pasará a ser parte de las sustancias que se excretan al medio y que en
su mayoría se obtiene nitrógeno molecular.
Fermentación de la glucosa únicamente (alcalino/ácido); en esta fermentación se
observa el pico de flauta alcalino (rojo) y la columna ácida (amarilla). Los
microorganismos utilizan primero la glucosa, acidificándose todo el medio y virando
el indicador al amarillo. Después de 18 a 24 horas. La glucosa (0,1%) ha sido
consumida y el organismo comienza a usar las peptonas aeróbicamente
alcalinizando el pico (vira nuevamente a rojo) por liberación de NH3. Estos
microorganismos son incapaces de fermentar la lactosa y/o sacarosa. (Rodríguez.
2005)
Cualquier sustancia presente en la naturaleza puede servir como nutrientes de uno
u otro microorganismo, pero ninguno puede utilizar todos los nutrientes a la vez, la
glucosa y lactosa son hidratos de carbono que al ser fermentados van a acidificar el
medio, mientras que el tiosulfito es reducido a ácido sulfihídrico, el cual reacciona
con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro evidenciado de color negro.
La urea es hidrolizada por la enzima ureasa, produciendo CO2 y NH3. Este último
proporciona reacción alcalina al medio, como puede comprobarse por el viraje del
indicador (rojo fenol) de amarillo a fucsia. (Valera, 2012)
La producción de amoniaco hace que la reacción dada en el medio sea alcalina,
además la ureasa es sintetizada sin considerar la presencia de su sustrato (urea)
debido a que el sustrato del agar urea es una carbamida la cual es hidrolizada con
facilidad.
Las bacterias reductoras de sulfato producen sulfhídrico el cual reacciona con el
amonio ferroso y se produce un sulfato ferroso (H2S) que se forma como un
precipitado oscuro a lo largo de la línea de inoculación. El medio contiene caseína
rica en triptona la cual es usada por ciertos microorganismos quienes finalmente
producen indol. (Valera, 2012)
La movilidad es visible ya que es un medio semisólido y siendo positivo el
crecimiento se ve por fuera de la línea de siembra, en forma de turbidez alrededor
del canal de siembra. La no mobilidad se caracteriza por el crecimiento
exclusivamente a lo largo de la línea de inoculación inicial.

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El desdoblamiento del citrato comprende el sistema enzimático de la citritasa (citrato
oxalacetato-liasa) o citrato desmolasa. La enzima requiere de un catión bivalente para
activarse, se utiliza el magnesio incluido al medio como sulfato de magnesio. Los
organismos capaces de usar citrato como única fuente de carbono utilizan también las sales
de amonio como única fuente de nitrógeno. Estas sales se desdoblan en NH3, dando
alcalinidad, virando el indicador (azul de bromotimol) hacia el azul. (Rodríguez. 2005)

El citrato como única fuente de carbono para algunas bacterias, en este laboratorio se
usaron cultivos en medio solido de E. coli y Enterobacter aerogenes. La prueba se considera
positiva para asimilación de citrato si el medio presenta coloración azul con crecimiento.
El triptofano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres
metabolitos indólicos principales: indol, metilindol e indolacético. Diversas enzimas
intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre colectivo de Triptofanasa.
La desaminación del triptofano es del tipo reductor, el NH2 es extraído y liberado como NH3
y energía que es utilizado por la bacteria. (Rodríguez. 2005)

El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4.4 (rojo). El pH al

cual el rojo de metilo detecta ácidos es mucho más bajo que el pH correspondiente a otros
indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un
cambio de color, el microorganismo es estudio debe producir grandes cantidades de ácidos
(láctico, acético, fórmico) de la utilización de la glucosa. (Rodríguez. 2005)

La prueba Voges Proskauer se basa en la detección de la acetoína que se produce en la

fermentación, cuando reacciona con el hidróxido de potasio (KOH al 40% p/v) es oxidada,
en presencia de oxígeno atmosférico, a diacetilo, el que a su vez reacciona con los grupos
guanídicos de la arginina, que está presente en las peptonas que constituyen el medio,
dando una coloración rojiza.

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V. CONCLUSIONES
- Se estudió que las bacterias de la familia enterobacteriaceae son capaces de utilizar
una serie de carbohidratos con producción de ácidos y gas.
- Se determinó el grupo coliforme, mediante el uso de una prueba específica
(fermentación de la lactosa).
- Se demostró que algunos microorganismos al fermentar la glucosa producen y
mantienen alta acidez, mientras que otros bajan inicialmente la acidez y después
viran a la neutralidad.
- Se estudió algunos microorganismos que degradan los compuestos proteicos, hasta
el aminoacido triptófano, con producción de indol.
- Se demostró que el ácido sulfihídrico producido por reacciones catabólicas, como la
descomposición de compuestos de azufre orgánico y la reducción de compuestos
inorgánicos de azufre, puede ser detectado cuando en el medio se forma una sal de
metal pesado.
- Se demostró que algunos microorganismos elaboran la enzima ureasa, y que ésta
hidroliza la urea hasta convertirla en amoníaco.

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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

− Forbes B., Sahm D. y Weissfeld A. 2009. “DIAGNOSTICO

MICROBIOLOGICO” 12a Edicion-Editorial medica Panamericana. Buenos
Aires-Argentina.

− García del Valle Araceli y Zamudio Durán María de las Mercedes, 1998.
Manual: microbiología médica. Universidad Nacional Autónoma de México.
Zaragoza – España.

− VALERA SANCHEZ R. Y OTROS. Catálogo de Prácticas de laboratorio para

la docencia en Microbiología. Universidad Miguel Hernández de Elche.
España. 2012

− Velasco, J. 2003. Manual Práctico de Microbiología. 2da ed. Edit. Masson

S.A. Barcelona –España.

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