CURSO ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO - TQ

PRÁCTICO N° 4
Control de Calidad de Alimentos elaborados artesanalmente
Microorganismos patógenos
Objetivos:
 Monitorear la calidad microbiológica de alimentos elaborados artesanalmente.
 Conocer e interpretar la normativa vigente.
 Ejercitar los procedimientos para muestreo de alimentos.
 Aplicar métodos de enriquecimiento-aislamiento para microorganismos con riesgo para
la salud.

Método de ensayo, Materiales y Medios:

1) Escherichia coli genérica: Es huésped constante del intestino del hombre y de los
animales de sangre caliente. Por su especificidad está considerado como un buen índice
de contaminación fecal. Tiene el inconveniente de vivir poco tiempo en el ambiente
extraentérico, por lo que su presencia en los alimentos indica contaminación reciente.
Pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Es un microorganismo de forma bacilar, casi
siempre móvil, Gram negativo. Posee estructura antigénica. La mayoría de las bacterias
pertenecientes a la especie E. coli, forman parte de la micro flora normal del intestino
del hombre y de los animales de sangre caliente, encontrándose, habitualmente, en sus
heces. Su detección en los alimentos sirve como índice de contaminación fecal de los
mismos.

Método seleccionado: enriquecimiento-aislamiento

1) Enriquecimiento: caldo TSB, incubar 24 h, 35°C (10 g en 90 mL)

2) Aislamiento: agar Mc Conkey y EMB-Levine, incubar 24 a 48 h, 35°C

3) Re-aislamiento en TSA colonias sospechosas, incubar 24 h, 35°C

4) Pruebas de identificación:

a. Coloración de Gram

b. Catalasa

c. Oxidasa

d. Oxido Fermentación de la glucosa x 10 mL, incubar 24 h, 37°C

e. Ensayo IMViC (Prueba del Indol en Caldo Peptona al 1% x 10 mL, Prueba del Rojo
de Metilo y Voges Proskauer en Caldo Glucosa Fosfato x 10 mL, Prueba del Citrato en tubo
inclinado Agar Citrato Simmons x 10 mL), incubar 48 h, 37°C

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2) Staphylococcus aureus coagulasa positiva: Es una especie bacteriana integrada por

formas cocáceas de 0,8 – 1,0 mm de diámetro, que se divide en más de un plano por lo
que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son
Gram positivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes.
Más del 50% de las personas son portadoras de S. aureus en fosas nasales, garganta,
forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los
alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación. Además algunas
cepas de S. aureus son patógenas para el hombre porque producen enterotoxinas que
dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario
un número menor a 106 UFC/g para producir cantidad suficiente de enterotoxina para
producir la enfermedad en el consumidor. En resumen la presencia de un número
elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala
manipulación. Si además el S. aureus aislado son cepas enterotoxigénicas suponen un
riesgo para la salud.

Método seleccionado: enriquecimiento-aislamiento (APHA, Staphylococcus aureus 39.5, 4ta ed)

1) Enriquecimiento selectivo

a. Preparar dilución 1:10 (10 g alimento en 90 mL H2O peptonada 0,1%)

b. Transferir 50 mL en 50 mL TSB doble concentración, incubar 3 h, 35-37°C

c. Agregar 100 mL de TSB adicionado de 20% NaCl, incubar 24 h, 35-37°C

2) Aislamiento: agar Baird Parker por duplicado, incubar 48 h, 35-37°C

3) Re-aislamiento en TSA colonias sospechosas, incubar 24 h, 35°C

4) Pruebas de identificación, tomar dos o más colonias sospechosas de cada placa y

realizar:

a. Prueba de coagulasa:

Transferir las colonias a 0,2 mL de caldo BHI. Incubar 24 h, 35-37°C. Agregar

0,5 mL de plasma + EDTA a los 0,2 mL de caldo, agitar e incubar entre 35-37°C examinando
periódicamente cada 6 h la formación de coágulos. En caso de dudas re-chequear luego de 18 h
pero no más de 48 h.

b. Prueba de aglutinación (alternativa a la prueba de coagulasa):

Partir de una colonia aislada en TSA, tomar una colonia y colocar en el

centro del círculo del test y en el centro del círculo del control. Agregar una gota del reactivo
control en el círculo control y una gota del reactivo test en el círculo de test. Mezclar primero el
control y con la misma ansa mezclar el test. Mover el cartón durante 1 minuto suavemente y
observar. El test es positivo si se observa aglutinación en el círculo de test y aspecto homogéneo
en el círculo control. En caso de resultados que no puedan ser interpretados, realizar pruebas
adicionales.

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c. Pruebas adicionales:

i. Coloración de Gram (cocos G+, 0.8 – 1 µm de diámetro, solos, en pares y más

habitualmente en racimos)

ii. Catalasa

iii. DNAsa, incubar 48 h a 37°C

Resultados:

Expresar los resultados con las cifras y unidades que correspondan para cada punto muestreado.

Informe:

 TÍTULO
 Autores (Integrantes del grupo)
 Introducción: Breve discusión sobre la metodología en estudio, importancia de la
determinación, y breve fundamento de la misma. Deben incluirse referencias
bibliográficas.
 Objetivo: Debe especificarse el(los) objetivo(s) de la práctica realizada.
 Materiales y métodos: En esta sección debe incluirse una descripción de las muestras
analizadas y de las metodologías seleccionadas para realizar el análisis. No deben
transcribirse las técnicas utilizadas, únicamente se debe mencionar el nombre de las
técnicas y hacerse referencia al material del curso práctico o a la fuente utilizada para
obtener dicha técnica. En el caso de realizar modificaciones a la técnica, éstas deben
indicarse claramente.
 Resultados y Discusión: Presentación de los datos obtenidos, con su correspondiente
incertidumbre. Discusión de los datos y comparación con datos reportados en
bibliografía o datos previos.
 Conclusiones: Conclusiones de la práctica.
 Referencias: Todas las referencias utilizadas en el informe deben incluirse en una lista
de referencias, en orden alfabético. Para la presentación de las referencias debe
utilizarse el formato APA.
(http://www.cva.itesm.mx/biblioteca/pagina_con_formato_version_oct/apa.htm)

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ANEXO 1
Caldo base para la prueba de óxido-fermentación de la glucosa
Fórmula (g/ Litro)
Glucosa
Peptona
Cloruro de sodio (NaCl)
Fosfato dipostasico (K2HPO4)
Azul de bromotimol
pH final 7,4 ± 0.2
Caldo glucosa fosfato (Prueba de RM-VP)
Fórmula (g/ Litro)
Peptona
Dextrosa (Glucosa)
Fosfato dipostasico (K2HPO4)
pH final 6,9 ± 0.2
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Instrucciones
10 Suspender en 1000 mL de agua destilada.
Calentar si es necesario para disolver
2.0 completamente el medio. Distribuir en tubos
2.0 en cantidades de 10 mL y esterilizar en
0.3 autoclave (121°C, 15 min). Inocular por
0.03 duplicado (uno en aerobiosis y otro en
anaerobiosis colocando vaselina líquida
estéril inmediatamente salido el tubo del
autoclave para evitar la incorporación de
oxígeno)
Instrucciones
7.0 Suspender 17 g de polvo en 1000 mL de agua
5.0 destilada. Calentar si es necesario para
5.0 disolver completamente el medio. Distribuir
en tubos en cantidades de 10 mL y esterilizar
en autoclave (121°C, 15 min)
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ANEXO 2

Colonias sospechosas en Agar Bird

Parker
Staphylococcus produce colonias grises
oscuras a negras debido a la reducción
del telurito. Las colonias típicas
además presentan zonas claras
alrededor de la colonia debido a la
acción de las lecitinasas sobre la yema
de huevo y zonas opacas de
precicipitación como consecuencia de
la actividad de las lipasas.

Colonias sospechosas en Agar Mc

Conkey
Las colonias sospechosas son de color
rojo (lactosa positivas) con un halo de
precipitación de sales biliares
alrededor de ellas.

Colonias sospechosas en Agar EMB

Levine
Los microorganismos fermentadores
de lactosa forman colonias de color
negro azulado o amarronado. Pueden
tener centro oscuro y brillo metálico.
Los microorganismos no
fermentadores de lactosa forman
colonias incoloras que toman la
coloración del medio.

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