03-06-2021

Departamento de Ciencias Químicas y Biológicas

BIOQUIMICA

Cinética Enzimática

PROFESOR: Dr. Manuel Gutiérrez

En esta clase revisaremos…..

▪ Cinética Enzimática

▪ Ecuación de Michaelis y Menten

▪ Factores que afectan la actividad enzimática

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Cinética Enzimática
• Determina la cantidad de producto generado por una
reacción enzimática en un tiempo determinado.

• Para una reacción enzimática la velocidad de reacción es:

E + S E ‐ E + P v = kcat [E‐S]
S
kcat o número de recambio se define como la cantidad de substrato
transformado en la unidad de tiempo por una cantidad dada de
enzima.

Orden de la Reacción
Orden cero

Orden uno

Velocidad

• Reacción de Orden uno: la velocidad es proporcional a la

cantidad de substrato.
Velocidad
• Reacción de Orden Cero: la velocidad es constante y no depende
de la cantidad de substrato.

Cantidad de enzima constante

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Efecto en la velocidad

Efecto concentración de enzima Efecto concentración de substrato

¿Por qué la velocidad llega a ser constante?

La velocidad máxima (Vmax) depende de la cantidad de enzima

presente

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Cinética Enzimática
Representación grafica del
comportamiento descrito por
Michaelis-Menten.

La cinética de Michaelis
Menten nos describe el
comportamiento de las
enzimas y como estas
transforman los sustratos.

Esto es de gran relevancia

para
poder entender la acción de
los
fármacos. Y también para
entender el metabolismo de
muchas sustancias y/o
alimentos.

Cinética Enzimática

Postularon que la cinética de la

reacción catalizada puede indicar
el comportamiento de la enzima.

A partir de:

La transformación del sustrato a producto es más lento que la unión del sustrato a la
enzima, por tanto, la segunda reacción es el limitante de la cinética.

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Cinética Enzimática

Bajo los corolarios utilizados por

Michaelis y Menten la velocidad
de la reacción puede ser
expresada:

La reacción de la enzima ocurre en el estado

estacionario, por tanto, casi la totalidad de la
enzima se encuentra unida a sustrato.

Cinética Enzimática

*Aquí asumiremos que la

formación y disociación son
iguales o sea estamos en
estado estacionario
Y dado que la cantidad de E = E0 - ES

Si definimos la Km en
términos de las constantes
involucradas en la cinética de
la reacción entonces Km es
igual a:

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Cinética Enzimática
Recordando que:

Si asumimos que en el estado Podemos simplificar la ecuación de

estacionario el exceso de S nos Michaelis-Menten a:
lleva a que toda la enzima se
encuentre en forma de ES,
entonces:

• Asumieron que la concentración de enzima se mantiene constante durante la reacción.

• El sustrato esta en concentraciones muy superiores a la de la enzima.
• La reacción ocurre en el estado estacionario, por tanto, casi la totalidad de la enzima se
encuentra unida a sustrato.
• Asumiremos que en estado estacionario la formación y disociación del complejo ES son
iguales.

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Ecuación de Michaelis – Menten

• En la representación de Michaelis-‐ Menten se gráfica

la V vs [S]
E + S E- E + P
‐S
v = Vmax [S]
Km + [S]

Ecuación de Michaelis- Menten

Vmáx: corresponde a la velocidad máxima.

Km: Constante de Michaelis.

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Constante de Michaelis

k1 k2
E + S E ‐S E + P
k-
‐1

Km = k-‐1 + k2
Si la constante de velocidad k 2 <<< k-
k1 ‐1

Km = k-
La Km es una medida de la afinidad que
‐1
k1 presenta la enzima por el substrato

Mientras menor sea el valor de Km mayor será la afinidad de la

enzima por su substrato

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Grafico del doble reciproco o de

Lineweaver-Burk
• La medición directa del valor numérico de Vmáx y, por consiguiente, el cálculo de Km a
menudo requiere concentraciones altas poco prácticas de sustrato para alcanzar
condiciones de saturación.
• Una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten evita esta dificultad y permite
extrapolar Vmáx y Km desde de datos de velocidad inicial obtenidos a concentraciones
de sustrato menores que las que producen saturación.

v = Vmax [S]
Km + [S]

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Factores que afectan la actividad enzimática

• Concentración del sustrato

• Concentración de la enzima
• Temperatura
• pH
• Presencia de cofactores
• Presencia de inhibidores (competitivo, no competitivo, mixto)

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Concentración de Enzima y de Sustrato

Efecto del sustrato Efecto de la enzima

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Efecto del pH en la ENZIMA

Cada enzima tiene un pH

óptimo para su actividad
El pH afecta las interacciones
iónicas

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:

- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

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Efecto de la temperatura en la ENZIMA

ORGANISMOS TERMÓFILOS
• Son organismos que viven a altas tº y
realizan sus reacciones enzimáticas a estas
altas tº
• Ejemplos son los que viven en las aguas
termales
• Es tema de investigación el aislamiento de
las enzimas de estos organismos para
desarrollar procesos industriales en
condiciones más extremas
Cada enzima tiene una
temperatura óptima.

Cambios en la temperatura o el pH modifica la estructura terciaria y

cuaternaria de las enzimas modificando su actividad

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Cofactores

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Inhibición Enzimática

Es de importancia comprender la manera en que se inhiben las enzimas

por los siguientes motivos:

• El flujo de metabolitos a través de las vías metabólicas puede

controlarse mediante la inhibición enzimática selectiva.
• A través de la inhibición se ha logrado descubrir el mecanismo de
acción de muchas enzimas.
• Los inhibidores enzimáticos se emplean como fármacos, insecticidas y
armas químicas entre otros.

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Mecanismos de Inhibición Enzimática

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Inhibidores Reversibles

El análisis cinético distingue

entre inhibición competitiva
y no competitiva

La inhibición reversible se caracteriza por:

•La unión entre la enzima y el inhibidor es reversible.

•Existe un equilibrio entre la enzima y el sustrato libre junto con el

complejo enzima -‐ sustrato.

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Inhibidores Competitivos
• El inhibidor competitivo, es aquel que compite con el sustrato
por el sitio activo de la enzima, de esta forma impide la
formación de producto.

• Son compuestos que tienen una

estructura química y/o
geométrica similar al sustrato.

• La inhibición va a depender de
la concentración de inhibidor,
de sustrato y de las afinidades
relativas que tengan el sustrato
y el inhibidor por el sitio activo

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Inhibidores Competitivos

La inhibición competitiva es reversible

al incrementar la concentración se
sustrato, el cual desplaza al inhibidor del
sitio activo de la enzima.

• Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima

• Se une solo a la enzima libre
• V máx no se altera y K M cambia

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Ejemplos de Inhibición Competitiva

Metotrexato es un inhibidor reversible de

la enzima dihidrofolato-‐ reductasa

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Inhibidores No Competitivos
Los inhibidores no competitivos se unen a un lugar distinto al sitio activo, por lo cual no
compiten con el sustrato.

•El inhibidor no competitivo modifica la forma del sitio activo lo que impide la interacción de
la enzima con el sustrato.

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Inhibidores Acompetitivos

• El inhibidor acompetitivo se fija al complejo enzima- ‐ sustrato,

pero no a la enzima libre.

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Inhibidores Irreversibles
• Reaccionan con la enzima formando un enlace covalente, lo cual:
– Bloquea la unión del sustrato.
– Inhibe la actividad de la enzima.
• Inhiben de forma permanente a la enzima.
– Se requiere la síntesis de novo de enzima para superar la inhibición.

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Ejemplos de Inhibidores Irreversibles

• Fármacos como la Penicilina, la Aspirina y el Disulfiram son

inhibidores irreversibles de la actividad de enzimas.

– La Penicilina es un inhibidor de la transpeptidasa, encargada de la síntesis

de la pared bacteriana.
– La Aspirina es un inhibidor de la COX, enzima que produce mediadores
proiinflamatorios.
– Disulfiram es un inhibidor de la aldehído deshidrogenasa, una enzima que
participa en el metabolismo del alcohol.

• Compuestos tóxicos como, los gases nerviosos (DFP) o los

metales pesados actúan como inhibidores irreversibles

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Regulación Enzimática

Para regular de la manera más eficiente una vía metabólica, lo mejor es controlar
las enzimas clave que participan en el «paso limitante de la velocidad». Por regla
general, en la regulación de la actividad enzimática participan cinco mecanismos
independientes:

❖ Expresión de la proteína enzimática a consecuencia de los cambios genéticos.

❖ Activación o inactivación de modo irreversible por enzimas proteolíticas.

❖ Activación o inactivación de modo reversible por modificaciones covalentes

(ej., fosforilación).

❖ Regulación alostérica moduladora de la actividad de las enzimas clave a

través de la fijación reversible (feedback regulation) de pequeñas moléculas.

❖ Degradación de las enzimas por proteasas intracelulares.

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Regulación Enzimática

La reacción o etapa limitante, se puede identificar por una o varias de las

siguientes características, que le diferencian del resto de las reacciones de la vía
metabólica:

❖ Normalmente está catalizada por la enzima de la vía que presenta la Vmáx

más baja.

❖ Es la reacción que se encuentra más desplazada del equilibrio.

❖ Es frecuente que se encuentre próxima a una ramificación o encrucijada

metabólica.

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Expresión de Enzimas

La actividad de una enzima depende, en primer

lugar, de su cantidad; es decir, de su
concentración o número de moléculas de la
enzima presentes. Esta cantidad es determinada
por el balance entre su síntesis y degradación

Regulación Transcripcional.
oLas proteínas se sintetizan y degradan de manera continua
oGatilla el incremento o disminución en la expresión del
gen que codifica la enzima
oLa síntesis ribosomal de algunas enzimas está controlada
por inductores, por sustratos característicos y/o por
compuestos relacionados que inician su síntesis
oA la inversa, un exceso de un metabolito puede restringir
la síntesis de su enzima cognada por medio de represión.

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Activación o inactivación por acción de

proteasas

o Son modificaciones covalentes en las

enzimas que modulan la actividad de estas.
o Las enzimas pueden ser activadas o
desactivadas por enzimas proteolíticas.
o Algunas enzimas se sintetizan como
precursores inactivos conocidos como
proenzimas o zimógenos. Un ejemplo son
las enzimas digestivas las cuales se secretan
como derivados inactivos.
o La activación proteolítica de proproteínas
constituye una modificación irreversible
porque la reunificación de las dos porciones
de una proteína producida por hidrólisis de
un enlace peptídico es desfavorecida desde
el punto de vista entrópico

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Modificaciones Covalentes
• Se han encontrado mas de 500 tipos diferentes de modificaciones covalentes de
proteínas. La modificación de un residuo aminoácido de una enzima es equivalente a la
introducción de un nuevo aa con propiedades alteradas dentro de la enzima.
• La acetilación, la ADP-ribosilación, la metilación y la fosforilación son ejemplos de
modificaciones estructurales covalentes “reversibles”.

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Modificaciones Covalentes
Fosforilaciones
• Es probablemente la modificación mas
importante. Son llevadas a cabo por enzimas
quinasas que fosforilan en residuos de Ser, Thr
Tyr Lys e His y por fosfatasas que eliminan el
fosfato por hidrolisis.
• Su efecto puede ser de activación, inactivación,
cambio de sensibilidad o cambio de estructura
cuaternaria.
• La fosforilación-desfosforilación permite alterar
las propiedades funcionales de la enzima
afectada sólo durante el tiempo que satisfaga una
necesidad específica (reversibles)

Adenilación
• Proceso en el cual se consume ATP para unir un
grupo ADP a la enzima y producir su activación

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Regulación alostérica

La regulación alostérica ocurre comúnmente en vías

metabólicas secuenciales donde el producto de una
reacción actúa como regulador alostérico de una
enzima que cataliza un paso previo en la vía.

La denominada inhibición feedback supone la inhibición

de una enzima que es alostérica y que cataliza la
reacción limitante de una vía por el producto final de la
misma

Por lo general el producto se une en un sitio distinto

desde el punto de vista espacial del sitio catalítico de la
enzima. Así, los inhibidores por retroalimentación
típicamente tienen poca o ninguna similitud estructural
con los sustratos de las enzimas que inhiben

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Degradación de las enzimas

La disponibilidad de las enzimas se regula finalmente por medio de su degradación.

Así previniendo su excesiva acumulación o presencia cuando no son necesitadas

Ubiquitinilación, proteasoma y degradación proteolítica

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En resumen…
• Las enzimas son biomoléculas que catalizan las reacciones bioquímicas en los
organismos vivos.
• La interacción de las enzimas con su sustrato es específica y se produce por el sitio
activo.
• La cinética enzimática estudia la cantidad de producto generado por una reacción
enzimática en un tiempo determinado.
• Cinética de Michaelis-‐Menten
La constante de Michaelis (Km) es una medida de la afinidad que presenta la enzima
por el substrato.
• Las enzimas tienen múltiples mecanismos de regulación.
• La actividad de las enzimas puede ser inhibida por compuestos naturales o sintéticos.
• Existen mecanismos reversibles e irreversibles de inhibición enzimática.
• Los mecanismos de inhibición pueden ser dilucidados mediante el análisis de los
cambios de los parámetros cinéticos de las enzimas.

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