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Espectrofotometría 2019 Versión Final
Espectrofotometría 2019 Versión Final
ESPECTROFOTOMETRÍA
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
En los métodos espectrofotométricos se mide la intensidad de luz (energía radiante
o radiación electromagnética) para determinar la concentración del analito presente en una
muestra.
1- Espectrofotometría de absorción:
En estos casos se mide la Absorbancia (A) del analito, esto es la luz absorbida por el
analito, y esta magnitud se relaciona con la concentración (C).
2- Espectrofotometría de emisión:
En este caso se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, la señal
emitida se relaciona con la concentración de la especie que emite luz cuando vuelve desde
un estado excitado (estado de mayor energía al que llegó absorbiendo energía) a su estado
basal (estado de menor energía posible tal como se encuentra naturalmente).
CONCEPTOS PREVIOS
A) Luz o radiación electromagnética
Dado que los métodos espectrofotométricos se basan en la medición de luz, repasamos las
características de la radiación electromagnética y recordamos a que se denomina espectro
electromagnético.
La Física Clásica define a la luz como una radiación electromagnética y la describe como
una onda trasversal a la dirección de propagación (Figura 1).
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
1- Longitud de onda (λ): es la distancia que existe entre dos máximos o dos mínimos de la
onda, se mide en unidades de longitud (cm, µm, nm, etc) (Figura 2)
3- Frecuencia de la onda (ν): representa cuantas veces pasa la onda completa por un punto
fijo en la unidad de tiempo, se mide en Hercios (1 Hz= 1Hertz) que significa la inversa del
segundo siendo 1 Hz = 1/s = s-1
4- Amplitud de la onda (A): se mide desde la línea de avance hasta el máximo de la onda
(Figura 2).
Figura 2- Representación bidimensional de una onda electromagnética. El eje vertical puede ser el campo
eléctrico o el magnético y el eje horizontal puede ser el tiempo o la distancia.
Los parámetros que caracterizan a una radiación electromagnética están relacionados entre
sí de la siguiente manera:
ν = c/λ
La unidad de medida que se usa para la longitud de onda (λ) depende de la región del
espectro electromagnético en la que se esté trabajando (Figura 3). Si estamos en la región
visible y ultravioleta (las que se usan en los métodos que vamos a estudiar) la unidad de
medida es nm (nanómetros, corresponde a 10-9 metros). La frecuencia (ν) se mide
generalmente en Hertz (1/s) y c es la velocidad de la luz en el vacío, es una constante cuyo
valor es 3 x 108 m/s o 3 x 1010 cm/s
Para utilizar esta relación entre frecuencia y longitud de onda, las unidades
de la constante c definirán en que unidades utilizaremos los otros parámetros.
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
fotones representan paquetes discretos de energía denominados “cuantos”. Con este nuevo
concepto, se interpreta a la luz como una onda que propaga energía y la energía de la
onda (radiación electromagnética) queda definida como:
E=hxν
h: constante de Planck , su valor es 6,63 x 10-34 J.s (J: Joules; J=kg·m2/s2)
E = h x c/λ
En esta expresión podemos observar claramente que cuanto mayor es la frecuencia de la
luz mayor será su energía y que cuanto mayor sea la longitud de onda menor será la energía:
Una fuente de luz, por ejemplo el sol y las lámparas eléctricas, emiten un amplio espectro
de radiaciones electromagnéticas, es decir que emiten luz de diferentes longitudes de onda:
Espectro electromagnético (Figura 3).
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
como máximo dos electrones apareados. Los niveles de energía dentro del átomo
los denominábamos 1,2, 3, etc y a medida que aumenta el nivel de energía, mayor
es el número de orbitales presentes en cada nivel así, el primer nivel sólo tiene 1
orbital (1s) el segundo nivel posee 4 orbitales (2s; 2p; 2p; 2p) y así sucesivamente.
También podemos recordar que de acuerdo a la posición de un átomo en la tabla
periódica podíamos deducir la estructura electrónica del mismo. Por ejemplo
pensemos en el átomo de Na, que tiene número atómico 11, es del período 3 y del
grupo I. Esto quiere decir que tiene 11 electrones en total, los que ocupan hasta el
tercer nivel de energía electrónica y que tiene 1 sólo electrón en el último nivel:
1s2; 2s2 y 2p6; 3s1
Una vez que hemos recordado la estructura interna del átomo y donde se ubican los
electrones, ahora podemos comprender que cuando los electrones dentro del átomo
absorben una cantidad de energía adecuada pueden pasar de un nivel energético a otro de
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
mayor energía (Figura 4). El resultado de esta transición es un átomo excitado que resulta
inestable y rápidamente buscará la manera de regresar al nivel de menor energía
eliminando el exceso de energía de alguna manera (liberando calor o emitiendo luz) (Figura
4): PROCESO DE RELAJACIÓN.
Una molécula está formada por la unión entre átomos, estas uniones no son
estáticas ya que permanentemente vibran y rotan. Las uniones entre átomos se deben a
enlaces entre sus electrones externos. Por lo tanto cuando hablamos de la energía interna
(E) de una molécula estamos hablando de tres componentes: E rotacional, E vibracional y
E electrónica.
Tomando en cuenta esta estructura interna de una molécula tenemos que pensar
que los electrones dentro de la molécula tendrán determinado nivel energético de vibración
y de rotación además de su nivel electrónico (Figura 5).
La separación entre los niveles de energía estará dada por cantidades discretas de
energía, es decir “cuantos” de energía (E = h x ν). Esto quiere decir que para que un
electrón pase de un nivel energético a otro dentro de la molécula debe absorber cantidades
discretas de energía. La transición electrónica será la que alcance según la energía absorbida,
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
pero es un hecho que si la energía fue suficiente para hacer un salto electrónico, fue más
que suficiente para hacer saltos vibracionales y rotacionales ya que son de menor energía.
Las moléculas excitadas son inestables al igual que los átomos, por lo tanto también buscarán la
manera de regresar a su nivel de menor energía posible liberando calor o emitiendo luz:
PROCESO DE RELAJACIÓN.
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
Significa que cuando un haz de luz incide sobre la solución del analito, éste absorbe energía
la que utiliza para pasar de su estado basal de energía (el más bajo, estado fundamental) a
un estado excitado (de mayor energía).
1- DEFINICIÓN DE ABSORBANCIA
Figura 6- Dibujo que representa un haz de luz monocromática que incide en una solución que
absorbe dicho haz. P0: potencia de la luz incidente y P: potencia luego de atravesar la muestra
Se define TRANSMITANCIA de una solución a la fracción de luz que deja pasar dicha
solución:
T= P/P0
Se define la ABSORBANCIA de la solución a partir de la trasmitancia de la solución
como:
A = -log T
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
P0 P
Figura 7- Esquema que representa el fenómeno que describe la ley de Lambert y Beer. P0
es la potencia de la luz monocromática incidente; P es la potencia de la luz luego de
atravesar la solución de concentración c y b es el camino óptico.
A=εxbxc
A: absorbancia, adimensional.
ε: coeficiente de extinción molar ó absortividad molar, se define como la unidad de
absorbancia por unidad de concentración y por unidad de longitud de la trayectoria de luz;
es una constante definida que depende de la solución y la longitud de onda, en general su
unidad es la inversa de la molaridad por la inversa de cm, es decir (M x cm)-1 ó L/mol x cm
b:es el camino óptico, en general se mide en cm.
c: es la concentración del analito expresada en molaridad (M).
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A (λ) = ε (λ) x b x c
Con cierta frecuencia se utiliza como constante de proporcionalidad en la Ley de Lambert y
Beer la absortividad específica (a) en lugar de la absortividad molar. Las unidades de la
absortividad específica son (L/g x cm) y por lo tanto en este caso la concentración del
analito se debe expresar en g/L.
A=axbxc
La ley de Lambert Beer es una ley límite, es decir que sólo se cumple
en determinadas condiciones: luz monocromática y soluciones diluidas.
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Figura 9- Representación de un
ESPECTROGRAMA o
ESPECTRO de ABSORCIÓN
de un analito. A es la banda de
longitudes de onda centrada en
λ1 y B es la banda de longitudes
de onda centrada en λ2.
λ1 λ2
Si analizamos la banda centrada en la longitud de onda λ2, vemos que no habrá gran
variación en la lectura de absorbancia a lo largo de esa banda. Por el contrario la banda
centrada en la longitud de onda λ1, muestra una variación importante en la lectura de
absorbancia a lo largo de la banda. Concretamente, para tener un pequeño error debemos
elegir una longitud de onda ubicada en una región plana del espectrograma correspondiente
a fin de minimizar este error instrumental.
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2- Sistema óptico necesario para seleccionar una determinada longitud de onda (colimador,
monocromador, selector de longitud de onda).
3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe ser de vidrio
o de plástico; para UV de cuarzo). Muchas veces al camino óptico (b) se lo denomina
ancho de la cubeta.
4- Detector (Fototubo).
1- 2- 3- 4- 5-
Figura 10- Representación esquemática de los componentes del Espectrofotómetro.
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
Figura 12- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación
asociada que es la que figura en el gráfico. R2 es un control estadístico de la curva de
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible.
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
ε (λ): coeficiente de absortividad molar a esa misma longitud de onda (L x mol-1 x cm-1)
b: camino óptico (cm)
c: concentración (M (mol x L-1)
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Con los datos obtenidos se podrá graficar la curva de calibración que utilizaremos
para transformar los datos de absorbancia medidos en muestras desconocidas en sus
valores correspondientes de concentración del analito.
Procedimiento:
Para la curva de calibración: rotular una serie de tubos de 15 mL de plástico
(denominados tipo Falcon), con los siguientes números: 0, I, II, III, IV, V
En cada tubo colocar los siguientes reactivos:
Tubo Volumen de Patrón Volumen de Volumen de Volumen final
+3
Fe 0,5 mM (ml) HCl (ml) KSCN (ml) (ml)
0 0 5 2,5 7,5
I 0,5 4,5 2,5 7,5
II 1 4 2,5 7,5
III 1,5 3,5 2,5 7,5
IV 2 3 2,5 7,5
V 2,5 2,5 2,5 7,5
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calibración. Si alguna muestra presenta un valor de absorbancia por encima del rango de la
curva de calibración, debe ser diluída y se debe repetir la medida con la muestra diluída. El
dato de la dilución realizada debe tenerse en cuenta en el momento de realizar los cálculos
correspondientes. Los resultados obtenidos deben expresarse como mg de Fe /kg de
harina.
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Señal de emisión = k x c
k: es la constante de proporcionalidad.
c: concentración del analito cuya emisión se mide en el Fotómetro de llama.
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Pensemos los 6 pasos para una muestra de salmuera diluida (agua con sal NaCl) en la que
queremos determinar el contenido de sodio por fotometría de llama:
1- Pequeñas gotitas de agua sobre la llama.
2- Evaporación del agua dejando un residuo de sal (NaCl) seca.
3- La sal se funde, pasa al estado líquido y luego el líquido se evapora.
4- Se forma vapor atómico: átomos de Na y átomos de Cl en estado de vapor.
5- Los átomos de sodio que poseen un electrón en su capa de valencia, se excitan
fácilmente pasando el electrón a un estado de mayor energía (átomos de sodio excitados).
6- Los átomos de sodio en estado de vapor y excitados vuelven al estado
fundamental emitiendo luz de 589 nm (línea amarilla del sodio).
La temperatura lograda define para qué tipo de analitos podemos utilizar la técnica. La
llama lograda en el FOTÓMETRO DE LLAMA es de temperatura relativamente baja,
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por lo tanto sólo permite analizar analitos cuyos átomos tengan pocos electrones en la capa
de valencia como los elementos del grupo I y II de la tabla periódica, esto hace que sean
fácilmente excitables. Si por el contrario queremos excitar metales que tienen muchos
electrones en su capa de valencia (Fe, Cu, Ni, Pb, As, etc) necesitamos un sistema de
combustión diferente que alcance las temperaturas adecuadas.
ppm Señal de
analito (X) emisión (Y)
0 0
2 22
4 39
6 59
8 74
10 96
Figura 1- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación
asociada que es la que figura en el gráfico. R2 es un control estadístico de la curva de
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible.
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Métodos espectrofotométricos- Teoría y Práctica
Procedimiento:
1- Preparar 500,00 ml de una solución madre de NaCl de 100,00 ppm en Na.
2- Patrones para la curva de calibración de Na.
Se utilizarán patrones de 2,00; 4,00; 8,00 y 10,00 ppm de Na+. Las mismas se prepararán
tomando el volumen correspondiente de la solución madre anterior y llevándolo a 100,00
ml.
3- Medida:
a) encender el equipo
b) Colocar el filtro para sodio
c) Abrir el paso de gas
d) encender la llama
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Bibliografía consultada:
Química Analítica Cuantitativa. R.A. Day y A.L. Underwood. 5ª Ed. Prentice Hall, 1995
Análisis Químico Cuantitativo. Daniel C. Harris. 2ª Ed. Reverté, 2001
Química Analítica. Skoog, West, Holler y Crouch. 7ª Ed. Mc Graw Hill, 2001
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