SESION 4: METODO OPTICO

ESPECTROFOTOMETRÍA

MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
En los métodos espectrofotométricos se mide la intensidad de luz (energía
radiante o radiación electromagnética) para determinar la concentración del analito
presente en una muestra.

Podemos dividir los métodos espectrofotométricos en dos grandes grupos según

qué es lo que medimos para cuantificar al analito:

1- Espectrofotometría de absorción:
En estos casos se mide la Absorbancia (A) del analito, esto es la luz absorbida por el
analito, y esta magnitud se relaciona con la concentración (C).

A∞ c (la absorbancia es directamente proporcional a la concentración)

2- Espectrofotometría de emisión:
En este caso se mide la luz emitida por un analito previamente excitado, la señal
emitida se relaciona con la concentración de la especie que emite luz cuando vuelve
desde un estado excitado (estado de mayor energía al que llegó absorbiendo energía) a
su estado basal (estado de menor energía posible tal como se encuentra naturalmente).

Señal emisión ∞ C (la emisión es directamente proporcional a la concentración)

CONCEPTOS PREVIOS
A) Luz o radiación electromagnética

Dado que los métodos espectrofotométricos se basan en la medición de luz, repasamos

las características de la radiación electromagnética y recordamos a que se denomina
espectro electromagnético.

La Física Clásica define a la luz como una radiación electromagnética y la describe

como una onda trasversal a la dirección de propagación (Figura 1).

Figura 1- Representación gráfica de una

onda electromagnética en tres
dimensiones. La flecha negra representa
la dirección de propagación (dirección
de avance de la onda).

1
Cada onda electromagnética se caracteriza por un conjunto de parámetros que la definen:

1- Longitud de onda (λ): es la distancia que existe entre dos máximos o dos mínimos de
la onda, se mide en unidades de longitud (cm, µm, nm, etc) (Figura 2)

2- Número de onda (ν): corresponde a la recíproca (o la inversa) de la longitud de onda,

se mide en (unidades de longitud) -1: cm-1; nm-1

3- Frecuencia de la onda (ν): representa cuantas veces pasa la onda completa por un
punto fijo en la unidad de tiempo, se mide en Hercios (1 Hz= 1Hertz) que significa la
inversa del segundo siendo 1 Hz = 1/s = s-1

4- Amplitud de la onda (A): se mide desde la línea de avance hasta el máximo de la

onda (Figura 2).

Figura 2- Representación bidimensional de una onda electromagnética. El eje vertical puede ser el
campo eléctrico o el magnético y el eje horizontal puede ser el tiempo o la distancia.

Los parámetros que caracterizan a una radiación electromagnética están relacionados

entre sí de la siguiente manera:

ν = c/λ
La unidad de medida que se usa para la longitud de onda (λ) depende de la región del
espectro electromagnético en la que se esté trabajando (Figura 3). Si estamos en la
región visible y ultravioleta (las que se usan en los métodos que vamos a estudiar) la
unidad de medida es nm (nanómetros, corresponde a 10-9 metros). La frecuencia (ν) se
mide generalmente en Hertz (1/s) y c es la velocidad de la luz en el vacío, es una
constante cuyo valor es 3 x 108 m/s o 3 x 1010 cm/s

Para utilizar esta relación entre frecuencia y longitud de onda,

las unidades de la constante c definirán en que unidades
utilizaremos los otros parámetros.
A partir de la Física Cuántica, se agregó el concepto de “dualidad onda partícula” y se
comenzó a interpretar a la luz como una onda de “fotones” que se propagan. Dichos
fotones representan paquetes discretos de energía denominados “cuantos”. Con este
nuevo concepto, se interpreta a la luz como una onda que propaga energía y la energía
de la onda (radiación electromagnética) queda definida como:

E=hxν
h: constante de Planck , su valor es 6,63 x 10-34 J.s (J: Joules; J=kg·m2/s2)

Si recordamos que, ν = c/λ, podemos reemplazar en la expresión de energía:

E = h x c/λ
En esta expresión podemos observar claramente que cuanto mayor es la frecuencia de la
luz mayor será su energía y que cuanto mayor sea la longitud de onda menor será la
energía:

A mayor ν → mayor energía

A mayor λ → menor energía

B) ¿Qué es el espectro electromagnético?

Una fuente de luz, por ejemplo el sol y las lámparas eléctricas, emiten un amplio
espectro de radiaciones electromagnéticas, es decir que emiten luz de diferentes
longitudes de onda: Espectro electromagnético (Figura 3).

Figura 3. Representación esquemática del espectro electromagnético.

 Aquellas longitudes de onda que corresponden al rango entre 400-700 nm
pertenecen a lo que se denomina región visible del espectro ya que estas longitudes de
onda afectan nuestra retina y provocan que observemos colores. Además de la región
visible existen en el espectro electromagnético longitudes de onda a las que nuestra
retina no es sensible: por encima de la región visible se encuentra la región Infrarroja (λ
mayores a 700 nm) y por debajo de la región visible se encuentra la región Ultravioleta
(λ menores que 350 nm).

Como ya hemos mencionado, la energía de una radiación electromagnética es

inversamente proporcional a su longitud de onda (E = h x c/λ), por lo tanto los rayos
visibles tienen menor energía que los ultravioleta, pero mayor energía que los
infrarrojos.
Por ejemplo, pensemos el siguiente concepto de cultura general: debemos cuidarnos de
los rayos UV. Los rayos ultravioletas son perjudiciales para nosotros en comparación
con los rayos de la región visible o infrarroja. Las longitudes de onda de la región
ultravioleta son pequeñas (<350 nm), lo que significa alta frecuencia y alta energía.

C) Interacciones de los analitos (átomos y moléculas) con la luz.

¿Qué sucede cuando un átomo absorbe energía lumínica?: ÁTOMO EXCITADO.

Cuando un átomo absorbe energía lumínica en una cantidad adecuada se

producen transiciones electrónicas, esto quiere decir que los electrones que están en su
condición de menor energía posible (estado fundamental) pasan a un estado de mayor
energía (estado excitado) que resulta inestable y rápidamente buscarán la manera de
volver al estado fundamental.

Para comprender estos conceptos es necesario realizar un repaso de la estructura

atómica estudiada en Química General e Inorgánica. Dentro de un átomo, los
electrones ocupan niveles discretos de energía (concepto que deriva de la teoría
cuántica) y para pasar de un estado a otro de mayor energía deben absorber
cantidades determinadas de energía denominadas cuantos. Podemos recordar
que los electrones ocupan orbitales(s, p d, etc) y que en cada orbital podemos
REPASO

ubicar como máximo dos electrones apareados. Los niveles de energía dentro
del átomo los denominábamos 1,2, 3, etc y a medida que aumenta el nivel de
energía, mayor es el número de orbitales presentes en cada nivel así, el primer
nivel sólo tiene 1 orbital (1s) el segundo nivel posee 4 orbitales (2s; 2p; 2p; 2p)
y así sucesivamente. También podemos recordar que de acuerdo a la posición
de un átomo en la tabla periódica podíamos deducir la estructura electrónica del
mismo. Por ejemplo pensemos en el átomo de Na, que tiene número atómico 11,
es del período 3 y del grupo I. Esto quiere decir que tiene 11 electrones en total,
los que ocupan hasta el tercer nivel de energía electrónica y que tiene 1 sólo
electrón en el último nivel: 1s2; 2s2 y 2p6; 3s1

Una vez que hemos recordado la estructura interna del átomo y donde se ubican
los electrones, ahora podemos comprender que cuando los electrones dentro del átomo
absorben una cantidad de energía adecuada pueden pasar de un nivel energético a otro
de
mayor energía (Figura 4). El resultado de esta transición es un átomo excitado que
resulta inestable y rápidamente buscará la manera de regresar al nivel de menor
energía eliminando el exceso de energía de alguna manera (liberando calor o emitiendo
luz) (Figura

4): PROCESO DE RELAJACIÓN.

Figura 4- Representación esquemática de los niveles de energía en un

átomo. E0, E1 y E2 representan los niveles electrónicos, E0
corresponde al nivel fundamental y los otros niveles son de mayor
energía. Para simplificar el esquema no se dibujaron los niveles
energéticos de cada uno de los orbitales (s, p, etc) dentro de cada nivel
energético. La flecha negra representa un salto electrónico entre el
nivel fundamental y el primer nivel excitado. La flecha gris indica el
regreso al estado fundamental. La diferencia de energía entre los
niveles son cantidades discretas de energía (determinados valores de
hν).

¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía lumínica? : MOLÉCULA

EXCITADA

Una molécula está formada por la unión entre átomos, estas uniones no son
estáticas ya que permanentemente vibran y rotan. Las uniones entre átomos se deben a
enlaces entre sus electrones externos. Por lo tanto cuando hablamos de la energía interna
(E) de una molécula estamos hablando de tres componentes: E rotacional, E vibracional
y E electrónica.
Tomando en cuenta esta estructura interna de una molécula tenemos que pensar
que los electrones dentro de la molécula tendrán determinado nivel energético de
vibración y de rotación además de su nivel electrónico (Figura 5).

Figura 5- Representación esquemática de los niveles de

energía en una molécula: electrónicos (E0, E1);
vibracionales (0, 1, 2, 3) y rotacionales (0, 1, 2). Para
simplificar el esquema los niveles rotacionales se dibujaron
sólo en el nivel electrónico E0, pero este esquema se repite
en todos los niveles energéticos. Los niveles de energía
rotacional están separados entre sí por baja energía, los
niveles de energía vibracional están separados entre sí por
energía media y niveles electrónicos están separados entre sí
por mayor energía. La excitación en la molécula puede ser
sólo rotacional (flecha gris clara) vibracional (flecha gris
más oscura) o electrónica (flecha negra).

La separación entre los niveles de energía estará dada por cantidades discretas de
energía, es decir “cuantos” de energía (E = h x ν). Esto quiere decir que para que un
electrón pase de un nivel energético a otro dentro de la molécula debe absorber
cantidades discretas de energía. La transición electrónica será la que alcance según la
energía absorbida,
pero es un hecho que si la energía fue suficiente para hacer un salto electrónico, fue más
que suficiente para hacer saltos vibracionales y rotacionales ya que son de menor
energía.
Las moléculas excitadas son inestables al igual que los átomos, por lo tanto también buscarán
la manera de regresar a su nivel de menor energía posible liberando calor o emitiendo luz:

PROCESO DE RELAJACIÓN.

La energía de la radiación de microondas alcanza sólo para transiciones rotacionales.

La energía de la radiación infrarroja alcanza para las transiciones vibracionales y
rotacionales. La energía de las radiaciones visible y UV alcanza para producir
transiciones electrónicas,
vibracionales y rotacionales.

PREGUNTAS Y PROBLEMAS SOBRE LOS CONCEPTOS PREVIOS

1- ¿Qué es una radiación electromagnética?

2- Definir los parámetros ondulatorios de la radiación
electromagnética. 3- ¿Cómo están relacionados la energía y la
longitud de onda?
4- ¿A qué se llama radiación monocromática?
5- Ordene las regiones visible, infrarrojo y ultravioleta del espectroelectromagnético
según la Energía que poseen y justifique.
6- A)Calcular la longitud de onda () en cm y en nm correspondiente a cada una de las
siguientes frecuencias: a) 1,97×1091/s, b) 4,86×10151/s, c) 7,32×10191/s y d)
1,42×10231/s
B) Calcular la frecuencia (υ) en 1/s correspondiente a cada una de las siguientes
longitudes de onda: a) 200 nm, b)15 Å, c) 1,50×10-6 cm y d) 6,10μm
7- ¿Qué sucede cuando una molécula absorbe energía? ¿Qué sucede cuando un átomo
absorbe energía?
8- ¿Qué significa excitación y relajación de los analitos?
 I- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
MOLECULAR UV-VISIBLE

II- ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA:

FOTOMETRÍA DE LLAMA
 I- ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
UV-VISIBLE

En esta espectrofotometría el equipo que se utiliza se denomina

ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE, es un instrumento que mide la
ABSORBANCIA de una solución. Por lo tanto para medir la concentración de un
analito por este método es necesario que el analito (o un producto de reacción del
analito) tenga la propiedad de absorber radiación electromagnética (luz) en la región del
UV-visible.

¿Qué significa que el analito absorbe luz?

Significa que cuando un haz de luz incide sobre la solución del analito, éste absorbe
energía la que utiliza para pasar de su estado basal de energía (el más bajo, estado
fundamental) a un estado excitado (de mayor energía).

Energía absorbida por átomos = E de transiciones electrónicas

Energía absorbida por moléculas = E de transiciones rotacionales, vibracionales y

electrónicas.

1- DEFINICIÓN DE ABSORBANCIA

Cuando un haz de luz monocromática, es decir de una determinada longitud de

onda, atraviesa una solución que contiene una especie absorbente, la intensidad (o la
potencia) de la radiación disminuye como consecuencia de la absorción de energía por
parte de las especies absorbentes presentes en la solución (Figura 6 ).

Figura 6- Dibujo que representa un haz de luz monocromática que incide en una solución
que absorbe dicho haz. P0: potencia de la luz incidente y P: potencia luego de atravesar la
muestra

Se define TRANSMITANCIA de una solución a la fracción de luz que deja pasar dicha
solución:

T= P/P0
Se define la ABSORBANCIA de la solución a partir de la trasmitancia de la solución
como:
A = -log T
 De las expresiones matemáticas podemos deducir que cuanto mayor es la A
menor será la T, es decir que si una solución absorbe mucho, transmitirá poco. Podemos
observar además que de acuerdo a la definición de T y A, ambas propiedades son
adimensionales, ya que se definen a partir de un cociente de la misma magnitud (P/P0).

2- ¿CÓMO SE RELACIONA LA MEDIDA DE ABSORBANCIA CON LA

CONCENTRACIÓN DEL ANALITO?

ECUACIÓN DE LAMBERT Y BEER

Cuando un haz de luz monocromática (de determinada longitud de onda) atraviesa una
solución, la ABSORBANCIA es directamente proporcional a la distancia recorrida por la luz
atravesando la solución absorbente y a la concentración del analito en la solución. La distancia
recorrida por la luz atravesando la solución se denomina camino óptico y se mide generalmente
en cm (Figura 7).

P0 P

Figura 7- Esquema que representa el fenómeno que describe la ley de Lambert y Beer. P0
es la potencia de la luz monocromática incidente; P es la potencia de la luz luego de
atravesar la solución de concentración c y b es el camino óptico.

A = ε xb xc

A: absorbancia, adimensional.
ε: coeficiente de extinción molar ó absortividad molar, se define como la unidad de
absorbancia por unidad de concentración y por unidad de longitud de la trayectoria de
luz; es una constante definida que depende de la solución y la longitud de onda, en
general su unidad es la inversa de la molaridad por la inversa de cm, es decir (M x cm) -1
ó L/mol x cm b:es el camino óptico, en general se mide en cm.
c: es la concentración del analito expresada en molaridad (M).
 Dado que la Absorbancia y la absortividad molar dependen de la longitud de
onda de la luz incidente, muchas veces se expresa la ecuación de Lambert y Beer como
una función de la longitud de onda:

A (λ) = ε (λ) x b x c
Con cierta frecuencia se utiliza como constante de proporcionalidad en la Ley de
Lambert y Beer la absortividad específica (a) en lugar de la absortividad molar. Las
unidades de la absortividad específica son (L/g x cm) y por lo tanto en este caso la
concentración del analito se debe expresar en g/L.

A = a xb xc
La ley de Lambert Beer es una ley límite, es decir que sólo se cumple
en determinadas condiciones: luz monocromática y soluciones
diluidas.

Representación gráfica de la Ley de Lambert y Beer.

La Figura 8 representa la Absorbancia medida a una determinada longitud de

onda en función de la concentración de analito.

Podemos observar que la representación gráfica de la ley de Lambert y Beer es

una recta. En el eje de las ordenadas (eje Y) se representan los valores de A y en el eje
de las abscisas (eje X) se representan las concentraciones del analito. La pendiente de la
recta corresponde al producto ε x b.
Desviaciones de la ley de Lambert Beer (¿por qué se pierde la
linealidad entre la A y c?)

1- Si la solución del analito es concentrada (en general mayor a 0,010 M) se pierde la

relación lineal entre la A y la c, las moléculas muy próximas entre si comienzan a
interferir entre ellas en el proceso de absorción de energía. Decimos que la recta se
“plancha” a altas concentraciones.
2- Desviaciones químicas:
Se pierde la relación lineal entre A y c cuando existen interferencias en la solución, tales
como: - asociación o disociación del analito en solución
- reacciones del analito con el solvente
- presencia de otros componentes en la muestra que también absorben luz incidente.
3- Desviaciones instrumentales:
La ley de Lambert-Beer se aplica usando luz monocromática. Sin embargo en la
práctica, el espectrofotómetro utiliza una fuente policromática de luz y mediante un
sistema óptico adecuado (una red de difracción o un filtro) se selecciona un segmento de
longitudes de onda centrado en la que se desea utilizar, a este segmento se lo denomina
“banda”. Por este motivo es muy importante elegir adecuadamente la longitud de onda
de trabajo. Para ello se utiliza el ESPECTROGRAMA o ESPECTRO DE
ABSORCION que es un gráfico, característico para cada analito, en el que se grafican
las absorbancias del analito en función de la longitud de onda incidente (Figura 9).

Figura 9- Representación de un
ESPECTROGRAMA o
ESPECTRO de ABSORCIÓN
de un analito. A es la banda de
longitudes de onda centrada en
λ1 y B es la banda de longitudes
de onda centrada en λ2.

λ λ
1 2

Si analizamos la banda centrada en la longitud de onda λ2, vemos que no habrá gran
variación en la lectura de absorbancia a lo largo de esa banda. Por el contrario la banda
centrada en la longitud de onda λ1, muestra una variación importante en la lectura de
absorbancia a lo largo de la banda. Concretamente, para tener un pequeño error
debemos elegir una longitud de onda ubicada en una región plana del espectrograma
correspondiente a fin de minimizar este error instrumental.
3- COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO UV-VIS

1- Fuente de luz policromática (para el visible lámpara de Tungsteno y para UV lámpara

de deuterio).

2- Sistema óptico necesario para seleccionar una determinada longitud de onda

(colimador, monocromador, selector de longitud de onda).

3- Cubeta (recipiente donde se coloca la muestra a medir, para el visible debe ser de
vidrio o de plástico; para UV de cuarzo). Muchas veces al camino óptico (b) se lo
denomina ancho de la cubeta.

4- Detector (Fototubo).

5- Procesador y lector de la señal.

1- 2- 3- 4- 5-
Figura 10- Representación esquemática de los componentes del Espectrofotómetro.

4- ¿CÓMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE UN

ANALITO UTILIZANDO LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
MOLECULAR UV-VIS?

4.1- Utilizando la ley de Lambert y Beer

Se aplica cuando se conoce el valor del coeficiente de Absortividad Molar para
el analito que queremos cuantificar a la longitud de onda de trabajo y en la solución
utilizada (datos de bibliografía). En estos casos medimos la absorbancia de la muestra a
analizar y utilizando la Ley de Lambert Beer podemos despejar el valor de la
concentración. Esta modalidad de trabajo es la que se utiliza para medir pigmentos en
extractos vegetales o productos agroindustriales.
4.2- Utilizando el procedimiento de la curva de calibración
Se aplica cuando los valores del coeficiente de Absortividad Molar no se conoce
y en los casos en los que se necesita realizar una reacción previa para lograr que el
analito se transforme en una especie absorbente. En la práctica generalmente el analito
no absorbe luz visible, pero es fácil transformarlo en una especie absorbente mediante
una reacción previa que lo transforme en un compuesto coloreado (por lo tanto que
absorbe en el visible).
En este procedimiento es necesario preparar una serie de soluciones de
concentración conocida del analito que queremos cuantificar, hacer la reacción previa
para generar el compuesto absorbente y luego medir la ABSORBANCIA de estas
soluciones coloreadas en el ESPECTROFOTOMETRO UV-Vis. Tendremos entonces
una tabla de datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que
podremos representar en un gráfico de ejes cartesianos. En el eje de las X se representan
las concentraciones conocidas de las soluciones y en el eje de las Y se representan las A
medidas en el equipo (Figura 12).

Tabla de datos conocidos

(pares x,y)

ppm Abs λx
analito
0 0
2 0,0234
5 0,0578
8 0,0943
10 0,1443
15 0,1968

Figura 12- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación
asociada que es la que figura en el gráfico. R 2 es un control estadístico de la curva de
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible.

La recta de calibración (curva de calibración) obtenida será nuestra referencia

para transformar la medida de A de cualquier muestra desconocida en un valor de
concentración para el analito. Podemos hacerlo gráficamente (interpolando el valor de A
medido en la gráfica) o bien despejando el valor de X que le corresponde a la medida Y
(A), en la ecuación de la recta de calibración obtenida.

Se utilizarán las dos formas de trabajo al resolver los

problemas del cuestionario y en el trabajo
práctico de laboratorio.
5- APLICACIONES DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN
MOLECULAR UV-VISIBLE.

5.1- Seguimiento de la maduración de un fruto a través

de la medida del contenido de pigmentos:
Cuantificación de clorofilas, carotenoides y
antocianinas.

5.2- Seguimiento de la senescencia foliar que

acompaña a la etapa de llenado de los granos a través
de la medida de pigmentos y proteínas en las hojas.

5.3- Análisis de la calidad de granos para diversos

usos: determinación del contenido de hidratos de
carbono y de proteínas.

5.4- Determinación de compuestos nitrogenados y

cloro libre en agua
potable y en aguas
residuales.

5.5- Determinación del contenido de fósforo en un

fertilizante o en suelo.
6- TRABAJO PRÁCTICO EN EL LABORATORIO
Determinación del contenido de hierro en
harinas por espectrofotometría de absorción
molecular
6.1- Funciones fisiológicas del Hierro

El déficit de hierro (Fe) es un problema frecuente en

la dieta humana. Es un elemento que cumple importantes
funciones fisiológicas en nuestro organismo: forma parte de
la hemoglobina (proteína transportadora de oxígeno ubicada
en los glóbulos rojos) y es un componente estructural de la
mioglobina (proteína muscular). El déficit de hierro en la
dieta provoca Anemia Ferropénica, enfermedad muy común
en niños con baja calidad alimentaria, y en las futuras madres
durante las últimas semanas de embarazo ya que aumenta
la demanda de
hierro. El aporte mínimo de Fe recomendado es de 10 a 15 mg/día. Las principales
fuentes de hierro son: carnes, hígado, verduras de hoja, cereales integrales, frutos secos
y levaduras. Con el fin de contribuir a disminuir la frecuencia de la Anemia Ferropénica
en Argentina, en el año 2002, se sancionó la ley 25630 que establece el
enriquecimiento de las harinas con Fe, ácido fólico y vitaminas del grupo B. Por
dicho motivo, las harinas y los productos elaborados con ellas (galletitas, fideos, etc.)
están enriquecidos en Fe. Además, algunas industrias alimentarias han incorporado el
agregado de Fe en sus formulaciones como un “valor agregado” para sus productos.
En la actualidad, es frecuente encontrar leche fortificada en Fe. Por lo tanto, en la
industria alimentaria la determinación de Fe para
rotular los alimentos se ha transformado en un análisis de rutina.
En cuanto a las plantas, el hierro también es
un elemento muy importante que forma parte de los
citocromos, moléculas que intervienen en funciones
vitales como la respiración y la fotosíntesis. El Fe
participa de muchas reacciones de óxido-reducción
involucradas en procesos metabólicos de las plantas
que se llevan a cabo en mitocondrias, cloroplastos y
peroxisomas. Este elemento es uno de los
denominados micronutrientes para las plantas, es
decir que es necesario en pequeñas cantidades pero
dado que cumple funciones indispensables para la
vida no debe estar ausente. El Fe es un ión poco
móvil dentro de la
planta, por lo que la deficiencia de Fe en plantas se Aumenta la deficiencia de hierro
pone en evidencia en las hojas jóvenes pequeñas y
cloróticas (se ven amarillas o blancas).

6.2- Medida de la concentración de Fe en alimentos y plantas

Uno de los métodos de referencia para la determinación de Fe en alimentos,

plantas y suelos es Espectrofotometría de absorción molecular en la región del
visible. El fundamento del método es la reacción, en medio clorhídrico, entre el ión
férrico (Fe +3)
y el ión tiocianato (SCN-1) para formar Hu complejo soluble rojo denominado
tiocianato férrico: nCl
 Fe+3 + 6 SCN- Fe (SCN)6 -3
El equilibrio de esta reacción se desplaza hacia la formación del complejo rojo
en presencia de un exceso de ión tiocianato. Las posibles interferencias de esta reacción
corresponden a iones que normalmente están ausentes o en cantidades muy pequeñas
(trazas) en los alimentos por lo que este método resulta específico. Las condiciones de
reacción utilizadas deben ser tales que el ión Fe+3 sea el reactivo limitante ya que en
estas condiciones la cantidad de complejo coloreado que se forma estará determinada
por el contenido de Fe+3. En estas condiciones la medida de la absorbancia a una
determinada longitud de onda (luz monocromática) y la concentración del complejo
tiocianato férrico se relacionan de acuerdo a la ley de Lambert Beer:
A (λ)= ε (λ) x b x c
A (λ): absorbancia a determinada longitud de onda (adimensional)

ε (λ): coeficiente de absortividad molar a esa misma longitud de onda (L x mol-1 x cm-1)
b: camino óptico (cm)
c: concentración (M (mol x L-1)

Para realizar esta determinación, la muestra debe ser acondicionada previamente.

El procedimiento general consiste en secar la muestra en estufa a 60 °C hasta perder la
humedad (peso constante). Luego se pesa en balanza analítica una cantidad determinada
de la muestra seca y se reduce a cenizas en una mufla a 500 °C durante 2 h. Las cenizas
obtenidas se disuelven en HCl 0,3 N y se llevan a un volumen final de 100 mL con agua
destilada. La solución clorhídrica de las cenizas de la muestra será utilizada para realizar
la medida espectrofotométrica del Fe+3.

6.3- Actividades en el laboratorio

Se analizará el contenido de Fe de una muestra de harina
para definir si cumple con la ley 25630, para lo cual el contenido
de Fe debe ser por lo menos 30 mg de Fe cada 100 g de harina.
Recibimos una solución de cenizas de harina, la que fue
preparada de la siguiente manera: 3 g de harina seca se calcinaron
en una mufla a 500 °C durante 2 h, las cenizas obtenidas se
disolvieron en HCl y se llevaron a un volumen final de 100 mL.
Para determinar el contenido de Fe en la muestra de
harina, una porción adecuada de esta solución clorhídrica de
cenizas, donde se encuentra el analito (Fe+3), se hará reaccionar
con el tiocianato en medio clorhídrico para obtener el complejo
coloreado tiocianato férrico cuya absorbancia será medida a una
determinada longitud de onda.
Ahora bien, para transformar la lectura de absorbancia en concentración del
analito, es necesario realizar primero lo que se denomina CURVA de CALIBRACIÓN.
Para ello se preparan soluciones del analito (Fe +3) de concentración conocida, las que se
utilizan para obtener el complejo coloreado. A continuación se mide en el
espectrofotómetro, para cada concentración conocida de analito la absorbancia del
complejo obtenido a una determinada longitud de onda. En resumen, obtendremos una
serie de pares de valores conocidos (concentración conocida de Fe+3 y su absorbancia
correspondiente). Cuanto mayor sea la concentración de Fe +3 utilizada mayor será la
intensidad del color obtenido y por lo tanto mayor la absorbancia medida en el
espectrofotómetro.
 Con los datos obtenidos se podrá graficar la curva de calibración que
utilizaremos para transformar los datos de absorbancia medidos en muestras
desconocidas en sus valores correspondientes de concentración del analito.

Materiales y reactivos necesarios:

7 tubos de plástico tipo Falcon para realizar la curva de calibración y 1 tubo
extra para cada muestra que se va a analizar; gradilla porta tubos; 1 bureta cargada con
solución patrón 0,0005 M (0,5 mM) de Fe+3; 1 bureta cargada con solución 1,5 M
KSCN ; 1 bureta cargada con solución 2 M de HCl.

Procedimiento:
Para la curva de calibración: rotular una serie de tubos de 15 mL de plástico
(denominados tipo Falcon), con los siguientes números: 0, I, II, III, IV, V
En cada tubo colocar los siguientes reactivos:
Tubo Volumen de Patrón Volumen Volumen de Volumen
Fe+3 0,5 mM (ml) de KSCN (ml) final
HCl (ml) (ml)
0 0 5 2,5 7,5
I 0,5 4,5 2,5 7,5
I 1 4 2,5 7,5
I
I 1,5 3,5 2,5 7,5
I
I
I 2 3 2,5 7,5
V
V 2,5 2,5 2,5 7,5

De manera similar se procederá con las muestras desconocidas (muestras de

harina a analizar). Para ello se rotularán adecuadamente tubos de plástico tipo Falcon y
se agregarán los siguientes reactivos:
Tubo Volumen de solución de cenizas Volum Volum Volum
correspondiente (ml) en de en de en
HCl KSCN final
(ml) ( (ml)
ml
)
M1 5 0 2,5 7,5
M2 5 0 2,5 7,5

Esperar 15 min y medir la absorbancia del complejo obtenido a la longitud de

onda adecuada.
Para elegir la longitud de onda de medida, se utiliza una de las soluciones
coloreadas obtenidas para realizar la curva de calibración, por ejemplo el tubo II o III.
Se obtiene el espectro de absorción (espectrograma) en el espectrofotómetro y en
base al espectro de absorción obtenido se define la longitud de onda que utilizaremos
para cuantificar. Una vez que el espectrofotómetro se “setea” en la longitud de onda
seleccionada, con la solución 0, se pone el espectrofotómetro en lectura de absorbancia
0 y luego se mide la absorbancia de las soluciones restantes (0, I, II, III, IV, V).
Con los datos obtenidos se armará una tabla de
pares de valores (x,y) = (concentración de Fe+3; Abs) y se
realizará un gráfico en papel milimetrado para obtener la
CURVA DE CALIBRACIÓN. Ésta será la herramienta
que utilizaremos para transformar cualquier dato de
absorbancia en concentración de analito.

A continuación se miden las muestras

desconocidas, verificando que los valores de absorbancia
obtenidos estén comprendidos en el rango de valores de la
curva de
calibración. Si alguna muestra presenta un valor de absorbancia por encima del rango de
la curva de calibración, debe ser diluída y se debe repetir la medida con la muestra
diluída. El dato de la dilución realizada debe tenerse en cuenta en el momento de
realizar los cálculos correspondientes. Los resultados obtenidos deben expresarse como
mg de Fe /kg de harina.

7- PROBLEMAS Y CUESTIONARIO PARA RESOLVER SOBRE LOS

CONCEPTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN MOLECULAR UV-VIS.

1- Calcular la absorbancia que corresponde a cada valor de transmitancia

porcentual: a) 20%, b) 35,3 %, c) 75,5 %, d) 4,5 % y e) 100%
Rta.: a) 0,69, b) 0,452; c) 0,122; d) 1,346 y e) 0,00
2- Dados los valores de absorbancia, calcular las transmitancias porcentuales
correspondientes a cada uno: a) 0,60, b) 0,177, c) 0,472 y d) 1,346. Rta: a) 25,12; b)
66,53; c)
33,73 y d) 4,51
3- Calcular la absorbancia que corresponde a cada valor de transmitancia porcentual: a)
36,8%, b) 22,0 %, c) 82,3 % y d) 4,2 %. Rta.: a) 0,434; b) 0,657; c) 0,084 y d) 1,376
4- Calcular la T% que corresponde a cada uno de los siguientes valores de absorbancia:
a) 0,800, b) 0,115, c) 0,585 y d) 0,057. Rta.: a) 15,84; b) 76,73; c) 26,00 y d) 4,20
5- En una determinación fotométrica, el instrumento dio una T% de 24,7 usando una
cubeta de 5 cm de camino óptico. ¿Cuál será la T% de la misma solución si se usan
celdas de: a)1,00 cm, b) 10,00 cm y c)1,0 mm? Rta.: a) 75,61; b) 6,10 y c) 97,24
6- Una solución 0,0500 M, cuyo soluto tiene un peso molecular de 230, da una lectura
de transmitancia de 35 % cuando se usa una cubeta de 1 cm de camino óptico y una
longitud de onda de 270 nm. Calcular la absortividad (a). Rta.: 0,0396 g l-1cm-1
7- Calcular la molaridad de una solución, si la absortividad molar es de 1,27 M -1cm-1.
La absorbancia leída de la muestra es de 0,140 a 450 nm y el camino óptico de la cubeta
es de 5 cm. Rta.: 0,0220M
8- Calcular la absortividad de una solución al 0,25% m/v que da una lectura de
absorbancia de 0,180 a 615 nm, el peso molecular es 60 y el espesor de la cubeta es de 2
cm. Rta.: 2,15
9- Una solución de concentración 0,004% m/v tiene una transmitancia del 57% cuando
se lee a 550 nm, usando una cubeta de 5 cm. El PM del soluto es 100. Calcular la
absortividad molar. Rta.: 122
10- En una cubeta de 2 cm de espesor se colocan 5 g (microgramos) de soluto en 5 ml
de solución. La absortividad molar de 5000 M-1cm-1, la medida se efectúa a 640 nm y el
peso molecular del soluto es 22. Calcular la transmitancia porcentual a esa longitud de
onda.
Rta.: 35,11 %
11- Un fotómetro portátil, de respuesta lineal a la radiación registró un valor de 84,2 A
con una solución del blanco en la trayectoria de la luz. Al reemplazar el blanco por una
solución absorbente dio una respuesta de 23,9 A. Calcular: a) la transmitancia
porcentual,
b) la absorbancia, c) la transmitancia esperada para una solución en la que la
concentración de la especie absorbente es la tercera parte de la correspondiente a la
solución original de muestra y d) la transmitancia esperada para una solución cuya
concentración es el doble de la correspondiente a la solución original de muestra. Rta.:
28,38; b) 0,547; c) 0,657 y d) 0,080
12- Una serie de soluciones patrón del complejo Fe(II)-1,10-fenantrolina se midieron a
510 nm obteniéndose las siguientes lecturas de absorbancia cuando se empleó una
cubeta de 1,00 cm.
Concentración de 2,00 5,00 8,00 12,00 16,00 20,00
Fe(II)-
1,10-fenantrolina en
mM
Absorbancia 0,1 0,42 0,6 0,9 1,2 1,5
510nm 64 5 28 51 60 82

Construir la curva de calibración a partir de estos datos.

El método anterior se aplicó a la determinación rutinaria de hierro en alícuotas de 25,00
ml de aguas naturales que se diluyeron a 50,00 ml antes de llevar a cabo las medidas
espectrofotométricas a 510 nm. Determinar la concentración (en mM de Fe) de muestras
que dieron los siguientes datos de absorbancia: a) 0,107, b) 0,721 y c)1,538. Rta.: a)
2,36 mM; b) 18,08 mM y c) 38,98 mM.
13- Se hace una determinación espectrofotométrica de una sustancia en solución. Se
realizan dos lecturas, la primera con una cubeta de 1 cm de espesor obteniéndose una
transmitancia de 35 %; la segunda lectura se realiza usando una cubeta de 2 cm de
espesor. Calcular la transmitancia porcentual (T%) de ésta última medida. Rta.: 12,25
14- ¿Cuál es la absorbancia de una solución 0,0500M si la cubeta de medida tiene 1 cm
de camino óptico, el peso molecular del soluto es 130, la absortividad molar es de 1,60
lmol- 1cm-1 y la lectura se efectúa 280 nm? Rta.: 0,08
15- Calcular la concentración en moles por litro de una solución que tiene una
absortividad molar de 1,39 lmol-1cm-1 a 533 nm y que leída en cubeta de 2,00 cm da
una absorbancia de 0,167. Rta.: 0,0600 M
16- Una solución 0,00005 % m/v de un soluto de peso molecular 120, transmite 68 % de
luz de 533 nm cuando se mide en una cubeta de 2,00 cm. Calcular la absortividad
molar.
Rta.: 20072 l mol-1cm-1
17- Una solución de un compuesto de peso molecular 215, cuya concentración es
0,0010 M, se midió en una cubeta de 1,5 cm obteniéndose una lectura de 18,4 % T a
470 nm. Calcular la absortividad y la absortividad molar.Rta.: a)3,42 l g-1 cm-1 y b) 490 l
mol-1 cm1
18- La absortividad molar de una sustancia es 6,22103 lmol-1cm-1. En una cubeta de
1,05 cm de espesor se colocaron 3 ml de una solución que contenía 0,2 moles.
Calcular la T% a 340 nm. Rta.: 36,67
- CUESTIONARIO
1- ¿A qué se denomina transmitancia (T) de una
solución? 2- ¿A qué se denomina absorbancia de una
solución?
3- ¿Qué expresión matemática relaciona la transmitancia y la absorbancia?
4- Enuncie y explique la ley de Lambert-Beer. ¿Cuáles son las limitaciones de la ley de
Lambert-Beer?
5- ¿Qué es un espectro de absorción y para qué se utiliza?
6- ¿Qué criterio emplea para seleccionar la longitud de onda óptima para efectuar una
determinación espectrofotométrica?
7- ¿Cuáles son los componentes más importantes de un espectrofotómetro de
absorción molecular UV-Vis?
8- ¿Cómo puedo obtener luz monocromática a partir de una fuente de luz policromática?
9- ¿De qué material deben estar construidos los recipientes que contienen la muestra es
decir las cubetas del espectrofotómetro?
10- ¿Cómo puede determinar experimentalmente la concentración de una solución por
espectrofotometría?
II- ESPECTROFOTOMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA:
FOTOMETRÍA DE LLAMA
***Se recomienda repasar los conceptos previos que están en el comienzo de la guía de los métodos
espectrofotométricos.

La espectroscopia de emisión atómica es un método analítico basado en la

medida de la luz emitida por átomos o iones de un elemento que se encuentran en estado
de vapor. A temperatura ambiente, todos los átomos se encuentran en el estado de
menor energía posible, esto es su estado fundamental. La excitación de los átomos en
estado de vapor puede realizarse de diferentes maneras, en el caso particular de la
técnica FOTOMETRÍA DE LLAMA, la excitación se logra mediante el calor de una
llama (energía térmica). El tiempo de vida del átomo excitado es breve y rápidamente
vuelve al estado fundamental emitiendo luz de una longitud de onda característica
(fotón: h c/λ). La señal de emisión que se mide en el FOTÓMETRO DE LLAMA es
directamente proporcional a la concentración del átomo que emite.

Señal de emisión = k x c

k: es la constante de proporcionalidad.
c: concentración del analito cuya emisión se mide en el Fotómetro de llama.

1- COMPONENTES DEL FOTÓMETRO DE LLAMA

1- Nebulizador: sistema que toma

la muestra a analizar y la coloca
directamente como pequeñas
gotas sobre la llama a través de un
capilar. 2- Entrada de aire y
entrada de gas natural, ambas
con regulador de presión:
comburente y combustible con el
que se formará la llama.
3- Llama: lugar donde la
muestra pasa por una serie de
procesos que terminarán con la
emisión de luz por parte de los
componentes de la muestra que
logren excitarse.
4- Sistema óptico: es un filtro que
permitirá seleccionar la longitud de onda que llegue al detector; es decir seleccionará de todas
las emisiones que se producen en la llama, aquella que corresponde al analito que queremos
cuantificar. Por ejemplo el Fotómetro de llama que se usará en el práctico tiene un filtro para
medir Sodio, otro para medir Potasio y otro para medir Litio.
5- Detector: fototubo
6- Procesador y lector de la señal.
2- PROCESOS QUE OCURREN EN LA LLAMA

1- Introducción y pulverización de la muestra sobre la

llama. 2-Evaparación del solvente, quedando las sales
secas.
3-Fusión y evaporación de las
sales. 4-Formación de vapor
atómico.
5-Excitación de los átomos en estado de vapor (por absorción de energía
térmica). 6-Emisión de luz cuando los átomos excitados vuelven al estado
basal (relajación).

Pensemos los 6 pasos para una muestra de salmuera diluida (agua con sal NaCl) en la
que queremos determinar el contenido de sodio por fotometría de llama:
1- Pequeñas gotitas de agua sobre la llama.
2- Evaporación del agua dejando un residuo de sal (NaCl) seca.
3- La sal se funde, pasa al estado líquido y luego el líquido se evapora.
4- Se forma vapor atómico: átomos de Na y átomos de Cl en estado de vapor.
5- Los átomos de sodio que poseen un electrón en su capa de valencia, se
excitan fácilmente pasando el electrón a un estado de mayor energía (átomos de sodio
excitados).
6- Los átomos de sodio en estado de vapor y excitados vuelven al estado
fundamental emitiendo luz de 589 nm (línea amarilla del sodio).

¿Qué pasa con los átomos de cloro?

Dado que es un elemento del grupo 7 de la tabla periódica (muchos electrones en
la última capa) el calor de la llama aire-gas natural no es suficiente para excitarlo.

¿Qué pasa si en la muestra hay átomos de potasio y de calcio?

Dado que son del grupo I y II respectivamente en la tabla periódica, estos átomos
también se excitan con la energía de la llama aire-gas natural y emitirán luz para
regresar al estado basal, pero utilizando el filtro adecuado el detector del fotómetro sólo
recibirá la señal del sodio.

3- REQUISITOS QUE DEBE CUMPLIR LA LLAMA

Debe ser una llama de temperatura uniforme y combustión completa. La manera

práctica de controlar que se cumplen estas condiciones es la observación de conos
azules en la llama. Estos se logran mediante la regulación del caudal de combustible
(gas natural) y comburente (aire).
La temperatura que alcanza la llama, y por lo tanto la energía térmica lograda,
depende del sistema de combustión utilizado (tabla).

Combustible Comburente Temperatura

lograda
Gas natural Aire 1700-1900 °C
Gas natural Oxígeno 2700-2800 °C
 Acetileno Oxígeno 3050-3150 °C

La temperatura lograda define para qué tipo de analitos podemos utilizar la técnica. La
llama lograda en el FOTÓMETRO DE LLAMA es de temperatura relativamente
baja,
por lo tanto sólo permite analizar analitos cuyos átomos tengan pocos electrones en la
capa de valencia como los elementos del grupo I y II de la tabla periódica, esto hace que
sean fácilmente excitables. Si por el contrario queremos excitar metales que tienen
muchos electrones en su capa de valencia (Fe, Cu, Ni, Pb, As, etc) necesitamos un
sistema de combustión diferente que alcance las temperaturas adecuadas.

La fotometría de llama es utilizada sólo para

metales alcalinos (grupo I) y alcalino térreos
(grupo II).

4- ¿CÓMO PUEDO DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE UN

ANALITO UTILIZANDO EL FOTÓMETRO DE LLAMA?

En este caso se utiliza el método de la curva de calibración en un procedimiento

similar al que se explicó para el caso de Espectrofotometría de absorción. Se preparan
soluciones de concentración conocida del analito que queremos cuantificar. Las
soluciones preparadas se miden en el Fotómetro de llama, registrando la señal de
emisión correspondiente para cada concentración conocida. Tendremos entonces una
tabla de datos correspondientes a pares ordenados (x,y) conocidos, los que podremos
representar en un gráfico de ejes cartesianos. En el eje de las X se representan las
concentraciones conocidas de las soluciones y en el eje de las Y se representan las
Señales de emisión obtenidas en el equipo (Figura 1).

ppm Señal
analito (X)
de
emisión (Y)
0 0
2 2
2
4 3
9
6 5

Figura 1- Representación gráfica de los datos de la tabla. La recta tiene una ecuación
asociada que es la que figura en el gráfico. R 2 es un control estadístico de la curva de
calibración, debe ser lo más cercano a 1 posible.

La recta de calibración (curva de calibración) obtenida será nuestra referencia

para transformar la Señal de emisión de cualquier muestra desconocida en un valor de
concentración para el analito estudiado. Podemos hacer la transformación del dato
medido en el equipo gráficamente (interpolando el valor de A medido en la gráfica) o
bien despejando el valor de X que le corresponde a la medida Y (señal de emisión) en la
ecuación de la recta de calibración obtenida.
 Concepto general de la curva de calibración:
Se aplica a varios métodos instrumentales y es un procedimiento
que permite transformar lo que mide el equipo en la concentración
del analito presente en la muestra desconocida.

5- FUENTES DE ERROR EN LA FOTOMETRÍA DE LLAMA

En este método medimos la luz emitida por analitos en estado de vapor

previamente excitados con el calor de una llama.
Las posibles fuentes de error pueden ser de dos tipos:
1- Factores instrumentales: tipo de mechero, características de la llama, presión de
combustible y comburente, etc. Por lo tanto cada vez que se procesen muestras debo
hacer la curva de calibración correspondiente.
2- Factores de la muestra (Interferencias): los aniones que forman la sal determinan la
facilidad de la disociación en vapor atómico (cloruros y nitratos se disocian fácil,
sulfatos y fosfatos son más difíciles); componentes de la muestra que emiten fotones de
λ cercanas; componentes que se ionizan más fácilmente que el analito.

6- APLICACIONES DE LA FOTOMETRÍA DE LLAMA

6.1- Determinación de sodio en muestras de agua y suelos.

6.2- Determinación de potasio en un

análisis foliar.
6.3- Determinación de dureza de agua.

6.4- Determinación de litio

7- TRABAJO PRÁCTICO EN EL LABORATORIO

Determinación del contenido de sodio en una muestra de agua
El sodio es uno de los seis elementos en orden de abundancia en la naturaleza y está
presente en las aguas naturales. El nivel puede variar entre 1ppm a 500ppm. Las
concentraciones relativamente altas de sodio se encuentran en aguas salobres. La
determinación de la relación de sodio al contenido de cationes totales es importante en
la agricultura. Los suelos permeables pueden dañarse por una alta relación de sodio.
Trazas de sodio pueden ser determinadas empleando fotometría de llama a una longitud
de onda de 589 nm. La intensidad de la luz emitida a esa longitud de onda es
proporcional a la concentración de sodio
Las interferencias posibles:
1- grandes cantidades de sulfatos, bicarbonatos
2- potasio si se encuentra en una relación potasio/sodio >
5:1 3- calcio si se encuentra en una relación calcio/sodio >
10:1

Importante: todas las soluciones empleadas en el análisis, deben guardarse en frasco de

plástico. Utilizar agua destilada o bidestilada libre de sodio para preparar todas las
soluciones, incluidas las soluciones patrón.

Procedimiento:
1- Preparar 500,00 ml de una solución madre de NaCl de 100,00 ppm en
Na. 2- Patrones para la curva de calibración de Na.
Se utilizarán patrones de 2,00; 4,00; 8,00 y 10,00 ppm de Na +. Las mismas se
prepararán tomando el volumen correspondiente de la solución madre anterior y
llevándolo a 100,00 ml.
3- Medida:
a) encender el equipo
b) Colocar el filtro para sodio
c) Abrir el paso de gas
d) encender la llama
 e) abrir el paso de aire
f) regula el caudal de aire y gas hasta observar los conos azules en el mechero
g) con agua bidestilada ajustar el cero
h) con la solución patrón más concentrada llevar la señal a 100%
i) registrar la lectura de las soluciones patrón. Antes de cada solución
colocar agua bidestilada en el capilar para limpiar todo el conducto.

4- Determinación de sodio en una muestra de agua.

Tomar una alícuota de 10,00 ml de la muestra de agua y diluir a 250,00 ml con
agua bidestilada, leer su señal y determinar la concentración de sodio.
5- Gráfico de la curva de calibración: a partir de las señales obtenidas con cada una de
las soluciones patrón de sodio construir la gráfica señal (eje Y) vs. concentración de
sodio en ppm (eje X), el gráfico debe dar una recta. A partir del gráfico y del valor de la
señal de la muestra desconocida encontrar la concentración de sodio en la muestra.

8- CUESTIONARIO Y PROBLEMAS PARA RESOLVER SOBRE LOS

CONCEPTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA DE
EMISION ATOMICA (FOTOMETRIA DE LLAMA).

1- ¿Qué procesos ocurren en la llama cuando se introduce la solución con el

analito? 2- ¿Qué tipo de átomos pueden analizarse por fotometría de llama? ¿Por
qué?
3- ¿Cuáles son los componentes de un fotómetro de
llama? 4- ¿Qué características debe tener la llama?
5- ¿Cuáles son las posibles fuentes de error en la fotometría de llama?
6- Una serie de soluciones patrón de K se midieron en un fotómetro de llama. Las
lecturas obtenidas a 404,3 nm fueron las siguientes:

g/ml de K 0, 5, 10, 20, 30,

0 0 00 00 00
0 0
Lectura de 0, 1 2 48, 71,
emisión 0 2, 4, 6 2
0 4 3
Determinar la concentración de K en una muestra si la lectura de emisión fue de 41,7.
Rta.: 17,37 g/ml
7- Para determinar el contenido de sodio en agua de río por espectroscopia de emisión
de llama se prepararon una serie de soluciones patrón cuyas lecturas de emisión fueron
las siguientes:
g/ml de Na 0 0, 0, 0, 0,
, 2 4 6 80
0 0 0 0
Lectura de 0 2 4 5 77
emisión , 1, 0, 7, ,3
0 5 9 7
Para medir la muestra de agua de río se tomaron 25,00 ml de la misma y se diluyeron
con agua bidestilada hasta un volumen final de 100,00 ml. La lectura obtenida fue de
41,2. Calcular la concentración de sodio en la muestra. Rta.: 1,64
8- Para determinar el contenido de potasio (K) en una solución de fertirriego se realizó
una curva de calibración en base a ppm de K cuya ecuación de la recta resultó:
y = -0,023 + 0,044 x ;con un r2 de 0,999. Calcular la concentración de Ken g/L en la
solución de fertirriego si una dilución de 5 ml de la misma en 250 ml finales dio una
 señal de emisión de 5. Rta: 5,7 g/L.

Bibliografía consultada:
Química Analítica Cuantitativa. R.A. Day y A.L. Underwood. 5ª Ed. Prentice Hall, 1995
Análisis Químico Cuantitativo. Daniel C. Harris. 2ª Ed. Reverté, 2001
Química Analítica. Skoog, West, Holler y Crouch. 7ª Ed. Mc Graw Hill, 2001

PRACTICA DE LABORATORIO

Cálculos con absorbancia y concentración

Lo que tienes que tener muy claro: para un mismo espesor de muestra, paso óptico o anchura de
la cubeta, la absorbancia es proporcional a la concentración.
En consecuencia, se pueden establecer proporciones directas entre A y c. Se usan cubetas de 1
cm de paso óptico.

Por ello, los problemas se pueden resolver mediante una regla de tres (pero bien planteada: la
absorbancia de una muestra es proporcional a la concentración en esa muestra del compuesto
que absorbe, y la constante de proporcionalidad es siempre la misma para un compuesto dado; 
a mayor concentración, mayor absorbancia).

A=abc  o bien  A =   c 

  A = absorbancia a una longitud de onda dada, 
 a = absortividad =   = coeficiente de extinción, a esa 
 b =   = paso óptico o espesor de la muestra
 c = concentración del compuesto que absorbe

Si c es una concentración molar (se mide en moles/volumen), Mol / L

a y   se llaman absortividad molar y coeficiente de extinción molar.

1.Una disolución 15 mM de un colorante azul tiene una absorbancia de 0.600.

¿Cuál es la concentración de una muestra del mismo colorante cuya absorbancia es 0.400?

2. Un compuesto de color rojo disuelto a 0.10 M tiene una absorbancia de 1.20. ¿Cuál es la
concentración de una muestra del mismo compuesto cuya absorbancia es 0.90?

3.Una disolución con 5 mg/mL de una proteína coloreada tiene una absorbancia de 0.250. ¿Cuál
es la concentración de una muestra de esa proteína cuya absorbancia es 0.90?

4.Una muestra se diluye añadiendo 20 µL a 780 µL de agua. Su absorbancia es entonces de

0.950. Una muestra patrón del mismo compuesto 3.0 mM da una absorbancia de 0.475. ¿Cuál es
la concentración de la muestra problema?

5. Se mide la velocidad de una reacción mediante la producción de un compuesto coloreado,

encontrando que aumenta la absorbancia a una tasa de 0.72 unidades por minuto. Si una
disolución 25 µM del compuesto puro da una absorbancia de 0.36, ¿cuál es la velocidad de la
reacción en unidades de concentración?

6. Una reacción produce en 6 minutos un color de 0.90 unidades de absorbancia. Si se sabe que
una disolución con 10 mg/mL del producto da una absorbancia de 0.50, ¿Cuál es la velocidad de
la reacción en unidades de concentración?

7. Se realiza una reacción para la cual se mezclan 100 µl de disolución 48 mM de sustrato, 50 µl

de muestra que contiene la enzima y 650 µl de tampón. Cuando comienza la reacción, la
absorbancia es de 1.20, y en los siguientes 12 minutos disminuye hasta 0.90. Calcula la
velocidad de la reacción (en unidades de concentración).
8. Una muestra 0.2 M se diluye 40 veces, ofreciendo entonces una absorbancia de 0.81. Este
compuesto se consume en una reacción a una tasa de 0.09 unidades de absorbancia por
segundo.

a) Calcula la velocidad de la reacción (en unidades de concentración).

b) Si esa reacción es el resultado de una catálisis enzimática, indica el valor de la concentración
de actividad enzimática presente, en unidades internacionales y en unidades del S.I.

9.Tienes una disolución 150 mM del compuesto DCPIP, cuya absorbancia es demasiado alta
para poderla medir con precisión. Por ello, la diluyes 5 veces, consiguiendo una lectura de
absorbancia de 1.5 a 600 nm. Calcula la concentración de una muestra de DCPIP cuya A600 = 0.5

10.Se sabe que una solución de un compuesto orgánico con una concentración de 0.008739 M presentó
una absorbancia de 0.6346, medida a λ=500 nm y con una celda de 0.5 cm de longitud. Calcule cuál es la
absortividad molar del complejo a dicha longitud de onda.
A partir de estos datos puede despejarse directamente ε:
ε= 0.6346/(0.5cm)(0.008739M)
145.23 M-1∙cm-1

10. Se tiene las siguientes absorbancias medidas a diferentes concentraciones de un complejo metálico a
una longitud de onda de 460 nm, y con una celda de 1 cm de longitud:
A: 0.03010  0.1033  0.1584  0.3961  0.8093
c: 1.8∙10-5   6∙10-5   9.2∙10-5   2.3∙10-4   5.6∙10-4
Calcule la absortividad molar del complejo.
Hay un total de cinco puntos. Para calcular ε es necesario graficarlos colocando los valores de A en el eje
Y, y las concentraciones c en el eje X. Una vez hecho esto, se determina la recta de los mínimos
cuadrados, y con su ecuación se podrá determinar ε.
En este caso, graficados los puntos y trazada la recta con un coeficiente de determinación R 2 de 0.9905, la
pendiente es igual a 7∙10-4; es decir, εb= 7∙10-4. Por lo tanto, con b=1cm, ε será de 1428,57 M -1.cm-1 (1/7∙10-
4
).

11. El % de transmitancia de una solución medida a cierta longitud de onda en una celda de 1,00 cm es de
63,5% . Calcule el % de transmitancia de esta solución en celdas de trayectoria optica de A) 2,0 mm ; b) 2 ,
0 cm y c) 5,00 cm . R: a) 91,3 %T ; b) 40,4 %T ; c) 10,3 %T

12. El compuesto orgánico 3-ciano-5- metilpirrolina ( C7H6N2 , PM :118,14) Presenta una banda de
absorción UV en 272 nm en solucion de etanol. Una solucion que contiene 0,274 mg de este compuesto en
10 ml de etanol dio una absorbancia de 0,700 en una celda de 1,00 cm. Calcule: a) la absorbilidad , b) la
absorbilidad molar del compuesto
R: a) a = 25,6 L/g cm b) ε = 3018,5 L/mol cm

13. A partir de una solución patrón de 100 ppm ( 100 mg/L) de un compuesto orgánico que presenta una
banda de absorción máxima a 270 nm se preparó una curva de calibracion : se obtuvieron los siguientes
datos :

Concentració A
n
1 1 0,1282
1.5 0,1940
2 0,2615
3 0,3995
4 0,5422

Si 2 ml de una solución desconocida de este compuesto son diluidos a 50 ml se obtiene una absorbancia de
0,425. Calcule la concentración de la muestra en mg/l.
R: 79 ppm

14. Un método para la determinación cuantitativa de Pb++ en la sangre proporciona una Absorbancia de
0,712 en una muestra de 5,00 ml de sangre . Tras añadir a la muestra de sangre 5,0µL de un patron de Pb++
con 1,560 ppb se determina una absorbancia de 1,546 . Indique la concentración de Pb++ en la muestra de
sangre original

R: 1,343 ·10-3 ppb

 Laboratorio 3 : Caracterización Fisicoquímica del relave minero

Situación de las relaveras hace

10 años.

FOTO N .- La situación de la relavera de hace 10 años donde se puede observar que

existen 6 relaveras y son R1, R2, R3, R4, R5 Y R6. Y todos están sin ninguna planta, la
zona de estudio de este proyecto es la relavera N°6 (R6)
FOTO 2 .- Vista aérea con dron, octubre del 2018, se observa la situación de la relavera
donde se está iniciando la revegetación con molle y vetiver en la zona del estudio de la
investigación relavera R6A al lado derecho y R6B al lado izquierdo, en la relavera R6A se
observa el trabajo efectuado renivelación, se ha bajado la gradiente de talud, ósea
estabilización física y química.

Análisis de composición mineralógica de muestras de relavera R6

Se monitorio la zona de la relavera denominada R6 y se tomó 6 muestras
representativas, después de mezclar y homogenizar las 6 muestras a esta muestra
representativa se le ha determinado por observaciones microscópicas y análisis
espectral los resultados que se indican a continuación en la tabla N°1. Este muestreo y
análisis ha sido realizado en el laboratorio de espectrometría de la Facultad de Ing.
Geológica Minera y Metalúrgica de la Universidad Nacional de Ingeniería.

TABLA N° 1: COMPOSICIÓN Y ABUNDANCIA MINERALÓGICA DE LA RELAVERA R6:

Minerales/ R6 Formula % en Peso

Cuarzo SiO2 57,61
Calcita CaCO3 3,070
Ortoclasa K(AlSi3O8) 1,30
Albita Na(AlSi3O8) 1,70
Anortita Ca(Al2Si2O8) 1,80
Pirita FeS2 0,465
Calcopirita CuFeS2 1,155
Esfalerita (ZnFe)S 3,383
Galena PbS 10,635
 Hematita Fe2O3 6,94
Caolinita Al2Si2O5(OH)4 0,86
Montmorillonita Na0.3(AlMg)2Si4O10(OH)2xH2O 7,80
Pirolusita MnO2 1,38
Goetita FeO(OH) 1,90

El contenido en la Tabla N° 1, corresponde a relaves R6 con las características de color

marrón claro con abundancia de partículas de cuarzo, sulfuros, arcillas, óxidos de hierro;
en menor proporción feldespatos y carbonatos.
De acuerdo a la físico química de elementos que contiene el relave, al ensamble
mineralógico determinado y las reacciones que ocurren bajo condiciones termodinámicas
del intemperismo pueden evaluarse en base a la energía libre (∆Gº), que se centra
principalmente en la disolución de los sulfuros y en la reacción de los sulfuros con los
carbonatos de acuerdo a las reacciones siguientes:

2FeS2 + 15/2 O2 + 4H2O → Fe2O3 + 4SO4-2 + 8H+

Energia libre (∆ Kcal

Gº),
Compuesto ∆Gº kcal
Fe2O3 -177,4
4SO4-2 -177,97
8H+ 0,00
-355,37
2FS2 -79,80
15/2 O2 0,00
4H2O -226,76
-306,56
∆Gº kcal -48,81
El valor ∆Gº igual a -48,81 kcal indica que la reacción ocurre hacia la derecha; esto es la
pirita en presencia de agua y oxígeno tiende a formar óxido férrico y ácido sulfúrico.
La siguiente reacción de neutralización durante el intemperismo por presencia de pirita y
carbonatos expresada como:

FeS2 + 2 CaCO3 + 7/2O2 + H2O → Fe(OH)3 + 2SO4-2 + 2Ca+2 + 2H2CO3

Energia libre (
∆Gº), Kcal

Compuesto ∆Gº kcal

Fe(OH)3 -166,5
2SO4-2 -355,94
2Ca+2 -132,3
2H2CO3 -297,88
-952,62
 FeS2 -78,9
2CaCO3 -539,8
7/2 O2 0
H2O -56,69
-675,39
∆Gº kcal -277,23

El valor de ∆Gº igual a -277,23 kcal indica la ocurrencia de neutralización durante la

reacción entre la pirita y el carbonato de calcio como calcita.
En la reacción podemos notar que la velocidad de reacción es proporcional al aumento
de la concentración de los productos. Asimismo durante la oxidación e hidrólisis de la
pirita ocurre neutralización con la calcita produciéndose hidróxido férrico, 2 moles de
sulfatos, 2 moles de calcio y 2 moles de H2CO3.

Potencial Neto de Neutralización en R6

La evaluación del contenido de azufre como sulfuro y la prueba ácido-base en las
muestras nos permite determinar el potencial neto de neutralización cuyos resultados se
indica en la tabla siguiente:

Tabla 2: Potencial neto de neutralización de las relaveras

pH en
Muestras %S PN PA PNN PN/PA
pasta
R6 5,4 3,19 -11,25 99,69 -110,94 0,00

Dónde:
PN = Potencial de neutralización
%S = Porcentaje de azufre como sulfuro
PA = Potencial de acidez
PNN = Potencial neto de neutralización
PN, PA y PNN están expresados en KgCaCO 3/TM y evaluados según:

Segun método: Extracts From Fields And Laboratory Methods Applicable To

Overburdens And Mine Soils, U.S. EPA, 600/2 – 78-054, 1978

Los resultados del PNN de las muestras corresponden a pruebas estáticas de predicción
del drenaje ácido en base a la determinación del balance ácido-base del ensamble de
minerales de la muestra evaluada.
Los valores del PNN que se observa en la Tabla N°2 y es menor que -20, predicen una
tendencia de la muestra R6 a generar drenaje ácido debido a la predominancia de los
sulfuros sobre los neutralizantes; necesitándose una cantidad igual o superior a 110,94
Kg CaCO3 por tonelada métrica de relave para iniciar una rehabilitación.
Referencia: Introduction to geochemistry – Konrad B. Krauskopf - MacGraw-Hill Book Company-1979

Se adjunta microfotografías de la muestra R6 de la relavera indicando sus principales

características mineralógicas.

MICROFOTOGRAFÍAS MUESTRA DE LA ZONA R6

DE RELAVERA REVEGETADA UNI

Foto 3: Relavera R6 de tonalidad amarillenta mostrando cuarzo con pátinas

de óxidos de hierro, sulfuros como pirita y escasos carbonatos.

Fuentes Bibliográficas

Investigadores: UNI
Dr. Ing. Santiago Valverde Espinoza.
MSc. Ing. José Antonio Corimanya Mauricio.
MSc. Ing. Efraín Castillo Alejos.
MSc. Ing. María Aliaga Martínez
MSc. Ing. Jorge Huayhua Rojas.
Alumno: Cesar Beremiz Hinotroza Aylas.