CROMATOGRAFA: AISLAMIENTO Y PURIFICACON DE CLOROFILA Y CAROTENOS

DE ESPINACA
Isabella Orozco 11200001, David Colorado 10120042
Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Qumica Orgnica I
Santiago de Cali, Colombia
Agosto 19 de 2011
belita_orozco@hotmail.com, obituary07@hotmail.com
1. Objetivos:
Separar los diferentes componentes de
la hoja de espinaca por medio de la
cromatografa en columna, recolectando
en diferentes tubos de ensayo las
sustancias aparentemente de diferentes
colores y utilizando solventes de
diferentes composiciones.

Valores de Rf obtenidos:
Rf

Muestra

Distanci
a (cm)

3A

0.5

3B

0.8

Purificar las clorofilas y los carotenos

encontrados en la hoja de espinaca por
medio de la cromatografa en capa fina.
Y poder as identificar los diferentes
componentes.

3C

1.4

4A

0.7

5A

0.3

0.1

Calcular el Rf de cada componente para

as poder identificarlos y determinar su
polaridad.

5B

0.7

0.23

5C

1.2

0.4

5D

1.7

0.57

2. Resultados:

6A

Placa de Cromatografa de Capa Fina:

7A

0.8
0.2

0.17
0.27
0.47
0.23

0.27
0.07

Clculos:
Rf para cada muestra:
Rf

Distancia recorrida por lamuestra

Frente del solvente
Muestra 3

Rf=

0.5
3.0

= 0.17

3. Anlisis de Resultados:
La Cromatografa representa el uso excepcional de un concepto como la extraccin; pero
en este caso una de las dos fases con las que coexiste el compuesto de inters se
mantiene fija o estacionaria y la otra se mueve a travs de ella o es mvil con respecto a
la primera1. Tpicamente, las dos fases son insolubles entre si y adems, presentan
ciertas interacciones o comportamientos frente a la sustancia de inters que hacen que
esta sea repelida o atrada.
En otras palabras: es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a
separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de
gran desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a travs o a lo largo del lecho
estacionario (fase mvil).2
Puede considerrsele, en general, como un mtodo de purificacin, separacin,
identificacin y preparatorio; esta versatilidad es posible gracias a que la cromatografa
puede ser empleada con una gran variedad de metodologas, las cuales se presentan a
continuacin:

Como objetivo principal de la prctica se

emple una cromatografa en columna
abierta de tipo solido lquido para
separar las distintas clorofilas y
carotenos contenidos en la espinaca; la
cual fue previamente homogenizada.
Despus, para comprobar la eficiencia
de la cromatografa solido lquido se
emple una cromatografa de adsorcin
en papel.
Una cromatografa solido liquido,
bsicamente, corresponde al uso de una
fase liquida o mvil como trasportador o
eluyente y un slido estacionario como
medio de detencin; en el sistema semi
cerrado de una columna. El slido se
utiliza como material absorbente y puede
estar constituido de gel de slice, oxido
de aluminio, silicatos, celulosa, almidn y
hasta vidrio molido. El mtodo consiste
en depositar la solucin problema, en
este caso la espinaca homogenizada,
sobre el relleno estacionario adsorbente;
una vez adsorbidos los componentes se
pasa un lquido eluyente que ayuda a
separar los componentes, por ello
tambin se le define como cromatografa
en columna3.

Dentro de estos pigmentos tenemos a

las Clorofilas y a los Carotenos:

(Figura No 3: Clorofila a, b, d)

La adsorcin, la polaridad y la afinidad

son conceptos que hacen posible la
separacin que se lleva a cabo dentro de
dicha columna cromatografa; y se
analizaran a partir de lo observado
durante la realizacin de la prctica para
el correspondiente ensayo.
La espinaca es una planta que posee en
la clulas de sus hojas orgnulos
llamados cloroplastos, estos a su vez
posee pigmentos de diferente color que
hacen posible la fotosntesis por la
absorcin de distintas longitudes de onda
aptas para la planta y para que esta
pueda obtener energa4.

(Figura No 4: Clorofila c1 y c2)

Para nombrar los tipos de clorofila
simplemente se escribe Clorofila X
donde X representa una de las 5
conformaciones que puede tener la

estructura bsica de la clorofila (a, b, d,

c1 o c2).
El efecto de la polaridad se puede
entender esquemticamente como sigue:

(Figura No 5: Carotenoides)
. La estructura patrn de 40 carbonos se
denomina "caroteno". La numeracin se
toma en cuenta como un dmero, por lo
que la mitad izquierda se numera
comenzando por el carbono que se
enlaza a dos metilos y se prosigue de
manera lineal hasta el carbono 15 (El
extremo opuesto del primer monmero);
se prosigue a numerar los metilos de
izquierda a derecha hasta el nmero 20.
La mitad derecha se numera de manera
homloga de derecha a izquierda con
numeracin primada. Dependiendo la
estructura de cada uno de los extremos,
se nombra el tipo de extremo de la
izquierda con las letras griegas de
acuerdo a la convencin de la IUPAC.
Posteriormente se hace lo mismo con la
mitad derecha5.
Como se coment anteriormente,
conceptos como la polaridad son
esenciales
para
entender
el
comportamiento de una sustancia
durante un proceso de cromatografa de
columna solido liquido, debido a que de
ellos depender el orden y el instante en
que se separen las sustancias.

(Figura No 6)
En el paso c) se puede observar como
el soluto B se distancia del soluto A al
quedarse retenido este ltimo; gracias
al efecto de la polaridad. Para un
cromatografa de columna suelen usarse
una fase mvil y una estacionaria que,
adems se der inmiscibles y no
reaccionar,
poseen
polaridades
opuestas; as, en la mayora de los casos
se emplea una fase estacionaria muy
polar y una fase mvil muy apolar o poco
polar. Por ende, los compuestos polares
en la muestra homogenizada de
espinaca interaccionaran fuertemente
con la fase estacionaria y dbilmente con
la mvil; en contraste, los compuestos
poco polares interaccionaran dbilmente
con la estacionaria y fuertemente con la
mvil. Dicho as, en el esquema de la
figura No 6 el compuesto A es ms polar
que el compuesto B.
A este concepto de polaridad durante un
proceso de cromatografa tambin puede
denominrsele afinidad5.
Entonces, al analizar las posibles
conformaciones estructurales de las
Clorofilas y las posibles conformaciones

de los Carotenos, no es difcil deducir

que las clorofilas pueden llegar a ser
ms polares; en especial la Clorofila b y
d que poseen mayo cantidad de
oxgenos unidos, a su estructura bsica,
a travs de dobles enlaces que
aumentan la polaridad. Enseguida y en el
mismo orden decreciente de polaridad
tenemos a las clorofilas c1 y c2 que por
su menor tamao les es fcil ser polares
gracias a los tomos de oxgenos
ubicados en su estructura bsica. De
tercero tenemos a la clorofila a que,
aunque tambin posee tomos de
oxgeno, su tamao le impide ser ms
polar que las clorofilas nombradas con
anterioridad.
En el grupo de los carotenoides tenemos
compuestos menos polares que la
clorofila a, pero en orden decreciente de
polaridad
tenemos
primero
al
carotenoide que pude formarse con el
grupo: pues las cadenas lineales de
carbonos suelen ser ms polares o
presentan mayor afinidad que los
compuestos cclicos hidrocarbonados. Y
como compuestos menos polares
tenemos a lo carotenoides que se
pueden formar a partir de los dems
grupos incluidos en la Figura No 5.

20% metanol y por ultimo una solucin

de acetona.
Segn el siguiente esquema, la clorofila
a posee un color verde oscuro, la
clorofila b posee un color verde claro y
los carotenoides un color amarillo
marrn.

(Figura No 7)6
Ahora, al revisar la Placa obtenida por
una cromatografa por adsorcin de
papel se obtuvo:

Desacuerdo con lo anterior podemos

deducir que las clorofilas b, d, c1 y c2
tuvieron gran afinidad por la fase
estacionaria; que las clorofila a y el
carotenoide presentaron una afinidad
moderada y que los dems carotenoides
diferentes del presentaron muy baja
afinidad por la fase estacionaria.
En cuanto a la fase mvil, el solvente, se
usaron varios; se inici con una fase
mvil poco polar y a medida que se
separaban los compuestos en el
homogenizado de espinaca se aument
la polaridad de la fase mvil. De esta
manera, se inici con una solucin de
hexano, luego con una solucin 70%
hexano : 30% acetona, 80% acetona :

(Figura No 8)
Permitiendo
deducir
que,
experimentalmente, la clorofila a es el
pigmento menos polar en la espinaca,
seguido de la clorofila b y d un poco ms
polares y como compuesto ms polar se

dedujo a los carotenoides. En contraste

con lo afirmado a partir del anlisis de las
estructuras de los pigmentos (clorofilas y
carotenoides), pues resultaron ser mas
polares los carotinoides que las clorofilas
b y d.
En cuanto a las clorofilas c1 y c2 se
encontr que son menos comunes entre
las especies de plantas y que son
propias de las algas rojas7. A falta de
presencia de colores rojos durante las
dos cromatografas se dedujo que este
tipo de clorofilas no se encuentran en la
especie de espinaca analizada. Por lo
tanto la espinaca contiene clorofila a, b y
carotenos; pues de la clorofila d se sabe
que es muy rara y absorbe luz en
longitudes de onda cercanas al
infrarrojo8.
Al realizar un mejor anlisis de la Figura
No 8 se puede observar cmo, a pensar
del cuidado que se pueda tener, al
realizar un cromatografa de columna
solido lquido es bastante probable que
las fracciones o muestras obtenidas
contengan distintos compuesto cuando lo
que se busca, en cuanto a eficiencia, es
que cada fraccin este compuesta por
un nico compuesto. Se consider muy
probable porque determinar cundo
empieza y cuando termina una fraccin
depende del experimentador y su
capacidad para diferenciar colores.
Para corregir este imprevisto se puede
recurrir al uso de un revelador el cual
consiste en una sustancia que intensifica
los colores de las fracciones en la
columna permitiendo identificarlas con
mayor facilidad2.

Cromatografa
Papel:

por

Adsorcin

en

Este tipo de cromatografa consiste en el

uso de una placa que posee, en una de
sus caras, una lmina uniforme de una
sustancia adsorbente. Sobre la placa se
ubican ordenadamente muestras de la
sustancia que se desea analizar y se
pone en contacto con un disolvente
adecuado por el extremo cercano a las
muestras, sin que dicho solvente toque
las muestras; evitando que las diluya.
Las muestras empiezan a subir por la
lmina de absorbente gracias a la
capilaridad del solvente sobre placa y a
su vez arrastra a la muestra
superndole gracias a la absorbancia de
la placa por los compuestos del soluto o
muestra2.
Durante la realizacin de la prctica este
mtodo de cromatografa se emple para
verificar la eficiencia de la cromatografa
de columna solido lquido realizado con
anterioridad.
Al observar la Figura No 8 se puede
concluir que las muestras 3 y 5 se
encontraron
considerablemente
contaminadas
o
mal
purificadas
mediante la cromatografa de columna
solido liquido. Mostrando lo que al
juzgar por su color son carotenos. Segn
los colores observados se infiri en que
en la muestra 2 se constitua de clorofila
a y b adems de carotenos; en la
muestra 3 no se observ nada; en la
muestra 4 se obtuvo un caroteno; en la
muestra 5 se presentaron carotenos y
trazas de clorofila; y tanto en la muestra
6 como en la 7 se observaron colores
que se determinaron como carotenos.
A juzgar por la sencillez con la que se
puede realizar una cromatografa por
adsorcin de papel o de capa fina, se
concluy con que el comportamiento de

las muestras ya vena dado por la

cromatografa de columna.
Para analizar una placa de una
cromatografa de capa fina se suele
emplear una luz ultravioleta; a la
ausencia de este mtodo para analizar la
placa se le atribuyo que en la muestra 2
no se observase nada. Adems, para
comprobar la eficiencia del solvente
empleado en una cromatografa por
adsorcin de papel o de capa fina suele
emplearse un concepto denominado Rf
o Factor de Retencin; un valor pequeo
de Rf indica que el compuesto de inters
presenta mayor afinidad por la fase
estacionaria que por la fase mvil, en
otras palabras, es mas retenido. Por el
contrario, un valor elevado de Rf indica
que el compuesto de inters presenta
mayor afinidad por la fase mvil que por
la fase estacionaria, e otras palabras, es
poco retenido. Por lo tanto, los
compuestos con los Rf ms bajos sern
los
ms
polares,
como,
experimentalmente
determinado,
lo
fueron los carotinoides; y los compuestos
con los Rf ms altos sern las menos
polares, como se encontr que fueron las
clorofilas a y b.

separacin de los compuestos dentro de

la columna; y no permita que por errores
personales el experimentador recoja
eluato de compuestos distintos en la
misma muestra.

4. Conclusiones:

3. J. V. Morales Ortiz, J. A. Snchez

Manzanares, Fsica y Qumica Vol. III:
Qumica I, 1ra Edicin, MAD, 2003, pp.
299 301.

Segn el anlisis hecho a la placa de

cromatografa de capa fina, a partir de
las muestras recolectadas como eluatos
en la cromatografa de columna solido
liquido, se determino que los carotinoides
pueden ser compuestos mas polares que
las clorofilas a y b; aun sin poseer
grupos o tomos electronegativos que
estructuralmente sugieran su polaridad.
A partir del hecho de que en la placa de
cromatografa de capa fina se obtuvieron
variedad de compuestos en algunas
muestras (Vase Figura No 8), se infiri
en que durante la realizacin de una
cromatografa de columna solido
liquido es de gran ayuda el uso de un
revelador que facilite la visibilidad de la

La cromatografa de capa fina puede

usarse como mtodo preparatorio antes
de emplear cualquier otro procedimiento
de
identificacin,
separacin
o
purificacin; gracias a su bajo costo
econmico y al poco tiempo que
requiere. Adems porque permite
identificar o crear un idea de que
posibles compuestos se encuentran en la
muestra sobre la cual se desea trabajar.
5. Bibliografa:
1. D. C. Harris, Anlisis Qumico
Cuantitativo, 3ra Edicion, REVERTE,
2003, Barcelona Espaa, pp. 553
557.
2.https://www.itescam.edu.mx/principal/s
ylabus/fpdb/recursos/r49955.PDF
|
Visitada el da Mircoles 14 de
Septiembre del 2011 a las 20hs.

4. http://fichas.infojardin.com/hortalizasverduras/espinaca-espinacasespinafre.htm | Visitada el da Mircoles

14 de Septiembre del 2011 a las 20:30hs.
5.http://es.wikipedia.org/wiki/Carotenoide
| Visitada el dia Miercoles 14 de
Septiembre del 2011 a las 21hs.
6.http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ci
encias/2000051/lecciones/cap02/anexo_
13.htm | Visitada el dia Jueves 15 de
Septiembre a las 14hs.

7.http://www.slideshare.net/etnografiaver
de/clorofila-5850638 | Visitada el dia
Jueves 15 de Septiembre del 2011 a las
14:20hs.
8.http://www.rallt.org/boletin/boletin
%20300-360/Bol.%20301_%20Coliflor
%20roja.pdf
Visitada el dia Jueves 15 de Septiembre
del 2011 a las 15hs.