(PRACTICA N.

º 15)
TECNICA DE LA COAGULASA

Objetivo General. –
Que el estudiante aprenda a determinar la presencia de la enzima coagulasa que permite
diferenciar las especies del género Estafilococos.

Objetivos Particulares. -

1.-
2.-
3.-

Introducción

Fermento secretado por ciertos microorganismos, y en particular por la mayoría de Staphylococcus

patógenos, la Coagulasa provoca trombosis en los focos de supuración y la formación de un
revestimiento protector de fibrina alrededor de los gérmenes la Coagulasa enzima producida por el
Estafilococos aureus, es relativamente termoestable, ya que es resistente a temperaturas hasta 60
grados centígrados. Se desconoce el mecanismo exacto y la estructura química de la Coagulasa.
Sin embargo, se sabe que esta enzima desempeña cierto papel en la coagulación.
Actúa sobre algún componente que se encuentra en el suero para producir un coagulo o trombo, in
vitro, la coagulasa, aumenta la velocidad de coagulación del plasma y el resultado final es la formación
de un coagulo de Fibrina.

Oginsky y Unbreit afirman que hay pruebas de que la Coagulasa induc irá un mecanismo activado
alterno, ya sea como una enzima o como un activador de un componente plasmático.

Smith y Col sugieren que la Coagulasa en una sustancia semejante a la protrombina que reacciona
con los factores plasmáticos normales para formar una sustancia semejante a la trombina, que, a
su vez, activa el Fibrinógeno para formar Fibrina.

La Coagulasa ligada o factor de aglutinación convierte al Fibrinógeno en Fibrina directamente sin

intervención de los factores plasmático, y no es inhibida por los anticuerpos de la Coagulasa
libre.

La función real de la Coagulasa Invitro no ha sido aun aclarada.

.
Rogers y Tompsett efectuaron estudios sobre la acción de la estafilocoagulasa, cuando hay una
barrera de fibrina localizada en las lesiones estafilocócicas
Material:

1. Aguja vacutainer
2. Soporte para aguja
3. Torniquete
4. Tubo con EDTA
5. Jeringas 5 ml
6. Cultivos bacterianos Gram positivos y Gram negativos
7. Portaobjetos
8. Asa bacteriológica
9. Guantes
10. Cubre bocas
11. Gorro quirúrgico
12. Gafas de protección
13. Bata

Procedimiento:

Técnica En Portaobjetos

1. Colocar una gota de plasma (Preferentemente plasma de conejo con EDTA), sobre un
portaobjeto limpio y seco.
2. Colocar una gota de agua destilada o solución fisiológica al lado de la gota de plasma como
control.
3. Con un asa bacteriológica de alambre recto o un palillo de madera, emulsionar una porción de
una colonia aislada a probar en cada gota, primero en el agua o solución fisiológica, y
posteriormente en la gota de plasma.
4. Mezclar bien tratando de obtener una suspensión homogénea.
5. Hacer movimientos suaves de oscilación con el portaobjetos durante 5 a 10 segundos.
6. Observar y reportar sus resultados.

Interpretación:

 Prueba positiva, formación de grumos macroscópicos en 10 segundos o menos en la gota de

plasma y ninguna formación en la gota de solución salina o en el agua destilada
 La prueba es negativa, no hay formación de grumos en ninguna gota.
 Prueba dudosa. -La formación de grumos en ambas gotas indica que el microorganismo se
autoaglutina y es inadecuado para la prueba de coagulasa en portaobjetos.

NOTA: -Todas las pruebas negativas en portaobjetos deberán confirmarse mediante

la prueba en tubo.
 Técnica en Tubo

1. En un tubo de 13 x 100 estéril mezclar 0.5 ml de plasma humano o de conejo (con EDTA)
emulsionar varias colonias a probar hasta obtener una suspensión lechosa.
2. Incubar a 35 grados 0C de 4-6 horas, observe cada 30 minutos.
3. Verificar la formación de grumos.
NOTA. -Las pruebas pueden ser positivas a las 4 horas y luego revertir a negativas después de
24 horas.
4. Si el resultado es negativo a las 4 horas, incubar a temperatura ambiente durante una noche y
verificar de nuevo la formación de grumos. (coagulo).

Interpretación
 Prueba positiva. -Grumos de cualquier tamaño.
 Prueba negativa. -Ningún grumo.

RUTA DE TRABAJO:

RESULTADOS:

DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA:
 (PRACTICA N.º 16)

TECNICA DE LA CATALASA

Objetivo General. -

Que el estudiante aprenda a realizar la prueba de catalasa para determinar la presencia de

esta enzima en los organismos vivos principalmente en bacterias anaerobias y aerobias
facultativas.

Objetivos Particulares. -
1.-
2.-
3.-

Introducción

La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la

descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua.
El peróxido de hidrógeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos
y tiene entre otras una función protectora contra microorganismos patógenos, principalmente
anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos menos
peligrosos. Esta función la efectúa esta enzima que cataliza su descomposición en agua y
oxígeno. Además, la catalasa se usa en la industria textil para la eliminación del peróxido de
hidrógeno, así como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que
se han esterilizado en una solución de peróxido de hidrógeno. La ausencia congénita de
catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se
manifiesta con severas infecciones gangrenosas de la cavidad bucal, pudiendo producir la
pérdida de los dientes y graves destrucciones de loa maxilares y regiones blandas que los
cubre. Enfermedad congénita del Japon (2 de 100.00 habitantes sufren de este trastorno).
La enzima se presenta en forma de homotetrámero y se localiza en los peroxisomas.
Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para muchas sustancias orgánicas,
especialmente para el etanol que actúa como donante de hidrógeno. Las enzimas de
muchos microorganismos, como el Penicillium simplicissimum, que exhiben actividad de
catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas.

La deficiencia en catalasa produce acatalasia. Esta enfermedad está caracterizada por la

ausencia de actividad de la catalasa en los glóbulos rojos y se asocia con las lesiones
orales ulcerantes.

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la

mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La
principal excepción es Streptococcus.
 Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar los siguientes géneros:
 Estreptococos (-) de Micrococos (+) y/o Staphylococcus (+).
 Bacillos (+) de Clostridium (-).
 Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

Material:
o Agua oxigenada
o Cultivos bacterianos Gram positivos y Gram negativos
o Portaobjetos
o Asa bacteriológica
o Guantes
o Cubre bocas
o Bata

Procedimiento:
1. Método del portaobjetos (recomendado):

 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y
colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
 Agregar c o n g o t e r o o pipeta Pasteur u n a gota d e H2O2 al 3 0 %
sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
 Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada)
pueden producirse falsos positivos.

2. Método del tubo de ensayo:

 Agregar 1ml de H2O2 a l 3% directamente a un cultivo puro de agar

densamente inoculado.
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

RUTA DE TRABAJO:

RESULTADOS:

DISCUSIÓN. -

CONCLUSIÓN. -

BIBLIOGRAFÍA. -
 (Practica N.º 17)

TECNICA DE LA OXIDASA
OBJETIVO GENERAL:

Determinar la presencia de la enzima oxidasa en diferentes microorganismos.

OBJETIVOS PARTICULARES:
1.-
2.-
3.-

INTRODUCCION

Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro y actúan como el último eslabón
de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (hidrogeno) al oxígeno, con
formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o
anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar
aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.
La prueba citocromo oxidasa utiliza ciertos reactivos colorantes como el diclorohidrato de p-
fenielendiamina que actua como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxígeno, este
reactivo es incoloro en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxigeno
atmosférico se oxida formando asi indofenol.
La prueba de oxidasa se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa
intracelular. Esta reacción de oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa
la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que su vez actúa como un
aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía a partir de la respiración, un proceso
responsable de la oxidación de varios sustratos. La cadena respiratoria es una secuencia de
enzimas y transportadores (Carrier) responsables del transporte de equivalente reductores
desde los sustratos al oxigeno molecular. El oxígeno es el aceptor final de hidrogeno y
produce agua o peróxido de hidrogeno a partir del hidrogeno, lo cual depende de las
especies bacterianas y de sus sistemas enzimáticos. Las oxidasas catalizan la eliminación
del hidrogeno de un sustrato, pero solo utilizan oxigeno como aceptor de hidrogeno.
El sistema citocromo, por lo común presente solo en los microorganismos aerobios, permite
a estos utilizar el oxígeno como aceptor final de hidrogeno para reducir el oxígeno molecular
a peróxido de hidrogeno, el último eslabón en la cadena de la respiración aerobia.
MATERIAL:

1. Cultivos bacterianos Gram positivos y Gram negativos

2. Portaobjetos
3. Caja de Petri desechable
4. Papel filtro
5. Gradilla
6. Reactivo de Kovacs
7. Asa bacteriológica
8. Guantes
9. Portaobjetos
10. Gorro quirúrgico
11. Gafas de protección
12. Cubre bocas
13. Bata

PROCEDIMIENTO:

1. Método directo en placa:

Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias que estén aisladas en la
placa de medio de cultivo, no inundar toda la placa y no invertirla.
Observar los cambios de color, con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos
10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2. Método indirecto sobre papel

Colocar un cuadro de papel filtro de 3 x 3 cm aproximadamente en placa de Petri.

Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La
reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Interpretación:

1. Prueba positiva

La zona del papel inoculada con la bacteria se torna de morado purpura en 10 segundos

2. Prueba negativa

No hay cambio de color en los primeros 10 segundos.

 Otra forma de interpretar la prueba:

1. Colonias oxidasa positiva: la colonia se vuelve de color rosa, luego marrón (rojo
obscuro) y por último negro (negro purpureo).

A. Colonias rosas:

 Bacterias fiables
 Fase para subcultivos

B. Color negras:
 Dentro de los 10 15 segundos.
 Bacterias no viables

2. Colonias oxidasa negativa:

 Sin cambios de color en la colonia o un color rosa muy pálido debido al

reactivo.
 Puede ocurrir un cambio de coloración al negro en el medio circundante.

Con el reactivo de Kovacs, un resultado positivo se manifiesta por un color negro purpura
que se desarrolla dentro de los 10 segundos, una reacción positiva en 10 - 60 segundos se
considera un resultado tardío.

RUTA DE TRABAJO:

RESULTADOS: Reportar sus resultados anexando dibujos o imágenes de lo realizado.

DISCUSIÓN:

CONCLUSIÓN:

BIBLIOGRAFÍA: