-bacterias del azufre

-bacterias productoras de polihidroxialcanoatos (PHA)

-bacterias sulfito reductoras

Indicar composición y Fundamento de cada medio.

COD. LQ-AMB-
01
Hidrólisis de almidón y otras fuentes
Versión: 00
carbonadas por Bacillus sp
Fecha:
10/06/2017

Programa de estudio Experiencia curricular Sesión

INGENIERÍA Bioquímica y Microbiología ambiental N° 4
AMBIENTAL

 OBJETIVO
- Reconocer la actividad hidrolítica y fermentativa de Bacillus subtilis.
-Determinar la utilidad de Bacillus subtilis a nivel ambiental e industrial
 FUNDAMENTO
La mayoría de microorganismos necesitan carbono ya que este cumple funciones
estructurales principalmente por lo que requiere grandes cantidades, son capaces
de degradar compuestos carbonados, si lo obtiene a partir de fuentes de carbono
orgánico, son denominados heterótrofos y si lo obtiene a partir de fuentes de
carbono inorgánico son denominados autótrofos.
Bacillus subtilis, es una bacteria Gram positiva,  aerobio comúnmente encontrada
en el suelo, agua, aire y ocasionalmente contaminando alimentos. Miembro
del Género Bacillus, subtilis tiene la habilidad para formar una
resistente endospora protectora en condiciones de estrés, permitiéndole tolerar
condiciones ambientalmente extremas. Además se caracteriza por ser capaz de
degradar diferentes fuentes de carbono entre ellas el almidón, esta capacidad se
debe a la capacidad de producir enzimas hidrolíticas entre ellas las amilasas
capaces de romper la molécula de almidón, llamadas amilasas.
Estructuralmente el almidón presenta dos fracciones: amilosa y amilopectina,
ambos constituidos por unidades de D-glucosa unidas por enlaces α-1,4 que

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permiten que las cadenas de almidón se enrollen en forma de hélices, donde la
amilopectina es una molécula muy ramificada, localizándose entre el carbono 6 de
una glucosa de la cadena principal y el carbono 1 de la primera glucosa en la
cadena que forma la rama (enlaces α- 1,6); por su parte, la amilosa es más
pequeña y contiene cientos a miles de unidades de glucosa, número que depende
de la variedad y las condiciones
ambientales.
En una reacción enzimática, los reactivos se denominan sustratos, es decir la
sustancia sobre la que actúa la enzima, que es modificado químicamente y se
convierte en uno o más productos. Como esta reacción es reversible, la enzima
libre se encuentra en la misma forma química al comienzo y al final de la reacción
(Murray y col, 1996). Las enzimas son catalizadores de origen biológico muy activos
que incrementan la velocidad de reacciones en medios acuosos y en condiciones
muy suaves de temperatura, presión, pH, etc, muy
específicos ya que pueden modificar un único substrato en una mezcla de
substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una
mezcla racémica de un compuesto quiral, y muy selectivos al modificar un único
enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga varias posiciones
modificables. Químicamente, las enzimas, son proteínas que poseen grupos
químicos ionizables (carboxilos, -COOH; amino, -NH2; tiol, -SH; imidazol, etc.) en
las cadenas laterales de sus aminoácidos y poseen una conformación natural más
estable que las demás conformaciones posibles; son altamente especializadas que
tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones
químicas que se llevan a cabo en los sistemas biológicos .
Las enzimas sufren cambios en la conformación estructural que suelen ir asociados
con cambios en la actividad catalítica, donde el pH y la temperatura son los
factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de un enzima;
según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva,
negativa o neutra y como la conformación de las proteínas depende, en parte, de

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sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada
para la actividad catalítica, éste es el pH óptimo, pero la
mayoría son muy sensibles a los cambios de pH; tal es así que, desviaciones
de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar
drásticamente su actividad, al provocar la desnaturalización de la proteína en los
procesos industriales se utilizan las soluciones amortiguadores (buffer) más o
menos complejos para mantener estable el pH.
Las enzimas convierten a los procesos industriales en eficientes y menos costosos,
por su alto grado de especificidad y adaptabilidad, acumulan más material
procesado y consumen menos cantidad de energía, su labor hidrolítica implica la
ruptura de un enlace mediante la adición de los elementos del agua, por lo que los
polisacáridos son degradados hasta
monosacáridos, como es el caso de la hidrolisis de almidón a glucosa El proceso de
hidrólisis de almidón ocurre mediante varias etapas catalizados por enzimas entre
las que destacan la α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasas y otras, y al parecer solo la
α-amilasa puede atacar gránulos de almidón intactos, y la β-amilasa y
glucoamilasa, actúan sobre los primeros
productos liberados por la α-amilasa, que hidroliza de manera aleatoria enlacesα-
1,4 en las moléculas de amilosa y amilopectina; al principio creando huecosal azar
en los granos de almidón y liberando productos que aun son grandes. En las
cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la α-amilasa produce
maltosa, un disacárido que contiene dos unidades de glucosa; y no ataca enlaces
α-1,6 localizados en los puntos de
ramificación de la amilopectina, por lo que la digestión de amilopectina cesa
cuando aún quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta muchas
α-amilasas son activadas por Ca2+elemento esencial durante el proceso hidrolítico

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MATERIALES Y MÉTODOS
A.-Materiales

Material de Laboratorio
 Portaobjetos
 placas petri
 Mechero
 Algodón
 Asa de Drygalski

Material Biológico
 Cultivos puros de Bacillus subtilis y Staphylococcus sp.

Reactivos
 Agar almidón
 Lugol
 Alcohol Acetona
 Safranina
 Cristal Violeta
 Aceite de inmersión

Equipos
 Microscopio Binocular LED OLYMPUS, MODELO CX23LFS1
 Cabina de bioseguridad de 4 pies clase ii tipo a2, marca esco, modelo la2-
4a3, calidad Labculture

B.-Metodología :
 Preparación de la suspensión y observación microscópica:
- Encender el mechero de alcohol y esterilizar el asa bacteriológica en llama
directa , enfriar y tomar 1 colonia y preparar suspensión en un tubo con 2 ml.
- Con el asa bacteriológica estéril tomar dos gotas de suspensión, realizar
extendido sobre un portaobjetos y luego esterilizar el asa bacteriológica a
llama directa y dejar sobre la mesa de trabajo.

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 - Fijar el extendido al calor del mechero y realizar coloración GRAM(revisar
práctica de tinciones), secar.
- Luego añadir 1 gota de aceite de inmersión y observar a 100x
 Preparación de inóculo
Añadir con una pipeta poco a poco SSF estéril en el tubo de la suspensión hasta
lograr la turbidez del tubo de Mac Farland N°0.5 (equivalente a 1.5 x 10 8 cel.)
 Siembra en agar almidón
- Con una pipeta estéril medir 0.1 ml de la suspensión equivalente al tubo
0.5 de Mac Farland y sembrar por superficie,
- Extender la muestra con el asa de Drigalski
- Incubar de por 24 a 48 horas en la estufa a 37°C
 Verificación de la hidrólisis de almidón por Bacillus subtilis
 Observar directamente los halos de hidrolisis alrededor de las colonias,
utilizar el cuenta colonias para un mayor acercamiento y contar las
colonias.
 Añadir Lugol para verificar la degradación del almidón y esquematizar.
 Control negativo
- Repetir todo el proceso anterior, pero utilizar el cultivo puro de
Staphylococcus sp

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 Muestra:…………………………………………………………………………………..

Preparado:……………………….
Coloración:…………………………

Hidrólisis de almidón: ………..

Aumento ………………………

 Siembra de Bacillus Subtilis en TSI

- Esterilizar el asa bacteriológica en punta a llama directa enfriar
- Tomar una colonia del cultivo puro de Bacillus Subtilis proporcionado, y
sembrar por picadura y estría en los tubos conteniendo TSI.
- Incubar de 24 a 48 horas.
- Repetir el proceso con Staphylococcus aureus.
- Observar, esquematizar e interpretar resultados

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I. REFERENCIA BIBLIOGRAFÍA
El alumno deberá reportar la bibliografía consultada para su informe individual, según las
normas ISO 690 y 690-2. (Recomendable libros de la biblioteca UCV u otras instituciones
y direcciones web)

V.-ANEXOS
Incluir los cuadros o tablas que permitirán recolectar los datos para su posterior
procesamiento, fotos etc.
direcciones web)
V.-ANEXOS

Incluir los cuadros o tablas que permitirán recolectar los datos para su posterior
procesamiento, fotos etc

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