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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS

GONZAGA DE ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ANALISIS MICROBIOLOGICO

TEMA: MEDIOS DE CULTIVO

DOCENTE: Q.F. BERTHA RAMOS

ALUMNA: ANGELA SORIA PINEDA

CICLO: IX
INTRODUCCION

Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de información que puede


obtenerse de un individuo es muy limitada. Por ello es necesario el estudio de
poblaciones, que contienen miles o millones de individuos. Estas poblaciones se
obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien
definidas, como cultivos.

El estudio de estos cultivos permite detectar la presencia de microorganismos en una


muestra y su posterior identificación, efectuar pruebas de susceptibilidad de estos
microorganismos a antibióticos o a antisépticos concretos, etc.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es


observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de
10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en


composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.
MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGIA

DEFINICION DE CULTIVO:

En biología, y específicamente en microbiología, un


cultivo es un método para la multiplicación de
microorganismos, tales como bacterias y virus, en el que
se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso
deseado. Un cultivo es empleado como un método
fundamental para el estudio de las bacterias y otros
microorganismos que causan enfermedades.

Se entiende por medio de cultivo la mezcla de sustancias,


naturales, sintéticas o ambas, que permite el
crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite mantener su
viabilidad.

Los medios de cultivo son otro de los productos que encontraremos en los
laboratorios de análisis clínicos. La mayoría de ellos pueden prepararse en el
propio laboratorio, pero cada vez es más habitual que se adquieran preparados
listos para su uso.

CARACTERÍSTICAS:

Un microorganismo se siembra en un medio líquido o en la superficie de un medio


sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde
azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de
carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por
muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células
que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada
bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por
decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se
siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de
bacteria.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación


de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es
atacado por aquellas que crecen en él.

Diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido: El medio de


cultivo sólido contiene entre 1.5 Y 2% de agar-agar; el medio líquido
no contiene agar-agar.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de


enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden
para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo,
la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras
(el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH
ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayoria de las bacterias Gram-positivas).

INDICACIONES:

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible


diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de
bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo
especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la
mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está
presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que
sólo pueden utilizar algunas bacterias.

En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los
nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son
capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el
cultivo se realiza en un tubo cerrado.
A la izquierda, placas de Petri con cultivos
bacterianos en medio sólido. A la derecha,
tubos con cultivos en medio líquido
inoculados con puntas de micropipeta.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas
que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de
romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables
macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de
cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para
identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los
que son sensibles esas bacterias.

Los cultivos suelen usarse en medicina para determinar la presencia de agentes


patógenos en fluidos corporales (p. ej. la sangre o la orina).

CONDICIONES REQUERIDAS:

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado


por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por
completo al propio medio.

Los medios de cultivo para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos
a partir de ellos sean confiables deben cumplir con los siguientes requisitos:

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados:

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,


como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de
donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de


carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de
los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es


utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y
otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a


muchas sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente
de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como


indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer
de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- Consistencia adecuada del medio:

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo


productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto
de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y


comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.

3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases:

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero
los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en
una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias
(tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- Condiciones Adecuadas De Humedad:

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es


imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los
cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se
deseque el medio.

5- Luz ambiental:

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en


presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

6- pH:

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los


microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.

7- Temperatura:

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y


43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y
los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio:

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

PRESENTACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes:

Medios Líquidos o caldos de cultivo: Son los que una vez preparados se mantienen en
estado líquido. Suelen utilizarse para realizar la suspensión de disolución de la muestra a
analizar con el fin de conseguir la disolución madre. Pueden presentarse en bolsas de 5
litros, en frascos de 250 ml, o en tubos de un solo uso.

Medios sólidos: Contiene un agente espesante, por lo general agar a una concentración
del 1,5 %. El agar es un derivado de algas. Es sólido a temperaturas inferiores a los 40 o
45ºC.

Medios semisólidos: Tienen una consistencia intermedia entre la de los anteriores.


Suelen contener una concentración de agar del 0,7 %.

Tal como hemos apuntado, la mayoría de los medios de cultivo se compran hoy en día
ya preparados. Unos llegan para su uso en distintas presentaciones, y otros
deshidratados. La ventaja de los primeros es su comodidad y la desventaja, que su plazo
de conservación es corto. Los deshidratados, en cambio, pueden conservarse bastante
más tiempo, pero hay que prepararlos antes de usarlos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Atendiendo a su utilidad práctica:

MEDIOS PARA AISLAMIENTOS PRIMARIOS:

Para Usos Generales: No Selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos
difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre,
suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento
de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que


inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el
crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de
selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).

Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo


de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +.
Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituímos la glucosa por maltosa,
seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla

Enriquecidos: Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de


cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas
como sangre, suero, extractos de tejidos animales. Estos medios son los medios
enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes
o fastidiosos.

Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y


crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Ejemplo: agar-sangre.

Para Aislamientos Especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen


requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación
(Lowenstein).

MEDIOS PARA IDENTIFICACIÓN:


Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades
fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias.
Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier
bacteria (Oxidación-Fermentación).

Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados


microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera
determinada.

Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos
permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma
colonias de color verde claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa
salmón.

Medios Selectivos Y Diferenciales: Es un medio específico para enterobacterias. Cristal


violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que sólo se desarrollen las gram - que
puedan tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo
a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y
lactosa. Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares.

Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla,


libera ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella
no tolera la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras.

ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL:

AGAR SANGRE: Medio enriquecido, estándar. El AS al 5% con base de Tripticasa-


Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos
exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, así como los
del género Candida. Tambìén permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes
como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y
Pasteurella

AGAR POLIVITEX (chocolate): Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en


medios habituales. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al
aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros
microorganismos exigentes. Con un medio análogo a éste es con el que Thayer y Martin
han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, después de añadir
antibióticos.

MAC CONKEY: Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de


sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es
baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para
inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y
enterococos.

SCHAEDLER: medio básico enriquecido con sangre. Este medio reductor está
particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios.
KANA-VANCO: Con Kanamicina y Vancomicina. Contiene 75 µg/ml de
Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios
excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los
microorganismos GramPositivos.

SALMONELLA-SHIGELLA: medio altamente selectivo para Salmonella y


Shigella.

PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO:

Los medios de cultivo que no se adquieren listos para su uso deben prepararse en el
laboratorio (siguiendo las indicaciones de los fabricantes en el caso de los que parten de
medios comerciales deshidratados). Posteriormente se esterilizan, se revisan y se
conservan.

Consejos de preparación:
• Cuando peses medios de cultivo deshidratados, ten cuidado de no inhalar el
polvo desprendido. Algunos contienen sustancias tóxicas para las personas.

• Los medios se preparan en frascos ISO de capacidad suficiente para facilitar la


agitación y la completa disolución de los distintos componentes. Pero también se
pueden utilizar autopreparadores, si el volumen de medio que se necesita es
superior a 2L
• .Añade paulatinamente el agua necesaria, evitando formar una masa compacta.
Todos los medios deshidratados se preparan añadiendo agua desionizada o
destilada de calidad comprobada.
• La solución o la suspensión que se haga debe ser totalmente homogénea. Si
necesita calentarse, hazlo lo mínimo posible. Es recomendable calentar el agua a
50-65 ºC, antes de añadirla porque eso favorece notablemente la disolución. Los
componentes deben agitarse mientras se calientan, sobre todo los agares.

Esterilización:

Algunos medios de cultivo se esterilizan con autoclave, otros al baño María y otros
mediante filtración por membrana. Todos ellos son procedimientos de esterilización. En
todo caso las indicaciones del fabricante te indicarán que procedimiento debes seguir en
cada uno de los medios comerciales deshidratados.

Revisión:

Es importante comprobar que el medio que acabas de preparar se comporta


correctamente. Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son:

1. Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista, atendiendo a su color, a


su opalescencia y transparencia, a la humedad en las placas ya preparadas y a la posible
aparición de precipitados.

2. Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en


medios con un pH neutro.

3. Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 30 ºC durante 72 horas una


pequeña porción, representativa del lote de medio preparado, para comprobar que allí no
crecen gérmenes.

4. Prueba de la eficacia: En una pequeña porción representativa del medio preparado, se


inocula un microorganismo - normalmente el propio fabricante aconseja el más
adecuado- y se cultiva. Así se comprueba si en el medio de cultivo preparado ese
microorganismo se desarrolla correctamente.

Conservación:

Cada lote de medio de cultivo, una vez preparado, esterilizado, revisado y en su


presentación final, se identifica mediante una etiqueta con el nombre del medio de
cultivo correspondiente, el número de lote y la fecha de caducidad.

Se almacenan en frigorífico a 4ºC. No los guardes por debajo de 0ºC, porque eso altera
la estructura del agar. Los medios preparados en placas se guardan en bolsas de plástico,
precintadas con cinta adhesiva para preservarlos de la desecación, y se ponen en la
nevera en posición invertida, para evitar la caída de gotas de condensación sobre el
medio.
BIBLIOGRAFÍA

o http://html.rincondelvago.com/cultivo-de-microorganismos.html

o http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

o http://www.mailxmail.com/curso-analisis-clinicos/medios-cultivo