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Medios de Cultivo

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UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ANALISIS MICROBIOLOGICO

TEMA: MEDIOS DE CULTIVO

DOCENTE: Q.F. BERTHA RAMOS

ALUMNA: ANGELA SORIA PINEDA

CICLO: IX

INTRODUCCION

Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de información que puede obtenerse de un individuo es muy limitada. Por ello es necesario el estudio de poblaciones, que contienen miles o millones de individuos. Estas poblaciones se obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien definidas, como cultivos. El estudio de estos cultivos permite detectar la presencia de microorganismos en una muestra y su posterior identificación, efectuar pruebas de susceptibilidad de estos microorganismos a antibióticos o a antisépticos concretos, etc. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGIA

DEFINICION DE CULTIVO:

En biología, y específicamente en microbiología, un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos, tales como bacterias y virus, en el que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado como un método fundamental para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades. Se entiende por medio de cultivo la mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite mantener su viabilidad. Los medios de cultivo son otro de los productos que encontraremos en los laboratorios de análisis clínicos. La mayoría de ellos pueden prepararse en el propio laboratorio, pero cada vez es más habitual que se adquieran preparados listos para su uso. CARACTERÍSTICAS: Un microorganismo se siembra en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. Diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido: El medio de cultivo sólido contiene entre 1.5 Y 2% de agar-agar; el medio líquido no contiene agar-agar.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

INDICACIONES: Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.

A la izquierda, placas de Petri con cultivos bacterianos en medio sólido. A la derecha, tubos con cultivos en medio líquido inoculados con puntas de micropipeta.

Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos suelen usarse en medicina para determinar la presencia de agentes patógenos en fluidos corporales (p. ej. la sangre o la orina).

CONDICIONES REQUERIDAS: El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. Los medios de cultivo para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables deben cumplir con los siguientes requisitos: 1- Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de

estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchas sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. 3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- Condiciones Adecuadas De Humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que

mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. 6- pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. 7- Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios. 8- Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

PRESENTACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo se utilizan en una de las formas siguientes: Medios Líquidos o caldos de cultivo: Son los que una vez preparados se mantienen en estado líquido. Suelen utilizarse para realizar la suspensión de disolución de la muestra a analizar con el fin de conseguir la disolución madre. Pueden presentarse en bolsas de 5 litros, en frascos de 250 ml, o en tubos de un solo uso. Medios sólidos: Contiene un agente espesante, por lo general agar a una concentración del 1,5 %. El agar es un derivado de algas. Es sólido a temperaturas inferiores a los 40 o

45ºC. Medios semisólidos: Tienen una consistencia intermedia entre la de los anteriores. Suelen contener una concentración de agar del 0,7 %. Tal como hemos apuntado, la mayoría de los medios de cultivo se compran hoy en día ya preparados. Unos llegan para su uso en distintas presentaciones, y otros deshidratados. La ventaja de los primeros es su comodidad y la desventaja, que su plazo de conservación es corto. Los deshidratados, en cambio, pueden conservarse bastante más tiempo, pero hay que prepararlos antes de usarlos.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Atendiendo a su utilidad práctica: MEDIOS PARA AISLAMIENTOS PRIMARIOS: Para Usos Generales: No Selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina). Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituímos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla Enriquecidos: Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales. Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos. Suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Ejemplo: agar-sangre. Para Aislamientos Especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein). MEDIOS PARA IDENTIFICACIÓN:

Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación). Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera determinada. Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa salmón. Medios Selectivos Y Diferenciales: Es un medio específico para enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que sólo se desarrollen las gram - que puedan tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa. Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera ácidos, por lo que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras.

ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL: AGAR SANGRE: Medio enriquecido, estándar. El AS al 5% con base de TripticasaSoja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, así como los del género Candida. Tambìén permite el crecimiento de algunos gérmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y
Pasteurella

AGAR POLIVITEX (chocolate): Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en medios habituales. El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden crecer muchos otros

microorganismos exigentes. Con un medio análogo a éste es con el que Thayer y Martin han hecho sus primeros asilamientos selectivos de gonococos, después de añadir antibióticos.

MAC CONKEY: Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

SCHAEDLER: medio básico enriquecido con sangre. Este medio reductor está particularmente adaptado al cultivo de los gérmenes anaerobios.

KANA-VANCO: Con Kanamicina y Vancomicina. Contiene 75 µg/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayoría de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 µg/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayoría de los microorganismos GramPositivos.

SALMONELLA-SHIGELLA: medio altamente selectivo para Salmonella y Shigella.

PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo que no se adquieren listos para su uso deben prepararse en el laboratorio (siguiendo las indicaciones de los fabricantes en el caso de los que parten de medios comerciales deshidratados). Posteriormente se esterilizan, se revisan y se conservan. Consejos de preparación:

Cuando peses medios de cultivo deshidratados, ten cuidado de no inhalar el polvo desprendido. Algunos contienen sustancias tóxicas para las personas.

• •

Los medios se preparan en frascos ISO de capacidad suficiente para facilitar la agitación y la completa disolución de los distintos componentes. Pero también se pueden utilizar autopreparadores, si el volumen de medio que se necesita es superior a 2L .Añade paulatinamente el agua necesaria, evitando formar una masa compacta. Todos los medios deshidratados se preparan añadiendo agua desionizada o destilada de calidad comprobada. La solución o la suspensión que se haga debe ser totalmente homogénea. Si necesita calentarse, hazlo lo mínimo posible. Es recomendable calentar el agua a 50-65 ºC, antes de añadirla porque eso favorece notablemente la disolución. Los componentes deben agitarse mientras se calientan, sobre todo los agares.

Esterilización: Algunos medios de cultivo se esterilizan con autoclave, otros al baño María y otros mediante filtración por membrana. Todos ellos son procedimientos de esterilización. En todo caso las indicaciones del fabricante te indicarán que procedimiento debes seguir en cada uno de los medios comerciales deshidratados.

Revisión: Es importante comprobar que el medio que acabas de preparar se comporta correctamente. Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son: 1. Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista, atendiendo a su color, a

su opalescencia y transparencia, a la humedad en las placas ya preparadas y a la posible aparición de precipitados. 2. Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro. 3. Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 30 ºC durante 72 horas una pequeña porción, representativa del lote de medio preparado, para comprobar que allí no crecen gérmenes. 4. Prueba de la eficacia: En una pequeña porción representativa del medio preparado, se inocula un microorganismo - normalmente el propio fabricante aconseja el más adecuado- y se cultiva. Así se comprueba si en el medio de cultivo preparado ese microorganismo se desarrolla correctamente. Conservación: Cada lote de medio de cultivo, una vez preparado, esterilizado, revisado y en su presentación final, se identifica mediante una etiqueta con el nombre del medio de cultivo correspondiente, el número de lote y la fecha de caducidad. Se almacenan en frigorífico a 4ºC. No los guardes por debajo de 0ºC, porque eso altera la estructura del agar. Los medios preparados en placas se guardan en bolsas de plástico, precintadas con cinta adhesiva para preservarlos de la desecación, y se ponen en la nevera en posición invertida, para evitar la caída de gotas de condensación sobre el medio.

BIBLIOGRAFÍA o http://html.rincondelvago.com/cultivo-de-microorganismos.html

o

http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

o

http://www.mailxmail.com/curso-analisis-clinicos/medios-cultivo

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