Unidad 2. TCNICAS BACTERILGICAS.

2.1 Preparacin de Medios de Cultivo.

Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los principios del aislamiento. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. Las caractersticas de los microorganismos a tomar en consideracin al momento de preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son: Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los cuales se los clasifica en auttrofos, hetertrofos, quimiotrofos (littrofos u organotrofos) y fottrofos. Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos. Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en psicrfilos, mesfilos y termfilos. Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,2.

2.1.1 Caractersticas generales de un buen medio de cultivo.

Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no contenga sustancias inhibidoras. Como ya se ha sea lado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo en el hbitat natural. La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los microorganismos. Si se requiere sangre u otros componentes inestables, como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, cuando se requiera estos se esterilizaran por otro mtodo y se agregaran al medio cuando se encuentre entre 45 a 50 C. En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

2.1.2 Constituyentes habituales de los medios de cultivo.

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin. Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento. Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar del 3 al 5 %. Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteasas, peptonas, polipptidos y aminocidos. Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

2.1.3 Preparacin.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una receta que deber respetarse estrictamente.

En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo. Primero se agrega la mitad del volumen de agua destilada o desionizada a un matraz Erlenmeyer o baln, luego se incorpora el medio deshidratado, se homogeniza el medio en el agua y se vierte la volumen faltante de agua tratando de remover el medio que se quedo sobre las paredes del matraz. Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. La disolucin de los medios puede requerir hervir por 3 a 5 min. Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N). Si la presentacin del medio ser en tubo es necesario transferir el volumen adecuado a cada tubo y despus realizar el proceso de esterilizacin. Si el medio se dispondr en cajas se esteriliza en el matraz y se transfiere a las cajas una vez esterilizado cuando se encuentre a 45 C, a esta temperatura el medio an se mantiene en estado lquido y se formara la menor cantidad de agua de condensacin en la tapa de la caja, recordemos que el agar se solidifica o gelifica a los 42 C.

2.2 Control de Calidad para los medios de cultivo.

El laboratorio de Bacteriologa debe asegurarse del adecuado funcionamiento de los medios de cultivo antes de usarlos, tanto si son comerciales como preparados en el laboratorio. A nivel nacional los laboratorios que comercializan o realicen sus propios medios de cultivo estn obligados a cumplir lo indicado en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo, as como lo descrito en el documento CLSI M22-A3 "Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition. Los medios de cultivo deben estar sometidos a un proceso de control de calidad interno que asegure que son estriles, que permiten el crecimiento de microorganismos especficos y/o inhiben el crecimiento de otros y que proporcionan una adecuada respuesta bioqumica. Prueba de esterilidad. Se toma una muestra representativa de cada lote de medios de cultivo preparados y se introduce en la incubadora a 37C durante 24 hrs. Una vez cumplido este tiempo se retiran de la incubadora y se revisa cada cajo o tubo sometido a esta prueba. Un medio de cultivo estril no presentara desarrollo de bacterias y esto nos indicara que el lote preparado puede ser utilizado. El observar desarrollo bacteriano nos indica que el proceso de esterilizacin no fue eficaz y por lo tanto el lote preparado no se encuentra estril y debe ser rechazado para su uso. Prueba de promocin de crecimiento. Se toma una muestra representativa de cada lote de medio de cultivo preparado y estos son inoculados con cepas de referencia (ATCC), se introducen a la incubadora a la temperatura y el tiempo adecuado para cada cepa de referencia. Una vez que se cumple el tiempo de incubacin se retiran los medios de la incubadora y se revisan verificando el crecimiento de las cepas de referencia. Esta prueba tambin nos permite validar el efecto inhibidor del medio de cultivo al inocular cepas que de manera normal no crecen en los medios de cultivo ya que estos presentan algn factor que inhiben su crecimiento. Cuando se observa el crecimiento de una cepa que debe ser inhibida, nos

indica que el factor inhibidor del medio esta fallando por lo cual no es conveniente utilizar este medio de cultivo. Esta prueba se realiza principalmente a los medios de cultivo selectivos. Es posible demostrar las caractersticas bioqumicas del medio de cultivo inoculando cepas de referencia que manifestaran los cambios caractersticos del medio cultivo los cuales se manifestaran la mayora de las ocasiones por un cambio o vire de color que se puede observar en las colonias o en la superficie del medio. Esto debe realizarse principalmente en medios de cultivo diferenciales.

2.2.1 Medios de cultivo comerciales.

Es recomendable que sean proporcionados por el fabricante los certificados de calidad correspondientes a cada envo o lote fabricado de cada medio de cultivo. El fabricante debe aportar informacin sobre: el nombre del medio, nmero de lote, cantidad enviada y fecha de caducidad. Adems, para cada lote de medio debe facilitar un certificado del control de calidad en el que se especifican las condiciones de conservacin, control de esterilidad, criterios de aceptabilidad, control del funcionamiento indicando las cepas utilizadas, fecha de emisin y firma del responsable del laboratorio fabricante. Antes de introducir un nuevo medio en el laboratorio, debe ser validado con cepas de referencia; este procedimiento debe repetirse siempre que el fabricante indique que las caractersticas del medio han cambiado o que se detecte alguna deficiencia en el uso rutinario. Tras la recepcin de los medios en el laboratorio y antes de usarlos, hay que comprobar las caractersticas fsicas (color, precipitados, placas rotas, excesivo nmero de burbujas, crecimiento de colonias, etc.) y se debe documentar cualquier anomala detectada. El control de calidad se completa con el estudio de la esterilidad y la comprobacin del crecimiento de microorganismos especficos y/o inhibicin de otros, o bien produccin de reacciones bioqumicas o morfologas tpicas de los microorganismos ensayados. Segn los requerimientos de control de calidad los medios comerciales se clasifican en: - Medios exentos: no requieren que el laboratorio controle su esterilidad o su adecuado funcionamiento, siempre que el fabricante aporte las especificaciones de calidad correspondientes. - Medios no exentos: el usuario debe comprobar su esterilidad y funcionamiento, ya que puede variar en funcin del lote. El documento del NCCLS (ahora CLSI) M22-A3 "Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media; Approved Standard-Third Edition" proporciona una relacin detallada de medios exentos y no exentos (ver Tabla 1B del documento citado). Algunos de los medios recogidos como exentos son:

- Agar sangre (no selectivo) - Agar chocolate - Caldo tioglicolato - Caldo BHI o TSB - Medios de hemocultivo - Agar sangre colistina

- Agar Salmonella- Shigella (SS) - Caldo Selenito o caldo GN - Agar CLED - Agar Levine o Agar EMB - Agar MacConkey - Agar para Legionella

nalidxico - Agar manitol-sal - Agar alcohol fenil etlico - Agar selectivo para enterococo - Agar TCBS - Agar Hektoen - Agar XLD - Agar CIN

CYE/BCY - Agar Brucella - Agar yema de huevo - Agar sangre lacada con kanamicina - Agar Sabouraud dextrosa - Agar cornmeal - Lowenstein-Jensen - Agar Middlebrook

Entre los medios no exentos se encuentran el agar Mueller-Hinton, los medios selectivos para cultivo de Neisseria spp. y Campylobacter spp., entre otros. El laboratorio debe repetir el control de esterilidad y funcionamiento en estos medios y en cualquiera de los relacionados anteriormente que demuestren alguna deficiencia en la recepcin o durante su uso, hasta que el problema quede resuelto. El laboratorio puede decidir incluir tambin en el control del funcionamiento a los medios de cultivo exentos, y segn la carga de trabajo, puede realizarlo nicamente en algunos lotes elegidos aleatoriamente. Si los medios comercializados proceden de empresas no certificadas por la norma ISO o no cumplen con las especificaciones de calidad recomendadas, el usuario debe realizar el control de todos los lotes que se reciben como si se tratase de medios preparados en el laboratorio. Cualquier deficiencia en el aspecto fsico, esterilidad, no crecimiento de la cepa deseada, o no inhibicin de la cepa no deseada, ser documentada y notificada a los fabricantes para que emprendan las medidas correctoras.

2.2.2 Medios de cultivo preparados en el laboratorio.

Algunos medios de cultivo se preparan en el propio laboratorio, bien porque es necesario que sean recientes para determinados cultivos o porque se debe disponer de ellos inmediatamente y no hay tiempo de solicitarlos a un fabricante. En este caso, hay que controlar el medio deshidratado, los aditivos que se van a utilizar, el procedimiento de la elaboracin, el envasado, etiquetado y almacenamiento y por ltimo, comprobar las caractersticas fsicas, esterilidad y funcionamiento del medio preparado con cepas de referencia. Todas las fases del proceso han de estar documentadas en un manual de procedimiento y debe mantenerse un registro detallado de las mismas. Los medios deshidratados y aditivos que se utilizan para preparar los medios deben estar etiquetados con las fechas de caducidad, de recepcin y la fecha en la que se abrieron por primera vez y se deben almacenar en condiciones adecuadas. El proceso de elaboracin debe quedar registrado, anotando la identidad de los medios, nmero de lote o fecha de preparacin, condiciones de almacenamiento, fecha de caducidad y la identidad de la persona que los ha preparado. Es recomendable que cada placa o tubo individual vaya identificado con el nombre del medio y nmero de lote o fecha de preparacin. Los tubos o placas preparados se deben almacenar en las condiciones adecuadas establecidas.

Para realizar el control de calidad del medio una vez preparado, se seguir el mismo procedimiento que para los medios comerciales no exentos.

2.3 Cultivo de Microorganismos.

En muchos aspectos, el pequeo tamao de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentacin. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rpida multiplicacin de estas diminutas criaturas constituye tambin una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo da, Es ms, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cultivarlos en el laboratorio. Cultivo. Mtodo de propagacin de bacterias invitro, para lo cual se requiere realizar un medio de cultivo ptimo que permita el crecimiento bacteriano. Cepa. Variante fenotpica constituida por bacterias de la misma especie. Cepario. Coleccin de cepas de referencia (ATCC), utilizadas para llevar acabo las pruebas de control de calidad en el laboratorio de bacteriologa.

2.3.1 Curva de crecimiento microbiana.

El crecimiento se define como el aumento armnico de todos los constituyentes bacterianos, este crecimiento lleva a un incremento del tamao y peso de las bacterias, generando la divisin bacteriana y con esto un aumento en el numero de bacterias, estos se denomina crecimiento poblacional que no se debe confundir con el crecimiento individual que implica solamente aumento del tamao, del volumen y diferenciacin de un solo individuo. En general cuando se hace referencia al crecimiento bacteriano, ste se considera como el crecimiento poblacional. El crecimiento bacteriano es el resultado de la actividad concertada de ms de 2000 reacciones enzimticas entre las que destacan los siguientes tipos. Reacciones de transformacin y captacin de energa. Reacciones de biosntesis de molculas pequeas. Reacciones de biosntesis de macromolculas.

El tiempo necesario para que se formen dos bacterias a partir de una se llama tiempo de generacin y el tiempo que se requiere para que una poblacin bacteriana se duplique se denomina tiempo medio de generacin, el cual, en la mayora de los documentos escritos se considera slo como el tiempo de generacin. El crecimiento microbiano siempre depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio, que son la composicin qumica del mismo, la tensin de oxgeno, de bixido de carbono, viscosidad, actividad de agua, presin osmtica, presencia de sustancias nocivas, temperatura, pH, entre otras. Los tiempos de generacin son caractersticos para cada microorganismo y dependen de la condicin del medio en el que se encuentren. Si se construye una grfica del crecimiento en funcin del tiempo, se obtendr lo que se conoce como curva de crecimiento bacteriano.

Como se ve en la figura, la curva de crecimiento bacteriano consta de cuatro fases principales; 1) Fase de adaptacin o latencia, tambin llamada fase Lag por ser sta su designacin en ingls, durante esta fase los bacterias se adaptan a las condiciones del medio de cultivo, se disponen a expresar su capacidad de utilizar los componentes del medio en las condiciones del cultivo. Las bacterias utilizan los nutrientes del medio de cultivo, los transforman e incorporan para obtener la energa necesaria para su reproduccin. En esta fase no se observa un incremento en el nmero de bacterias, pero si se observa un incremento en el tamao y en la actividad metablica de cada bacteria, observndose un incremento en la produccin de macromolculas (RNA, DNA y Protenas), lo cual se conoce como crecimiento desbalanceado. La duracin de esta fase depende del tipo de microorganismo, de la edad y la composicin del medio de cultivo del que proviene el inculo. 2) Fase exponencial. Esta fase tambin es llamada de crecimiento exponencial o logartmico, se caracteriza por que las bacterias despliegan todo su potencial metablico, todos los componentes bacterianos se sintetizan en equilibrio, a esto se denomina crecimiento balanceado. Durante esta fase las bacterias transforman los nutrientes a la mxima velocidad y la obtencin de energa es ptima. La poblacin se duplica cada tiempo de generacin provocando un incremente en exponencial en el nmero de bacterias, aqu es donde se producen los llamados metabolitos primarios, por ejemplo los aminocidos y cidos orgnicos. 3) Fase estacionaria. Es en esta fase donde la concentracin uno o ms componentes del medio de cultivo, se ha reducido hasta producir una disminucin en la velocidad de las reacciones metablicas. Esto tambin puede deberse a la acumulacin de sustancias txicas para las propias bacterias o los cambios en el pH del medio de cultivo. En esta fase el nmero de bacterias se mantiene constante, ya no hay incremento en el nmero de bacterias pero se puede observar un incremento en el tamao de cada bacteria. En esta fase las bacterias

liberan al medio de cultivo los llamados metabolitos secundarios como los antibiticos y los pigmentos. 4) Fase de muerte. En esta fase la poblacin disminuye en una alta proporcin cada cierto tiempo por lo que tambin es llamada fase de muerte exponencial. Esta fase refleja un deterioro metablico de las bacterias lo cual causa que los individuos ms susceptibles mueran, esto ocasiona una disminucin en el nmero de bacterias del cultivo.

2.3.1 Obtencin de un cultivo puro o axnico

Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. La obtencin de un cultivo axnico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes.

2.4 Mtodos de Esterilizacin.

Para obtener un cultivo axnico y el aislamiento de bacterias a partir de una muestra biolgica se requieren tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes utilizados. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados para que se pueda obtener un cultivo axnico y en el proceso de muestra para evitar que estos microorganismos interfieran en la obtencin de los resultados, recordemos que un microorganismos patgeno deber competir por los nutrimentos con la microbiota asociada o normal presente en la muestra, as como con los microorganismos contaminantes si estos no son eliminados, lo cul puede reducir la probabilidad de aislar al patgeno. La eliminacin de todos los microorganismos se denomina esterilizacin. En el laboratorio de bacteriologa todo el material utilizado para el proceso de muestras debe ser esterilizado. Esto incluye el medio, las sustancias lquidas o slidas que se aadan como nutrientes al cultivo, los matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Una vez esterilizado se debe cuidar que el material se conserve estril para lo cual se debe preparar el material para ser utilizado, as a los tubos, matraces y otros recipientes se les coloca un tapn de algodn que evitara el acceso de microorganismos del ambiente al interior. Tambin es necesario proteger este tapn con papel para evitar que se humedezca con agua de condensacin. Algunos materiales son envueltos con papel para conservar su condicin de esterilidad.

2.4.1 Conceptos bsicos.

Para poder desempear correctamente las tareas en un laboratorio de microbiologa, es indispensable contar con conocimientos tericos acerca de los diferentes mtodos de control del crecimiento microbiano (mtodos de esterilizacin, desinfeccin, apepsia, etc.). Tambin con un buen manejo prctico de los aparatos destinados a tal fin, del flameado de tubos y la esterilizacin de asas a la flama del mechero.

Esterilizacin. Es el proceso de destruccin o eliminacin completa de toda forma de vida existente en el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones, filtracin, etc. Por lo tanto, la esterilizacin es un trmino absoluto e incluye la destruccin de las esporas y formas vegetativas, los virus, etc. Desinfeccin. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos ms comunes pero no las esporas. Generalmente los desinfectantes son productos qumicos excesivamente txicos para ser usados directamente sobre tejidos vivos. Muy pocos desinfectantes llegan a esterilizar. Antisepsia. Es un proceso en el que se destruyen las formas vegetativas de los microorganismos patgenos ms comunes, pero no necesariamente esporas, presentes sobre el cuerpo, la piel, las mucosas, los tejidos vivos, etc. El agente empleado se denomina antisptico. Asepsia. Se refiere a la condicin de ausencia de microorganismos de un objeto o rea. Por ejemplo, las tcnicas aspticas son las que evitan la contaminacin propia de otros o de los materiales durante el trabajo. Microbiostasis. Es una condicin por la que el crecimiento o la multiplicacin de los microorganismos estn inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el agente microbiosttico es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De igual definicin pero de aplicacin a la correspondiente categora de microorganismos son los fungistticos y los bacteriostticos. Microbiocida. Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos. De igual significado pero con mbito ms restringido son los trminos fungicida y bactericida. Sepsis. Es un trmino que proviene de un vocablo griego que significa putrefaccin. El concepto se utiliza como sinnimo de septicemia, que es la afeccin generalizada que se produce por la presencia de microorganismos patgenos o de sus toxinas en la sangre. Estril. Condicin que significa libre de toda seal de vida. Pasteurizacin. Proceso de exponer un objeto a agua caliente a 77C, durante 30 minutos. Su propsito: destruir todos los microorganismos patgenos, excepto esporas bacterianas. Liofilizacin. Es una tcnica de deshidratacin por frio, un proceso comn en la industria alimentaria conocido como deshidrocongelacin (secado por congelacin suena ms sencillo) el cual tiene la virtud de mantener al mximo las propiedades organolpticas de los alimentos, permitiendo la eliminacin de bacterias al eliminar el agua de los alimentos.

2.4.2 Mtodos de esterilizacin.

El proceso de esterilizacin se puede llevar acabo por mtodos qumicos y fsicos, la seleccin de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar.

2.4.2.1 Mtodos Fsicos

2.4.2.1.1. El Calor.
Fundamento de la esterilizacin por calor. El calor acta desnaturalizando (coagulando) las protenas. En las formas esporuladas (de resistencia), esta accin se ve disminuida por la presencia de lpidos formando parte de su estructura qumica, que acta protegiendo las uniones peptdicas de las protenas. El calor es uno de los agentes fsicos ms usados. Su accin depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de aplicacin. De la consideracin de stos dos aspectos surgen las siguientes expresiones: Punto trmico mortal: es la menor temperatura capaz de matar una suspensin bacteriana en 10 minutos (tiempo constante y temperatura variable). Tiempo trmico mortal: es el menor tiempo necesario para matar una suspensin bacteriana a una temperatura determinada (tiempo variable y temperatura constante). Para medir el efecto del calor se debe tener en cuenta si se trata de formas vegetativas o esporuladas (de resistencia). Para eliminar las formas vegetativas no se requiere de temperaturas muy altas ya que la mayora se destruye a los 50 y 70C, especialmente las patgenas. Las bacterias esporuladas requieren de temperatura superiores a los 100C. Adems de la temperatura y el tiempo de exposicin es importante tener en cuenta la humedad, el pH y la naturaleza del material a esterilizar. La humedad hace ms efectivo el poder de penetracin del calor; en cuanto al pH, el agregado de ciertas sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullicin. FORMAS POSIBLES DE LA UTILIZACIN DEL CALOR COMO AGENTE ESTERILIZANTE El calor puede ser aplicado para la esterilizacin de tres maneras diferentes: Calor Seco. Es aire a temperatura elevada. Existen tres tipos: a) Fuego directo: Consiste en exponer directamente a la llama el material a esterilizar, lo que se logra por oxidacin violenta. Este mtodo se utiliza para asas, agujas, flameado de bocas de tubos u otros recipientes y destruccin de material contaminado. En las llamas de los mecheros Bunsen se alcanzan temperaturas superiores a los 2.500C, por lo que una breve exposicin es suficiente. Sin embargo, cuando las asas de siembra estn muy cargadas con microorganismos, la aplicacin directa de la llama provoca la dispersin irregular del contenido de aqullas, con el consiguiente peligro de la contaminacin. Un sistema alternativo a los mecheros son los incineradores elctricos bacterianos, en los que el riesgo de contaminacin no existe, ya que la dispersin es recogida en el tubo del aparato. b) Incineracin en hornos crematorios: Se aplica a elementos contaminados de los que no importa su destruccin, como apsitos, cadveres de animales infectados o material plstico contaminado (RPBI). Se utiliza la combustin directa o el horno crematorio. c) Aire caliente (ej. Horno Pasteur): Se emplean las estufas de calor seco, en las que el aire caliente circula por el espacio que existe entre la doble pared, transmitiendo as el calor a los objetos que se encuentran en su interior. Los microorganismos se mueren por oxidacin de sus estructuras previa deshidratacin, pudindose llegar a una ligera carbonizacin.

Tiempo requerido: Una hora y media a dos horas, a una temperatura de 160 a 180C. El tiempo se mide desde el momento en que se alcanz la temperatura indicada y est condicionado por la cantidad de material y su distribucin dentro de la estufa. El aire caliente no tiene mucho poder de penetracin, por esta razn es que se requiere mayor temperatura y tiempo que con otros mtodos. Aplicacin: se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio. Descripcin de la estufa: La estufa de esterilizacin a seco es una caja metlica de paredes triples. La pared interior es generalmente de acero inoxidable y presenta orificios para la libre circulacin del aire caliente. La pared intermedia encierra, junto con la externa, el material aislante, que puede ser lana de vidrio o amianto. La fuente de calor es una resistencia elctrica aunque tambin existen estufas a gas. Viene provista de un termorregulador para graduar la temperatura deseada. En la cara superior de la estufa existen orificios para permitir la salida de gases y vapores, pudiendo existir otro para la colocacin de un termmetro en caso de no traerlo incorporado. En el interior posee rejillas metlicas de altura graduable para acondicionar sobre ellas el material a esterilizar. Uso: Esterilizacin de material de vidrio y otros materiales termorresistentes que interese mantenerlos secos. Todo el material a esterilizar debe estar debidamente empaquetado con papel de estraza o contenido dentro de cajas metlicas, de modo tal que una vez retirado de la estufa, permanezca estril hasta el momento de ser usado.

Calor Hmedo. El vapor de agua es uno de los mtodos ms eficaces para destruir microorganismos, es mucho ms eficaz que el calor seco (aire). Hay varias formas de emplear el calor hmedo. a) Vapor a presin: Es uno de los mtodos ms utilizados; se emplea el autoclave para esterilizar material en general y particularmente para medios de cultivo y otros compuestos qumicos utilizados en el laboratorio de microbiologa. Este mtodo tiene gran poder de penetracin, razn por la cual la esterilizacin se puede llevar a cabo a menor temperatura y tiempo que cuando se emplea la estufa (calor seco) y est especialmente recomendado para la eliminacin de formas esporuladas. Descripcin de la autoclave: El autoclave consiste en un cilindro de bronce, horizontal o vertical, con una tapa del mismo material que se apoya sobre una arandela de goma y se cierra por pestillos o cerrojos quedando hermticamente cerrado. Adems, posee en la parte superior una llave de vapor (o espita), un manmetro y una vlvula de seguridad. En el interior de la autoclave se coloca un volumen de agua que se hace hervir, ya sea por medio de quemadores externos que se encuentran en la parte inferior del aparato, o mediante calentadores elctricos de inmersin. Se cierra luego la tapa, se atornilla dejando abierta la espita hasta que todo el aire del interior haya sido desplazado por el vapor. Debe dejarse que el vapor salga por la espita unos 5 minutos antes de cerrarla. Es muy importante que la eliminacin del aire ya que, de lo contrario, la presin marcada por el manmetro indicar la temperatura a la que se encuentra la mezcla vapor aire en el interior, que es menor a la esperada para el vapor saturado a esa presin. Una vez que se ha cerrado la llave de vapor (espita), comienza a elevarse la presin en el interior del autoclave; usualmente se fija la vlvula de seguridad para que se abra a 15 libras/pulgada2, estas presiones corresponden a 121C. La presin se mantiene durante unos 20 minutos, no deben abrirse ni el autoclave ni la espita hasta que el manmetro indique 0 (cero). Si la presin se libera violentamente los lquidos en el interior del aparato hierven tumultuosamente, pudiendo an reventar los elementos de vidrio. Una vez que el manmetro indique que no hay sobrepresin en el interior del aparato, se abre primero la llave de vapor y luego de algunos minutos se puede levantar la tapa de la autoclave. No se debe retirar el contenido inmediatamente.

Tiempo requerido: usualmente, para esterilizar medios de cultivo son necesarias temperaturas de 121C durante 15 a 20 minutos. Limitaciones: en funcin de la termolabilidad de ciertos materiales y componentes de medios de cultivo. Adems es inadecuado para sustancias que son insolubles en agua, como las grasas, en las que la penetracin del vapor es muy limitada. b) Tyndalizacin: Es un procedimiento de calentamiento discontinuo creado por Tyndall, que permite esterilizar, a bajas temperaturas, aquellas sustancias que se alteran a altas temperaturas como algunos azcares. Se puede realizar a bao Mara o autoclave abierta. La temperatura utilizada es generalmente de 60-80 C; a esta temperatura se eliminan las formas vegetativas pero no las esporuladas. Por esta razn es que despus de un perodo de calentamiento de 30 minutos, se deja el material a 30-37C hasta el da siguiente, y se lo somete nuevamente al tratamiento inicial. Esta operacin se repite despus de 24 horas (esterilizacin fraccionada). La discontinuidad de calor- reposo permite a las bacterias desarrollar nuevas clulas vegetativas a partir de sus esporas, hasta que por ltimo, en el tercer calentamiento, ya no quedarn formas esporuladas. c) Pasteurizacin: Debe su nombre a Pasteur quien fue el primero en utilizar este mtodo que actualmente presenta una serie de modificaciones. Tiene muy poca aplicacin en bacteriologa y es usada especialmente en leche, ya que destruye la totalidad de los grmenes patgenos y la mayora de la microbiota asociada, respetando la estructura fsica y composicin qumica de la misma (otros ejemplos son la nata, bebidas alcohlicas, mosto, etc.). Consiste en someter el lquido a un calentamiento rpido seguido de un enfriamiento posterior. La temperatura aplicada es de 63C, durante 30 minutos con lo que se consigue la destruccin de las formas vegetativas, excepto las termfilas. Existe una pasteurizacin denominada alta o instantnea, en las que mantienen delgadas pelculas de leche vaporizada sobre tubos o placas a 71C, con lo que se requiere una exposicin de slo quince segundos.

2.4.2.1.2 Filtracin.
Las bacterias pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por filtracin, si previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza porque los virus pueden pasar a travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de nitrocelulosa, con un poro de dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa, El dimetro de poro es aproximadamente de 0,45 a 4.0 m; este tamao es lo suficientemente pequeo como para eliminar todos los microorganismos, con excepcin de los virus y algunas bacterias muy pequeas. Un lquido se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para esterilizar soluciones de vitaminas, antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los medios. Filtros HEPA: Son filtros de vidrio empleados para esterilizar el aire que penetra en habitaciones especiales como quirfanos, etc. Tambin se emplean en cmaras de flujo laminar aparatos con forma cbica (urna). Tienen una superficie donde se hacen las operaciones microbiolgicas. El aire que penetra en la cmara pasa por los filtros HEPA, de manera que la superficie queda estril.

2.4.2.1.3 Radiaciones.
Se denominan tambin esterilizacin fra. Se usa con material sensible al calor, ya que no produce calentamiento del material. Radiaciones no ionizantes: Luz UV, muta el DNA (dmeros de timina), tiene bajo poder de penetracin, se usa en superficies o ambientes como quirfanos o plantas de envasados. Radiaciones ionizantes: Son los rayos X y los rayos gamma, tienen mucha energa y poder de penetracin. Inducen la ionizacin de molculas celulares tanto de organismos eucariotas como procariotas, provocando la muerte celular. Forman radicales hidroxilo y perxidos que oxidan cualquier material daando al ADN. Los rayos X no se suelen utilizar porque son caros, pero s los rayos gamma, y se obtienen fcilmente a partir del cobalto (60Co). Se emplean en procesos de enlatado y esterilizacin de material quirrgico (bistur, gasas...) Esto requiere altas medidas de seguridad deben practicarse en zonas especiales y las personas que los realicen deben ir protegidas.

2.4.2.2 Mtodos Qumicos.

Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. En comparacin con los procedimientos fsicos, estos mtodos tienen una importancia secundaria. Los antispticos son considerados venenos protoplasmticos que, al actuar sobre los grmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su accin nociva sobre todas las clulas, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros actan sobre algunas especies bacterianas, mostrndose como venenos especficos. Estos mtodos son ptimos para la asepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir grmenes que puedan contaminar el lugar de trabajo. Estos se pueden utilizar ya sea en forma de gas o lquidos. Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antispticos. La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan.

Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos. Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.

ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES DE USO COMN EN HOSPITALES Y/O CENTROS ASISTENCIALES

Recordar: 1. Al utilizar cualquiera de stos productos se debe tener en cuenta que la piel del paciente puede ser sensible a ellos. 2. Es conveniente que el antisptico de eleccin sea el mismo en todas las reas geogrficas del hospital. Su uso debe estar previamente determinado, excepto reas especiales donde el espectro del antisptico que se elige debe ser amplio para eliminar el mayor nmero posible de grmenes, tambin se tendr en cuenta que no dae las manos del personal. 3. Los antispticos deben, una vez que llegan a los distintos servicios, fraccionarse en frascos pequeos, opacos y con tapa. El antisptico que se coloca en estos frascos debe recambiarse diariamente, previo lavado y escurrido del frasco antes de proceder a su rellenado. 4. El alcohol al 70% puede colocarse en frascos comunes de vidrio blanco, pero stos debern tener tapa hermtica. 5. Es importante mantener tapados los antispticos ya que, por ejemplo, en el alcohol yodado, puede alterarse la concentracin de cualquiera de sus componentes por evaporacin. 6. La Iodopovodona jabonosa puede reemplazarse por gluconato de clorhexidina (Hibiscrub M.R.) segn la evaluacin que, en determinadas situaciones, realice la institucin. IODO-POVIDONA: (Pervinox M.R.) (Fada M.R.). Es un iodforo que resulta de la combinacin de iodo con un agente solubilizador (PVP o povidona) que mantiene la eficacia germicida del iodo y resulta en un antisptico relativamente libre de toxicidad e irritacin. Est disponible en forma de solucin jabonosa y como solucin tpica. Esta forma de iodo no irrita ni mancha y ha sido ampliamente aceptada en los ltimos aos para una gran variedad de aplicaciones preventivas, de limpieza (solucin jabonosa para lavado de manos y bao previo prequirrgico) y teraputicas, incluyendo su uso en curacin de heridas. La ms comnmente empleada es la solucin al 10%. Hay otros compuestos que estn sometidos a investigacin. Se cree que es microbicida, no meramente bactericida, lo que significa que adems de las bacterias Gram (+) y Gram (-), eliminan virus, hongos, protozoos y levaduras. Se recomienda usarla sin diluir. GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 4% (Hibiscrub M.R., Butyl M.R.). Es un agente bactericida tpico eficaz contra grmenes Gram (+) y Gram (-), pero de mayor eficacia sobre los primeros. Es tambin efectivo contra hongos y virus, pero su accin es muy baja sobre el Mycobacterium tuberculosis. Presentacin: Clorhexidina jabonosa y Clorhexidina alcohlica (no est en el mercado comn). Se recomienda para: Bao del paciente (preferentemente no en cama ya que mancha las sbanas) y para el lavado de manos. La ventaja de ste antisptico es una importante accin residual sobre la piel (entre 3 y 6 horas).

No se lo debe usar para desinfeccin de elementos o superficies, puesto que se inactiva en presencia de materia orgnica y materiales como corcho, algodn o goma. HEXACLOROFENO (FISOHEX M.R.). Es un agente bacteriosttico ms eficaz contra los grmenes Gram (+) que contra los Gram (-), especialmente los estafilococos. Las materias orgnicas interfieren en su accin. Aunque una sola aplicacin apenas modifica la flora cutnea, tiene efectos, acumulativos. Por lo tanto, puede usarse en duchas preoperatorias durante dos a cuatro das. Cuando se ingiere o absorbe a travs de una grieta en la piel o membranas mucosas (o incluso a travs de piel intacta de algunos nios), el hexaclorofeno provoca una neurotoxicidad potencialmente cuando existen erupciones cutneas, quemaduras o heridas abiertas. Se lo considera como a otros fenlicos, como desinfectante de nivel intermedio o bajo. Puede usarse en materiales no crticos y limpieza del ambiente hospitalario. PERXIDO DE HIDROGENO (Agua oxigenada). Ha sido empleado durante aos para promover la limpieza de las heridas. Tiene un dbil efecto germicida y fcilmente se degrada a oxgeno molecular y agua. Es muy importante su estabilidad, (610%), lo que es muy difcil de garantizar en nuestros mercados en relacin al tiempo de almacenamiento. Su accin es mecnica, las burbujas de oxgeno desprenden tejido muerto y las bolsas de bacterias ayudan a eliminarlas de la herida. Tiene inconvenientes, puede crear ampollas llenas de aire en los nuevos epitelios, separndolos del tejido subyacente. Por consiguiente, el perxido de hidrgeno no debe utilizarse cuando la herida est adecuadamente cicatrizada y se est formando epitelio nuevo. Tras su aplicacin, debe eliminarse de la herida con solucin fisiolgica. Tampoco debe emplearse en ciertas heridas profundas ni en la cavidad peritoneal, pues podra provocar un mbolo gaseoso en los capilares y vasos linfticos. Se ha demostrado que es bactericida, virucida y fungicida. La inmersin de material limpio en una solucin estabilizada al 6% proporcionara una desinfeccin de alto nivel en treinta minutos. Su estabilidad no est garantizada en nuestro medio, por lo que no se la recomienda. Corroe metales como el cobre, aluminio y zinc. Debe mantenerse al abrigo de la luz. ALCOHOL. El alcohol etlico al 96% (etanol) es el que ms comnmente se encuentra en el ambiente hospitalario. Se recomienda para: Antisepsia de la piel en pacientes alrgicos al Iodo (debe dejarse actuar entre uno y dos minutos), desinfeccin de termmetros y desinfeccin de endoscopios fibropticos. Es eficaz contra la mayora de las bacterias patgenas, pero de accin imprevisible contra los hongos y virus. Algo ms potente es el alcohol isoproplico al 70% (Isopropanol). Ambos resecan la piel, lesionan el epitelio nuevo y provocan ardor cuando se aplican sobre heridas abiertas. El isopropanol tambin provoca vasodilatacin bajo la superficie cutnea, de modo que las punciones con aguja sangran ms que cuando se utiliza etanol. El uso de isopropanol al 70% en las manos es un excelente mtodo que reemplazara en situaciones de emergencia el lavado con soluciones jabonosas, dada su alta eficacia. No tiene accin residual, pero varios estudios demostraron que es capaz de reducir en un 99,7% la concentracin microbiana de la piel de las manos.

Actualmente el uso del isopropanol al 70% se recomienda para la sanitizacin de mesas de trabajo y equipo automatizado de laboratorio y para inactivar en caso de derrame accidental de RPBI. ALCOHOL IODADO Es una combinacin de iodo con alcohol al 70%. Se debe utilizar en concentraciones al 2%. Acta sobre bacterias Gram (+), Gram (-), Mycobacterium tuberculosis y hongos. Se lo utiliza como antisptico de eleccin para la preparacin de la zona operatoria de la piel. Debe mantenerse en recipientes opacos y tapados para evitar que por evaporacin se alteren las concentraciones iniciales con que el producto llega proveniente de la farmacia del hospital. AMONIOS CUATERNARIOS (Cl. de Benzalconio: Tersotyl M.R.) (DG6 M.R.) Estos compuestos tuvieron amplio uso desde su inicio como germicida, son buenos agentes de limpieza, pero actualmente no se recomiendan como antispticos de piel y tejidos, ya que diversos estudios han documentado que en ellos sobreviven y desarrollan bacterias Gram (-), que han podido relacionarse con brotes de infecciones hospitalarias. Materiales como el algodn y las gasas disminuyen su actividad, porque absorben los ingredientes activos. No se los debe utilizar para la desinfeccin de elementos crticos o semicrticos. Solamente para el tratamiento de materiales no crticos. No eliminan esporas ni determinados virus, como por ejemplo el de la Hepatitis B. Debe usarse con cuidado, ya que se ha visto que algunas soluciones permiten el crecimiento de Pseudomonas sp. HIPOCLORITO DE SODIO. El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fcilmente en la clula a travs de la membrana citoplasmtica. En cambio, el cido hipocloroso es neutro y penetra fcilmente en la clula, mientras que el Cl2 ingresa como gas. El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de sto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente cido), con el objeto de obtener cido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo. FORMALDEHDO Inactiva microorganismos a travs de la alcalinizacin de las protenas. Se presenta en concentraciones del 40%. La solucin acuosa es bactericida, fungicida, esporicida y viricida.

Segn su dilucin actuar como esterilizante, luego de un tiempo prolongado o como desinfectante de alto nivel. Se lo utiliza para la inactivacin de bacterias en los sistemas de distribucin de agua tratada de los servicios de Hemodilisis. Los vapores de formaldehdo tienen efectos txicos e irritantes, por lo que es necesaria la utilizacin de elementos protectores durante su manipulacin. (Mscaras respiratorias, protectores oculares, guantes resistentes y delantales impermeables). El ambiente de trabajo debe contar con un adecuado sistema de recambio de aire. Concentraciones ambientales de 2 p.p.m. han ocasionado efectos txicos. Las pastillas de formalina no deben utilizarse en cajas de instrumental, guantes, etc. Su accin germicida solo se produce en la vaporizacin por calor. Actualmente se desaconseja su uso en quirfanos o habitaciones de pacientes, por ser no solo un procedimiento riesgoso (efecto carcinognico) sino tambin ineficaz. Por las razones expuestas, su uso queda limitado a los servicios de Hemodilisis. OXIDO DE ETILENO. Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancergeno.

2.4.3 Controles de esterilizacin.

Existen dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de la calidad de la esterilizacin realizada. Los ms simples son productos qumicos que cambian de color a 121C. Se comercializan dentro de sobres, o en la superficie de cintas. Se utilizan tambin monitores biolgicos como controles de esterilizacin. Consisten en determinados microorganismos con una tolerancia conocida al mtodo que se est empleando. Las esporas de Bacillus stearotermophilus, por ejemplo, tienen una tolerancia conocida al calor hmedo. Se colocan ampollas con suspensin bacteriana o tiras impregnadas con esporas en lugares estratgicos en el interior del autoclave. Como regla general, los portadores de esporas deben colocarse en el centro del paquete de mayor carga, o en aquellos lugares dentro de la carga con posibilidades de no alcanzar la temperatura de esterilizacin. Cuando se abren los paquetes o recipientes luego de ser esterilizados, la ampolla con su contenido o la tira aspticamente colocada en un caldo de cultivo, se incuban durante 24 a 48 horas. Si la esterilizacin fue eficiente no deber haber desarrollo en estos cultivos. Asimismo existen otros monitores biolgicos para esterilizacin con calor seco, irradiacin con rayos gamma, xido de etileno etc., eligiendo las especies bacterianas a utilizar segn su susceptibilidad conocida para cada procedimiento.

Algunas autoclaves modernas estn equipadas con termmetros que producen un registro continuo y permanente de las temperaturas en el interior del aparato.

2.5 Mtodos de aislamiento y recuento bacteriano.

El segundo paso para aislar un microorganismo patgeno de una muestra biolgica es inocular o introducir en un medio solido o lquido, esterilizado previamente, la muestra analizada con el fin de promover el crecimiento de las bacterias facilitando su identificacin. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. 2.5.1. Mtodos de aislamiento. Para el aislamiento de bacterias se cuenta con varios mtodos los ms utilizados son: el mtodo de la estra cruzada y el mtodo de las diluciones. El mtodo de aislamiento por estra cruzada en placa. Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener colonias individuales. Para ello, con un asa de siembra se toma una cantidad representativa de la muestra (Inoculo) y a continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placas o cajas Petr (a las placas Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas individuales.

El mtodo de las diluciones. Este mtodo consiste en realizar una serie de diluciones decimales de las cuales se toman alcuotas que se siembran en medios de cultivo slido en placas o cajas Petr, ya sea mediante la tcnica de vertido en placa o por dispersin con la esptula de Drigalsky.
El mtodo de las diluciones nos permite determinar las UFC/mL, presentes en la muestra por analizada.

2.5.2 Mtodo de siembra. Vertido en placa. En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en la placa o caja Petr. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la superficie. Espatulado. Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de una esptula de Drigalsky de cristal estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las colonias microbianas sobre la superficie.

Picadura: El medio de cultivo que se emplea semislido en tubo y la siembra se realiza con asa recta, la
que se introduce con el inculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio.

Picadura y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce el asa recta en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.

2.6 Morfologa colonial.

Las colonias aisladas presentan caractersticas morfolgicas diferentes debido a que cada grupo filogentico de bacterias tienen caractersticas peculiares que se ven influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en un medio slido y procede de una sola bacteria o espora y conforma una agrupacin de organismos de la misma especie. Por definicin un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con una distancia que permite distinguir y describir la morfologa colonial que incluye: Tamao. Se describe en milmetros y puede variar desde colonias extremadamente pequeas o puntiformes hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o ms. Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios o absorcin de algunas sustancias del medio. Forma. Pueden ser puntiformes, circulares o irregulares. Las colonias puntiformes son tan pequeas que no pueden distinguir el resto de sus caractersticas. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollados. Elevacin. Las colonia puede ser plana o elevada, est ltima a su vez puede ser convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular. Aspecto. Puede ser hmedo o seco. Luz reflejada. Puede ser brillante o mate. Luz transmitida. Puede ser transparente, translcida u opaca. Produccin de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua que puede difundir al medio.

Consistencia. Dura o suave, esta ltima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto de ser la ultima en describirse. Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles alrededor de la colonia, como la hemolisis en la gelosa sangre, acidificacin que se manifiesta con un indicador de pH incorporado al medio de cultivo. Con al experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial vienen a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de bacterias y tambin permite corroborar en muchos casos la pureza de un cultivo o alertar sobre una posible contaminacin La certeza de tener un cultivo puro as como el reconocimiento de un cultivo mixto o impuro permite la caracterizacin e identificacin correcta de un microorganismo patgeno.

Bibliografa Microbiologia medica de Jawetz,; Melnick Brooks,Geo F; Manual moderno 2005 Microbiologia medica;PRATS, GUILLEM; Mcgraw hill/ intera (medicina) 2004 Microbiologa medica; Murray,Patrick R; Elsevier Espaa 2006 Introduccin A La Microbiologa; Tortora, Gerard J. ;Panamericana 2007 Microbiologa Clnica; Prats; Panamericana 2006 Imgenes. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm