Técnica Histológica de rutina

Técnicas especiales
…qué vamos a ver ?
Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos,
tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí.

Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras. Por eso
se colorean los tejidos.
Pasos de la técnica histológica de rutina:

1) Obtención de la muestra
2) Fijación
3) Inclusión:
a) Deshidratación con alcoholes crecientes 50-70-96-100
b) Aclaración con xilol
c) Inclusión en parafina

4) Corte en microtomo
5) Montaje sobre portaobjetos
6) Coloración:
a) Aclaración con xilol
b) Rehidratación en alcoholes decrecientes 100-96-70-50
c) Coloración propiamente dicha

7) Montaje final con bálsamo de Canada o sintetico

a) Deshidratación
b) Aclaración
c) Montaje final propiamente dicho
1.- Obtención del material 2.- Fijación
Fijación
Tipos de agentes fijadores:
- Físicos:
 Calor
 Frío (congelación-desecación) (conservante)
 Microondas
- Químicos:
 Simples:
 agentes Oxidantes: ácido crómico, tetróxido de osmio, bicromato de
potasio, bicromato de mercurio, ácido acético, ácido pícrico
 agentes Reductores: etanol, metanol, formaldehído, glutaraldehído
 Compuestos o mezclas fijadoras:
 Líquido de Zenker (bicloruro de Hg, bicromato de K- ác. acético)
 Líquido de Helly (bicloruro de Hg-bicromato de K-formaldehído)
 Líquido de Bouin (ác. pícrico-formaldehído-ác. acético)
 Líquido de Dubosque-Brasil (ác. pícrico-ác. acético-formaldehído-etanol)
Inclusión

Deshidratación en concentraciones
crecientes de alcohol (ETANOL)
50% 70% 96% 100%

Post-fijación por inmersión

Etanol 100%
XILOL

Aclaración con XILOL

Inclusión Inclusión propiamente dicha

…se sumerge la
…se incuba en estufa a
muestra de tejido en
60º para que la parafina
parafina líquida…
impregne todo el tejido
Distintos tipos de parafinas se
funden (son líquidas) a 45º-58º… Moldes de inclusión

Se obtiene un taco de inclusión,

sólido, con el tejido incluido en
parafina. El taco se talla…

Taco de inclusión
Corte

¿Con qué se corta el taco de inclusión?...

…con un MICRÓTOMO

Charles Sedgwick Minot

(1852-1914)
Corte
Taco

Taco

Platina Micrótomo rotatorio tipo Minot

Portaobjetos de vidrio Corte de tejido

Cuchilla Tira de cortes

Grosor: 5-10 μm

Montaje preliminar
Rehidratación &
Rehidratación en concentraciones
Coloración decrecientes de ETANOL
Coloración propiamente dicha
HEMATOXILINA + virado +
EOSINA

Aclaración (desparafinización)
con XILOL
Deshidratación en concentraciones
crecientes de ETANOL
Aclaración con XILOL
Montaje final propiamente
dicho con Bálsamo de
Canadá o similar

Montaje final
 Corte sin colorear

Corte coloreado sólo con

EOSINA

Corte coloreado con

EOSINA y HEMATOXILINA
 CONCEPTOS

ACIDOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes

celulares y extracelulares básicos o catiónicos (con carga
eléctrica neta positiva) para formar uniones salinas o
electrostáticas con colorantes ácidos o aniónicos (con carga
eléctrica negativa).

BASOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes

celulares y extracelulares ácidos o aniónicos (con carga eléctrica
negativa) para formar uniones salinas o electrostáticas con
colorantes básicos o catiónicos (con carga eléctrica neta
positiva).
H-E : Acidofilia - Basofilia
H-E : Acidofilia - Basofilia
Con H&E no se pueden observar glúcidos…
 Reacción de Acido periódico Schiff
(PAS)

 Se utiliza para la demostración histoquímica de

Hidratos de Carbono.

 1er paso: El ácido periódico oxida grupos

hidroxilos de los azúcares para dar aldehidos.

 2do. Paso: los grupos aldehidos expuestos

reaccionan con el “reactivo de Schiff” (fucsina
básica decolorada) dando una reacción color
magenta.
Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos
Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff)

1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos

1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la
unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por
anhídrido sulfuroso)

H&E PAS Alcian blue

Células caliciformes
 Reacción de Feulgen

 Se utiliza para el reconocimiento de ADN en

forma específica

 1er. Paso: Una hidrólisis ácida suave (ClH)

remueve la unión desoxirribosa-bases
nitrogenadas del ADN (purinas A y G)
exponiendo grupos aldehídos.

 2do. Paso: El reactivo de Schiff reacciona con los

grupos aldehídos y se visualiza de color magenta
el ADN de la cromatina.
Técnicas histoquímicas: Localización de ácidos nucleicos
Técnica de Feulgen

1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del
ADN (A y G) y expone grupos aldehído.
2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la
unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por
anhídrido sulfuroso)

Ácidos nucleicos
H&E
(raíz de cebolla) Feulgen
Con H-E no se pueden visualizar lípidos…

Colorantes para visualizar lípidos

 Se utilizan colorantes “indiferentes”: no

forman sales sino que se disuelven en las
grasas.

 Ejemplos: Sudán 1, 2, 3, 4 (rojo escarlata);

Sudán negro; oil red; tetróxido de osmio.
 Coloración de lípidos

H-E

Sudan rojo
Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos

Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico)

Sudán III grasas (naranja)
Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa)
Sudán negro B fosfolípidos
Aceite rojo O triacilglicéridos
Azul de Nilo fosfolípidos
Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro)

Glándula mamaria
(OsO4-verde de metilo)

Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo) Nervio, mielina (OsO4)

 CONCEPTOS

ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes

básicos o ácidos de mantener invariable su espectro de
absorción electromagnética al formar uniones salinas o
electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares.

METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes

básicos o catiónicos derivados de las tiazinas de virar su
espectro de absorción electromagnética al formar uniones
salinas o electrostáticas con ciertos componentes celulares y
extracelulares que son polímeros polianiónicos.

Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de

toluidina, violeta de metilo, azul de tionina, azur A
 metacromasia
Es una propiedad de los colorantes básicos derivados de las tiazinas (Azul de
metileno; Azul de toluidina; Azur; Violeta de cresilo; Gallocianina)
Características del tejido: poseer polímeros polianiónicos que hacen “virar” el
azul original del colorante a un púrpura-violáceo = metacromasia
 Metacromasia
H&E (matriz cartilaginosa; cartílago hialino) Azul de toluidina
 Metacromasia
H&E (mastocitos; oreja de ratón)
Azul de toluidina
H-E
 Tricrómico de Mallory (azul de anilina
Coloraciones tricrómicas: + naranja G + fucsina ácida; todos
ácidos; se desconoce el fundamento)

Frank Burr Mallory

(1862-1941)

Cirrosis
Técnicas de impregnación argéntica:
Depósito de sales de plata metálica

Método de del Río

Hortega (microgliocito)

Método de Golgi (neurona)

Impregnación argéntica de Gomori

para fibras reticulares (hígado)

Técnica de de Olmos
Método de Cajal para
(amino-cupro-argéntica;
Aparato de Golgi (enterocitos) neurofibrillas (neurona)
neuronas en degeneración)
TECNICAS HISTOQUIMICAS
 Reacciones enzimáticas

 Estas reacciones histoquímicas se basan en demostrar el

sitio donde se verifica una determinada acción
enzimática

Sustrato de la Sustancia coloreada y

Tejido (con Ez?) +
enzima precipitada in situ
Histoquímica para fosfatasa alcalina
( Técnica de Gomori)
Inmunohistoquímica:
Se basa en: la detección de reacciones
controladas antígeno-anticuerpo por medio
de la marcación de los anticuerpos.
Sirve para: detectar sustancias
(principalmente proteínas), muy
específicamente, que pueden estar en muy
bajas concentraciones en el tejido en estudio.
Métodos: existen dos grupos, el directo y el Albert H. Coons
indirecto. (1912-1978) Ludwig A. Sternberger
Tipos de anticuerpos: policlonales Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970)
(desarrollados en conejo), monoclonales
(desarrollados en ratón).

César Milstein Georges J. F. Köhler

(1927-2002) (1946-1995)
Ac. monoclonales (1975)
H-E
 Técnica de inmunocitoquímica
( Ac. Anti-Vimentina en células de Sertoli )
Inmunohistoquímica:

S-100B (astrocito, hipocampo; Evrard,

Duhalde-Vega, Ramos, Tagliaferro, Brusco
(2003) Dev Brain Res)
Vimentina (céls. de Sertoli, testículo)
Nf-200 (neurona, c.
frontal; Evrard, Duhalde-
Vega, Tagliaferro, Mirochnic,
Caltana, Brusco (2006) Exp
Neurol)

MTCO2, marcador de
Células en cultivo marcadas para
mitocondrias humanas
actina, tubulina y núcleo BrDU (céls. postmitóticas, yeyuno-íleon)
(glioblastoma humano)