INSULINA HUMANA RECOMBINANTE

Resumen
La insulina es un péptido bien caracterizado que puede producirse mediante tecnología de
ADN recombinante para uso terapéutico humano. Se presenta una breve descripción
general de la producción de insulina tanto de la extracción pancreática tradicional de
mamíferos como de los sistemas bacterianos y de levadura recombinantes, y se revisan las
técnicas de detección, incluida la electroforesis. Los sistemas analíticos para la separación
de insulina se basan principalmente en la cromatografía de fase inversa, que resuelve los
productos de desamidación (desamido insulina) de insulina, proinsulina e insulina. La
separación a escala de proceso es un proceso de varios pasos e incluye cromatografía de
intercambio iónico, fase inversa y exclusión por tamaño. Se presentan las ventajas y / o
desventajas de varios enfoques de separación, como se describe en las numerosas
referencias bibliográficas sobre purificación de insulina.
Introducción
La insulina es una hormona polipeptídica que es esencial para el suministro de energía a las
células del cuerpo (Barfoed, 1987). Se ha estimado que la enfermedad diabetes mellitus
(disminución de la producción de insulina y sus complicaciones) es la tercera causa de
muerte en los países industrializados después de las enfermedades cardiovasculares y el
cáncer (Barfoed, 1987). Producida por las células @ del páncreas en respuesta a la
hiperglucemia, la insulina es una hormona potente que afecta directa o indirectamente a
todos los órganos o tejidos del cuerpo. Las funciones principales de la insulina son
estimular las reacciones anabólicas para los carbohidratos, las proteínas y las grasas, todas
las cuales tienen las consecuencias metabólicas de producir un nivel de glucosa en sangre
bajo (Norman y Litwack, 1987). Se estimó en 1986 que había 60 millones de diabéticos en
el mundo (Johnson, 1986) y que 12 millones de estadounidenses tienen diabetes (Barfoed,
1987). Estos números están aumentando dramáticamente. Los Estados Unidos. Se cree que
la población está creciendo a una tasa del 1% anual, pero la tasa de crecimiento de la
población diabética que usa insulina es del 54% anual (Johnson, 1986). Los problemas de
salud relacionados con la diabetes pueden ser devastadores. Barfoed (1987) informa que,
aunque los síntomas agudos pueden tratarse con insulina, las complicaciones vasculares en
las etapas posteriores de la enfermedad reducen la esperanza de vida de los diabéticos en un
tercio. Además, informa que los diabéticos tienen 25 veces más probabilidades de quedarse
ciegos y tienen el doble de riesgo de enfermedad cardíaca que los no diabéticos. En los
EE.UU. Se estima que los costos directos e indirectos para la economía superan los 5 mil
millones de dólares anuales. La administración de insulina como tratamiento para la
diabetes tiene una historia larga e interesante. En 1922, Frederick Banting y Charles Best
trataron con éxito al primer paciente humano con una preparación de insulina obtenida de
extracciones pancreáticas animales (Barfoed, 1987). De 1922 a 1972, la única insulina
disponible se purificó del páncreas de cerdos y vacas. Esta insulina fue bastante valiosa
para prolongar la vida de los diabéticos que de otro modo habrían muerto lentamente
porque la glucosa no estaba disponible para las células de su cuerpo. Las mejoras en la
purificación de la insulina durante la década de 1970 tuvieron éxito en la producción de un
fármaco estable con un tiempo de acción predecible (Chance et al., 1975; Dolan-Heitlinger,
1981; Barfoed, 1987). En 1950, Novo Nordisk A / S (Bagsvaerd, Dinamarca) modificó el
estado de la insulina en sí para obtener un cristal de insulina con un alto contenido de zinc
que tuvo un largo tiempo de acción, en comparación con la insulina amorfa que se absorbió
rápidamente (Dolan-Heitlinger , 1981; Barfoed, 1987). Las adiciones de protamina y zinc
retrasaron la absorción ya que la insulina forma un hexámero estable en presencia de zinc,
siendo la velocidad de disociación del hexámero el paso de control de la velocidad en la
absorción de la insulina. El desarrollo de tecnologías de ADN recombinante dio como
resultado la producción y el uso del primer producto recombinante, la insulina humana, en
1982. Entonces, como ahora, la insulina humana recombinante tiene dos ventajas distintas
sobre la insulina tradicional obtenida de la extracción pancreática: existe un suministro
prácticamente ilimitado. de insulina humana recombinante, y la insulina humana
recombinante es idéntica a la insulina humana. La insulina humana recombinante tiene
menos probabilidades de causar reacciones inmunológicas durante el uso terapéutico que la
insulina derivada de animales. La insulina porcina, cuando se administra durante largos
períodos de tiempo, puede provocar reacciones alérgicas graves. La variación de secuencia
en la insulina es más común en las posiciones 8-10 (centro del enlace disulfuro de la cadena
A), y estas diferencias pueden conducir a respuestas antigénicas (Norman y Litwack, 1987).
Un impulso para el desarrollo del proceso de insulina humana recombinante fue la escasez
percibida de carne de res y cerdo en la década de 1970 que, de haber ocurrido, habría
restringido la disponibilidad del tejido pancreático del que se extrajo la insulina y, por lo
tanto, la cantidad de insulina. disponible (Hall, 1987). En ese momento se temía que la
demanda de insulina aumentara más rápido que el suministro. Los estadounidenses
continúan limitando el consumo de carne, lo que afecta la disponibilidad de tejido
pancreático.
La insulina fue una opción particularmente buena para ser la primera terapéutica que se
produjo con tecnología de ADN, simplemente debido a la gran cantidad de insulina
necesaria. En comparación con otro producto recombinante, la hormona del crecimiento
humano que tiene un uso actual de varios kilogramos / año, el mercado de insulina es 2
órdenes de magnitud más alta (Prouty, 1991). Desde su desarrollo en 1982, la cantidad de
insulina humana utilizada ha aumentado dramáticamente. Se estima que en los EE. UU. El
73% de los pacientes usan insulina humana (Crossley, 1991)
Antecedentes
Estructura de insulina. La insulina es un péptido bien definido con secuencia de
aminoácidos conocida y características estructurales (Watson et al., 1983; Norman y
Litwack, 1987). Esta hormona consta de dos cadenas peptídicas separadas que son la
cadena A (21 aminoácidos) y la cadena B (30 aminoácidos) unidas por puentes disulfuro
como se indica en la Figura 1. La proinsulina es el precursor biológico de la insulina y es
una cadena peptídica única formado cuando las cadenas A y B están conectadas por el
péptido C (Figura 2). Las insulinas humanas y porcinas difieren en un solo aminoácido,
mientras que las insulinas bovina y humana difieren en tres aminoácidos, como se indica en
la Figura 1. En un texto reciente sobre hormonas, Norman y Litwack (1987) detallan el
descubrimiento de la secuencia y estructura de la insulina. Debido a su pequeño tamaño, la
insulina ha sido una molécula ideal para el estudio de la secuencia y estructura de péptidos.
En 1955, F. Sanger encontró la secuencia de aminoácidos primaria, y en 1967, D. F. Steiner
y R. Chance determinaron la estructura de la proinsulina. El trabajo continuó con la
aclaración de la estructura tridimensional a través de la cristalografía de rayos X por D.
CrowfootHodgkin en 1969. Al usar esta técnica, se vio que la insulina existía como un
monómero, un dímero o un hexámero. La cristalografía de rayos X sigue siendo una técnica
importante para confirmar las identidades de los diferentes tipos de insulina. En la relación
estructura-función de la insulina, se han encontrado tres características conservadas: (1) las
posiciones precisas de los tres enlaces disulfuro; (2) las regiones N y C-terminales de la
cadena A; y (3) los residuos hidrofóbicos de la cadena B (Norman y Litwack, 1987). La
insulina humana recombinante es química, física e inmunológicamente equivalente a la
insulina humana pancreática y es biológicamente equivalente tanto a la insulina humana
pancreática como a la insulina de cerdo purificada (Chance et al., 1981a).
Producción y purificación de insulina tradicional. Históricamente, la insulina se ha
purificado del tejido animal mediante procedimientos de extracción seguidos de técnicas
cromatográficas (Dolan-Heitlinger, 1981; Barfoed, 1987). Los páncreas congelados de
bovino o porcino se cortan en cubitos, se extraen con etanol y se acidifican a pH 2 con HCL
o H2SO4. Estos pasos inactivan y eliminan la enzima tripsina, que podría degradar la
insulina. Luego se agrega carbonato de calcio para neutralizar la solución, el extracto se
concentra por extracción al vacío a bajas temperaturas y la insulina se precipita por adición
de sal. El precipitado se redisuelve en agua y se reprecipita ajustando el pH al punto
isoeléctrico de la insulina. Los pasos de la cromatografía para la purificación adicional de la
insulina pueden incluir filtración en gel seguida de sistemas de intercambio iónico (Dolan-
Heitlinger, 1981). La aplicación de insulina a una columna de filtración en gel proporciona
un pico principal compuesto de insulina, insulina (s) desamido, insulina (s) de arginina,
éster (es) de insulina etil (es), glucagón, polipéptido pancreático y somatostatina. Una
pequeña cantidad de material de mayor peso molecular se eluye antes del pico de insulina y
contiene proinsulina e intermedios de proinsulina, además de una mezcla de dímeros de
insulina covalentes. Los materiales similares a la proinsulina pueden ser inmunogénicos y,
por lo tanto, deben eliminarse durante el procedimiento de purificación (Chance, 1972;
Chance et al., 1975). La filtración en gel seguida de cromatografía de intercambio iónico
separa la insulina de estos otros materiales.
Producción de insulina humana. El deseo de no limitarse a las fuentes de tejido animal para
la producción de insulina llevó al interés en la fabricación de insulina humana. La insulina
humana se puede obtener mediante extracción del páncreas humano, síntesis química de
aminoácidos individuales, conversión de insulina porcina en "semisíntesis" de insulina
humana o fermentación de microorganismos genéticamente modificados (Barfoed, 1987).
La extracción de un páncreas humano solo es factible para fines de investigación, y la
síntesis química (aunque se ha logrado) actualmente no es económica. Los métodos tercero
y cuarto han sido desarrollados para la producción comercial de insulina para uso
terapéutico y serán discutidos.
Conversión de insulina porcina. La insulina humana semisintética fue desarrollada
comercialmente en la década de 1970 por Novo Nordisk A / S y se produce sustituyendo el
residuo de alanina B-30 de la insulina porcina con un residuo de treqnina. Cinco pasos dan
como resultado la insulina monocomponente humana (Barfoed, 1987). La insulina se extrae
primero de las glándulas del páncreas porcino congeladas. El segundo paso del
procesamiento implica procesos de purificación convencionales, que se han descrito en la
sección anterior. A continuación, la insulina porcina purificada se convierte en insulina
humana en un medio que contiene solo una pequeña cantidad de agua y tripsina y una gran
cantidad de solvente orgánico y éster de treonina. La tripsina hidroliza la insulina en
LYSBBAlaBso, mientras que al mismo tiempo cataliza la reacción inversa en la que el
éster de treonina desplaza a la alanina desde la posición B-30 en la molécula de insulina.
Esta transpeptidación de insulina porcina a insulina humana se optimizó a un rendimiento
del 97% usando tripsina soluble (Markussen et al., 1983). La transpeptidación también es
catalizada por la tripsina inmovilizada, aunque el rendimiento es menor al 80% (Ueno y
Morihara, 1987). Esto es seguido por una purificación cromatográfica para reducir los
niveles medibles de proinsulina y eliminar los otros reactivos. Finalmente, el producto se
formula y luego se llena en condiciones estériles, se empaqueta y se distribuye.
Insulina producida por métodos recombinantes. La insulina humana fue la primera proteína
animal producida en bacterias en una secuencia idéntica a la del péptido pancreático
humano (Watson et al., 1983). Esto fue realizado por Eli Lilly and Co. (Indianápolis, IN) y
Genentech (San Francisco, CA). Estas compañías trabajaron juntas para lograr la expresión
de insulina humana recombinante en 1978 en Escherichia coli (E. coli) K-12 usando genes
para las cadenas de insulina A y B sintetizadas en el Centro Médico Nacional de la Ciudad
de Hope (Chance et al., 1981a) . Los científicos de Genentech clonaron los genes en marco
con el gen @galactosidasa del plásmido pBR322; el plásmido recombinante se amplificó en
E. coli (Chance et al., 1981b). La primera expresión exitosa se anunció en 1978, con la
ampliación y aprobación de las agencias reguladoras de drogas apropiadas logradas en 1982
(Johnson, 1983). El pequeño tamaño de la insulina y la ausencia de residuos de metionina
(Met) y triptófano (Trp) en las cadenas A y B fueron elementos críticos en la decisión de
llevar a cabo la clonación de este péptido, así como en el logro del rápido desarrollo del
proceso de fabricación. . Los residuos Met y Trp producidos como consecuencia de la
ingeniería y la expresión en E. coli son hidrolizados por los reactivos utilizados durante el
proceso de recuperación de insulina. La presencia de estos aminoácidos en la insulina
habría resultado en la hidrólisis y destrucción del producto. Método de dos cadenas.
Aunque la insulina humana recombinante ahora se produce de varias maneras, el primer
método exitoso, ilustrado esquemáticamente en la Figura 3 (Watson et al., 1983), fue
realizado a escala de laboratorio por Genentech seguido por una ampliación exitosa por Eli
Lilly and Company ( Chance et al., 1981a, b, c). Cada cadena de insulina se produjo como
una proteína de fusión de @galactosidasa en fermentaciones separadas usando E. coli
transformada con plásmidos que contienen la secuencia de péptido de insulina A o B. Los
productos eran intracelulares y aparecían en prominentes cuerpos de inclusión
citoplasmáticos (Williams et al., 1982). El método utilizado para extraer los péptidos de los
cuerpos de inclusión es información patentada. Las proteínas recombinantes producidas en
E. coli generalmente representan 10-40% de la proteína total (Burgess, 1987). Una vez
eliminados de los cuerpos de inclusión, la escisión química por CNBr en el residuo Met
entre la @-galactosidasa (abreviada @ -gal) y la cadena A o B, seguido de purificación, dio
péptidos A y B separados. Los péptidos se combinaron e indujeron a plegarse en una
proporción de 2: 1 de cadenas AB (formas S-sulfonadas) en presencia de cantidades
limitadas de mercaptano para obtener una hormona activa (Chance et al., 1981c; Frank y
Chance, 1985). Después de 24 h, el rendimiento fue aproximadamente del 60% en función
de la cantidad de cadena B utilizada (Chance et al., 1981a; Johnson, 1986). Goeddel y col.
(1979) obtuvieron resultados similares con el 20% de la proteína celular total expresada
como proteína de fusión de cadena A o B. El plegamiento posterior de cadenas S-
sulfonadas dio 50-80% de plegamiento correcto.
El gran tamaño de la proteína de fusión @ -gal limitó los rendimientos ya que la proteína
de fusión de @ -gal (- 1000 aminoácidos) y la cadena de insulina A o B (21 o 30
aminoácidos, respectivamente) se separaron del ribosoma de la célula (cadena prematura
terminación durante la traducción) y, por lo tanto, produjo péptidos de insulina incompletos
(Burnett, 1983; Hall, 1987). Una mejora clave de este enfoque fue el uso del operón
triptófano (Trp) en lugar del operón lac (@ -galsystem) para obtener una proteína de fusión
más pequeña. El operón Trp consiste en una serie de cinco genes bacterianos que sintetizan
secuencialmente las enzimas responsables del anabolismo del triptófano. Una de estas
enzimas, Trp E, tiene solo 190 aminoácidos en comparación con los 1000 aminoácidos de
@ -gal. El gen Trp E seguido de genes para las cadenas de insulina A o B tiene la ventaja
adicional de mejorar la producción de proteínas de fusión del 5-10% al 20-30% de la
proteína total (Hall, 1987) ya que el promotor Trp es un fuerte promotor en E. coli. Esto
conduce a una expresión de polipéptido al menos 10 veces mayor en comparación con el
sistema lac (es decir, & gal) (Burnett, 1983). El operón Trp se enciende cuando la
fermentación de E. coli se queda sin triptófano (Hall, 1987; Etienne-Decant, 1988). Esta
característica es beneficiosa durante la fermentación ya que la masa celular se puede
maximizar primero. Luego, cuando sea apropiado, el sistema de producción de insulina de
la célula puede activarse permitiendo que los medios de fermentación se agoten en Trp.
Dado que la proteína de fusión de insulina es un producto intracelular (es decir, cuerpo de
inclusión), la productividad es proporcional a la masa celular. Si los cuerpos de inclusión se
formaran prematuramente, el crecimiento celular se detendría y, por lo tanto, la masa
celular total sería inferior al máximo posible. En consecuencia, el "interruptor Trp" es una
herramienta práctica muy importante para maximizar la producción.
La ventaja del sistema Trp LE 'en términos de productividad potencial es evidente en la
Figura 5. La proteína Trp más pequeña, como la proteína lac grande, es altamente insoluble.
En consecuencia, la proteína de fusión Trp E también se acumula intracelularmente en
forma de cuerpos de inclusión insolubles, que ayudan a retardar la degradación proteolítica
del producto durante la fermentación y la recuperación inicial (Burnett, 1983). La estructura
del plásmido codificador de insulina se muestra en la Figura 4, y el tamaño molecular
relativo de varias proteínas quiméricas de insulina humana se muestra en la Figura 5
(Burnett, 1983). Los detalles del método de dos cadenas de producción de insulina se dan
en la literatura. Se realizan fermentaciones separadas de cepas de E. coli recombinantes
específicas para producir cada cadena con los cuerpos de inclusión procesados para
producir formas de S-sulfonato parcialmente purificadas. Estos se utilizan posteriormente
en la reacción de combinación (Frank y Chance, 1983; Johnson, 1984; Johnson, 1986).
Ambas fermentaciones producen una proteína quimérica compuesta por la cadena A o B
específica unida a través del aminoácido metionina (Met) a un péptido promotor Trp-LE
'(Frank y Chance, 1983). Después de que se completa la fermentación, las células se
recuperan y se rompen. Luego, los restos celulares se separan de los cuerpos de inclusión, y
los cuerpos de inclusión se disuelven en un disolvente, aunque no se conocen detalles
(Wheelwright, 1991). Los cuerpos de inclusión a veces se disuelven en guanidina HCl 6 M
y ditiotreitol 0,1 mM (Burgess, 1987). A continuación, la cadena Trp-LE'-Met-A y la
cadena Trp-LE'-Met-B se someten a una escisión CNBr para liberar las cadenas de insulina
A y B. Otras modificaciones de las cadenas A y B incluyen sulfitolisis oxidativa,
purificación y combinación para producir insulina cruda. Esta insulina cruda se somete a
cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio iónico, exclusión de tamaño y
fase inversa para producir la insulina humana recombinante purificada (Frank y Chance,
1983). Existe una patente reciente (Bobbitt y Manetta, 1990) sobre la solubilización
caotrópica y sulfitolítica de los cuerpos de inclusión de proteínas heterólogas. Este proceso
particular incluye sulfitolisis seguido de un paso de calentamiento, permitiendo que la
proteína S-sulfonato precipite con alta pureza: 95 95 puro en comparación con el material
de partida. Este método busca evitar la formación inadecuada de enlaces disulfuro o la
reticulación intermolecular que puede ocurrir en el procesamiento convencional después de
la lisis celular.
Método de Proinsulina (Intracelular). La insulina humana también se puede hacer con
microorganismos recombinantes que producen proinsulina intacta en lugar de las cadenas A
o B por separado. La ruta de la proinsulina es el método de elección actual para la
producción de insulina (Kroeff et al., 1989) e implica una secuencia de pasos de
fermentación y purificación en lugar de dos setas de secuencias (es decir, una para la
cadena A y otra para la cadena B) . Este enfoque es resumido por Kroeff et al. (1989) con la
base de la tecnología recombinante descrita por Watson (Watson et al., 1983), como se
muestra en la Figura 2. Inicialmente, el ARNm se copia en ADNc, y un codón de metionina
se sintetiza químicamente y se une al extremo 5 ' del ADNc de proinsulina. El ADNc se
inserta en un gen bacteriano en un vector plasmídico que se introduce y luego se cultiva en
E. coli. La proinsulina se puede liberar del fragmento de enzima bacteriana @gal) (o
alternativamente de la Trp-LE'-Met-proinsulina [Trp proinsulina]) destruyendo el conector
de metionina. La cadena de proinsulina se somete a un proceso de plegado para permitir
que se formen disulfuros intermoleculares, y el péptido C se puede escindir con enzimas
para producir insulina humana (Frank y Chance, 1983). En comparación, el método de dos
cadenas descrito anteriormente es más complejo (Figura 3). La insulina humana, derivada
de la proinsulina generada a través del promotor Trp LE, es discutida por Kroeff et al.
(1989) Después de la recuperación, la proinsulina Trp sufre escisión de CNBr para producir
proinsulina. La proinsulina se somete a sulfitolisis oxidativa, condiciones de plegamiento
en presencia de un mercaptano, varios pasos de purificación y luego tratamiento enzimático
para formar la insulina cruda. Los pasos de cromatografía de intercambio iónico, fase
inversa y exclusión por tamaño dan como resultado la insulina humana recombinante
purificada.
Proinsulina (secretada). Villa-Komaroff et al. (1978) fueron los primeros en describir un
sistema de secreción de proinsulina humana en E. coli. Watson (1983) sugirió que la
situación ideal para la producción de proteína recombinante sería tener grandes cantidades
de la proteína extraña secretada eficientemente en el medio por la bacteria. En el caso
específico de la insulina, la proteína recombinante podría consistir en j3-lactamasa (una
enzima que inactiva la penicilina, que es secretada naturalmente por las bacterias en los
medios de cultivo) y proinsulina. Las levaduras también son atractivas para este tipo de
sistema, ya que secretan solo unas pocas de sus propias proteínas. Por lo tanto, se
necesitarían eliminar menos proteínas extrañas en la purificación. Las levaduras también
pueden facilitar la formación de enlaces disulfuro. Sin embargo, para las proteínas
glicosiladas, las levaduras tienden a sobreglicosilatar.
Novo Nordisk A / S utilizó levadura de panadería o Saccharomyces cerevisiae para
enjuagar la insulina como precursor de insulina de cadena única. Tanto el proceso como el
producto fueron aprobados por el Parlamento danés en 1986 (Diers et al., 1991). Diers y
col. (1991) describen el péptido desplegado como líder o enjuiciamiento, luego una
secuencia Lys-Arg (reconocida por la enzima de procesamiento), la cadena B (aminoácidos
1-29), un puente peptídico corto, seguido de la cadena A (amino ácidos 1-21). En este
precursor, el aminoácido 29 de la cadena B de insulina está conectado al aminoácido 1 de la
cadena A mediante un péptido de conexión corto que contiene un aminoácido básico
adyacente a la cadena A. La insulina humana se produce por transpeptidación seguida de
hidrólisis del enlace éster formado. Siguen varios pasos de cromatografía para una
purificación adicional (Diers et al., 1991). Recientemente se ha descrito otro proceso para
producir proinsulina humana intracelularmente en la levadura S. cereuisiae (Tottrup y
Carlsen, 1990). Usando este sistema de levadura en una fermentación optimizada
alimentada por lotes, se informó que los rendimientos de la proteína de fusión de
superóxido dismutasa-proinsulina humana (SOD-PI) fueron de 1500 mg / L. SODPI sería el
material de partida para la producción de insulina humana recombinante; No se han
informado los rendimientos del producto final. Aparentemente, la expresión de polipéptidos
heterólogos en levadura a veces ha sido más baja de lo deseable. Una patente de Eli Lilly
Co. (Beckage e Ingolia, 1988) describe un proceso de cultivo aeróbico de levadura, seguido
de anaeróbico y luego nuevamente a condiciones aeróbicas. Se informa que este método da
como resultado una alta expresión del producto (producido intracelularmente en S.
cerevisiae).
Separación analítica de insulina
Cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. La cromatografía líquida de alto
rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) sobre soportes de alquilsilano parece ser el método
de elección en el análisis de insulina (Tablas I y 11) (Monch y Dehnen, 1978; Damgaard y
Markussen, 1979; O'Hare y Nice, 1979; Terabe et al., 1979; Dinner and Lorenz, 1979;
Kroeff and Chance, 1982; Lloyd and Corran, 1982; Rivier y McClintock, 1983; Parman and
Rideout, 1983; McLeod and Wood, 1984, Knip, 1984 ; Kalant et al., 1985; Smith y
Venable, 1985; Vigh, 1987). La alta selectividad y las altas capacidades de resolución de
RP-HPLC utilizando una amplia variedad de fases estacionarias y móviles permiten la
separación de especies de insulina que difieren en un solo aminoácido (Koreff et al., 1989).
El mecanismo para la separación de la insulina en los sistemas RP-HPLC se basa en las
hidrofobicidades de la insulina y los compuestos relacionados. La tendencia de algunas
proteínas (particularmente proteínas grandes) a unirse tan fuertemente a la fase estacionaria
que son difíciles de eluir parece ser la principal limitación de los soportes de alquilsilano.
Es difícil comparar los sistemas analíticos descritos en las Tablas I y 11. Cada sistema en
particular fue diseñado y optimizado para una serie específica de separaciones. En general,
sin embargo, Smith et al. (1985) han resumido las condiciones que afectan la RP-HPLC de
la insulina y los compuestos relacionados. El acetonitrilo o metanol con diversas mezclas
de tampones acuosos se usa generalmente para la fase móvil en el análisis de insulina. Los
factores de capacidad de la insulina disminuyen con el aumento de la concentración de
acetonitrilo hasta un 40% (Grego y Hearn, 1981). Como la mayoría de los polipéptidos y
proteínas se unen fuertemente a los soportes de alquilsilicato, la sal de cloruro puede ser
sustituida por la sal de fosfato en la fase móvil. La mayoría de las separaciones se llevan a
cabo a temperatura ambiente, con una detección óptima de insulina entre 190 y 220 nm.
Todos los sistemas sufren, en diversos grados, de interferencias que se deben a
conservantes u otras impurezas de insulina (Smith et al., 1985). Con el advenimiento de las
insulinas recombinantes, se han descrito otros sistemas analíticos, así como modificaciones
del sistema RP-HPLC para la separación analítica de las cadenas de insulina, proinsulina,
péptido C e insulina A y B entre sí y de las proteínas de fusión recombinantes. De Guevara
(1985) aisló y cuantificó las cadenas de insulina A y B con un sistema RP-HPLC (Waters
Radial Pak con cartucho Bondapak c18, Waters, Milford, MA) utilizando el
emparejamiento de iones con ácido trifluoroacético (TFA) como el contraión para el Una
cadena y ácido fórmico para la cadena B. Kakita y col. (1981) utilizaron la cromatografía
en gel (Biogel P-30, Bio-Rad, Richmond, CA) para separar la proinsulina del péptido C con
ácido acético 1 M como tampón de elución. Welinder (1984) observó la homogeneidad de
la insulina cristalina utilizando RP-HPLC (Nucleosil 10 CIS) y cromatografía de
permeación en gel de alto rendimiento (HP-GPC) (columna 1125, Waters). Welinder y
Linde (1984) informaron la separación de la insulina y los derivados de la insulina
mediante cromatografía de intercambio iónico de alto rendimiento (HP-IEC) y dieron una
comparación con RP-HPLC. Ladisch y cols. Informaron recientemente de la cromatografía
de intercambio iónico usando un gradiente de sal de NaCl 0-0.29 M sobre una fase
estacionaria polimérica derivada de DEAE. (1990) En esta separación basada en el
intercambio iónico, la insulina se separó de la galactosidasa y de la cadena de insulina A.
Cromatografía de afinidad, la cromatografía de afinidad también se puede usar en la
purificación de proteínas de fusión. Se ha descrito un procedimiento de purificación por
afinidad en un solo paso que proporciona un rendimiento global de 85-95 \ beta 6 de
proteína híbrida con actividad @gal usando TPEG-Sepharose en condiciones de alto
contenido de sal (Burgess, 1987). Nilsson y col. (1989) describen un enfoque general de
fusión de genes para facilitar la purificación de proteínas recombinantes basado en la fusión
de un gen de interés a un gen que codifica una proteína con una fuerte afinidad por un
ligando (fusión de afinidad). Smith y col. (1988) informan el uso de una técnica llamada
cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados con péptidos quelantes (CP-
IMAC) para purificar la proinsulina recombinante. En este método, la proinsulina se
expresa con un péptido quelante en el extremo NH2. La proinsulina se puede purificar por
afinidad con iones metálicos inmovilizados, y el péptido quelante se elimina química o
enzimáticamente.
Electroforesis de Insulinas. La electroforesis es un método comúnmente utilizado para
detectar proteínas contaminantes en una muestra previamente purificada. Sin embargo, a
diferencia de muchas otras proteínas, las insulinas presentan un desafío especial. Las
técnicas electroforéticas convencionales separan las proteínas hasta pesos moleculares de
aproximadamente 12 000 Da, aunque se informa que las modificaciones de los
procedimientos convencionales extienden el rango de separación a Mr = 2500 (Fling y
Gregerson, 1986). Las proteínas o péptidos más pequeños que este migran y también
pueden teñirse de manera diferente que las proteínas más grandes. La insulina es un
polipéptido (M, = 5800) [cadena A M, = 2300, cadena B Mr = 34001 (Sanger, 1949).
Usando las técnicas de Fling y Gregerson (19861, la cadena B de insulina muestra un peso
molecular anormalmente alto, mientras que la cadena A no se tiñe debido a migración
anómala, falta de bandas o fijación inadecuada antes de la tinción. dificultades involucradas
en la separación electroforética de la insulina de las cadenas de los componentes A y B de
ita. Sin embargo, la insulina puede separarse de la proinsulina y la insulina monodesamido
usando un sistema de electroforesis en gel de disco de poliacrilamida descrito por Chance et
al. (1968). En este sistema en particular, sin embargo, la insulina y la insulina desalanina
(des B-30) tienen la misma carga neta y migran de forma idéntica
Purificación a gran escala de la insulina humana La purificación de una proteína que se ha
producido en exceso en E. coli requiere una metodología algo diferente a la utilizada en la
purificación de proteínas convencionales o en las técnicas utilizadas con fines analíticos
(Welinder y Linde, 1984). Se requiere un grado de pureza extremadamente alto, así como la
libertad de contaminar solventes y toxinas (de E. coli) y los nutrientes, metabolitos,
catabolitos y moléculas funcionales de la célula huésped que están presentes como
consecuencia del crecimiento celular (Johnson, 1986 ) La proteína recombinante también
debe estar libre de componentes de proteína de fusión. Además, se deben elegir las
condiciones de procesamiento para evitar la proteólisis de proteínas híbridas, especialmente
las proteínas más grandes que están sujetas a degradación proteolítica (Ullmann, 1984). En
particular, la insulina debe separarse de otras formas de insulina (proinsulina,
desamidoinsulina, etc.) que pueden ser inmunogénicas. Un esquema de purificación a gran
escala debe cumplir con todos estos requisitos, y al hacerlo, se ha estimado que más de la
mitad de los costos de procesamiento están en la purificación aguas abajo en relación con la
fermentación real (Ullmann, 1984). Los cuerpos de inclusión se forman en más del 80% de
los casos en los que las proteínas se han producido en exceso en E. coli (Welinder y Linde,
1984). La proteína de fusión de E. coli 8-galactosidasa-insulina no es una excepción.
Burgess (1987) ofrece un procedimiento para liberar una proteína de fusión insoluble que
implica los pasos de cromatografía de lisis, centrifugación, desnaturalización,
renaturalización, recitación e intercambio iónico. Muchas proteínas se han purificado de
cuerpos de inclusión insolubles mediante estos métodos de desnaturalización y
renaturalización. Se pueden seguir procedimientos de purificación más convencionales para
una proteína de fusión secretada como la 8-lactamasa-insulina. Existen pocos
procedimientos detallados y publicados para una secuencia completa de purificación a gran
escala para la insulina recombinante de E. coli Sin embargo, Kroeff et al. (1989) describen
un sistema de escala preparativa de cromatografía multimodal con un paso integral RP-
HPLC desarrollado para purificar y analizar la insulina humana recombinante producida a
partir de E. coli. Este sistema RP-HPLC se coloca bastante tarde en el sistema de
purificación de insulina ya que la mayoría de las impurezas (principalmente de E. coli) se
eliminan antes de este paso mediante un paso de intercambio iónico. Una separación por
exclusión de tamaño sigue al paso de fase inversa. El sistema de fase inversa se basa en una
fase estacionaria de 10 pm Zorbax (Du Pont Instruments, Wilmington, DE) CS de grado de
proceso para las columnas de escala de producción y partículas de 5 pm para las columnas
de escala analítica. Los cristales de zinc de insulina humana parcialmente purificados
preparados en Eli Lilly and Co. fueron el material de partida para esta parte de la secuencia
de purificación. La insulina se aplicó en una fase móvil rica en agua y luego se eluyó en un
gradiente lineal de ácido acético 0,25 M (eluyente A) a acetonitrilo acuoso al 60%
(eluyente B). Se recomienda una fase móvil ácida, ya que proporciona una excelente
resolución de la insulina de componentes similares a la insulina estructuralmente similares
al tiempo que promueve la solubilidad de la insulina. Se cree que el pH ideal está en la
región de 3.0-4.0, que está muy por debajo del pH isoeléctrico de 5.4. En condiciones
ligeramente ácidas, la insulina puede desamidarse a monodesamidoinsulina, pero si el RP-
HPLC se realiza con bastante rapidez (en cuestión de horas), la desamidación se puede
minimizar. Este sistema RP-HPLC se utilizó con éxito en un sistema a escala de producción
para purificar insulina recombinante con una potencia biológica igual a la obtenida del
sistema de purificación convencional, que emplea cromatografía de intercambio iónico y
exclusión por tamaño (Kroeff et al., 1989). Welinder y Linde (1984) investigaron la
cromatografía de intercambio iónico de alto rendimiento (HP IEC) para la purificación de
insulina y compararon este método con RP-HPLC para la separación de insulina. HP-IEC
permitió el fraccionamiento rápido de insulina cristalina sin gradiente de sal. Descubrieron
que HP-IEC daba una buena recuperación y tenía menos contaminantes orgánicos que RP-
HPLC, pero era necesario realizarlo en condiciones de disociación (urea 7 M).