PRODUCCIÓN DE GLUCAGÓN HUMANO RECOMBINANTE EN FORMA DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN EN ESCHERICHIA

COLI; RECUPERACIÓN DE GLUCAGÓN POR DIGESTIÓN ESPECÍFICA DE SECUENCIA

Resumen

El glucagón humano recombinante se produjo con éxito con un alto nivel de expresión en Escherichia coli como una
proteína de fusión con interferón humano. El gen sintético fue diseñado para liberar glucagón, que no contiene residuos
de ácido glutámico, de la proteína de fusión con la proteasa de la cepa V8 de Staphylococcus aureus que escinde
específicamente el enlace peptídico en el lado carboxilo del residuo de ácido glutámico. El glucagón resultante se
purificó hasta homogeneidad mediante una combinación de HPLC de fase inversa C18 y HPLC de intercambio iónico. El
rendimiento de glucagón intacto obtenido de 1 1 de cultivo fue de aproximadamente 12 mg. La estructura del glucagón
humano recombinante se confirmó por HPLC y análisis de composición / secuencia de aminoácidos.

Introducción

El glucagón es una hormona peptídica de 29 residuos que se sintetiza en las células A de los islotes de Langerhans como
un gran precursor con una masa molecular relativa de 18000 (Patzelt et al. 1979). El glucagón desempeña un papel
importante en el control de la concentración de glucosa en sangre junto con la insulina a través de la activación de la
glucogenólisis hepática y la gluconeogénesis (Unger y Orci 1981), y por lo tanto se usa ampliamente en la terapia para
mantener un nivel de glucosa en sangre normal. También se informa que es útil para inducir suficiente hipotonicidad e
hipomotilidad del duodeno durante los estudios de bario (Chernish et al. 1972).

El glucagón con fines terapéuticos se ha extraído y purificado de páncreas bovino y porcino, ya que las secuencias de
aminoácidos son idénticas a las del glucagón humano (Thomsen et al. 1972). Sin embargo, los procesos involucrados son
complicados y laboriosos porque las cantidades presentes son muy pequeñas. Lo que se necesita es una fuente más
eficiente y estable de glucagón, por ejemplo, mediante su producción utilizando técnicas de ADN recombinante. Sin
embargo, una expresión directa de glucagón recombinante usando una secuencia señal secretora en levadura informada
por otro grupo (Moody et al. 1987) resultó en una productividad insuficiente debido a la degradación proteolítica del
glucagón humano resultante.

Hemos tratado de desarrollar un método alternativo para producir eficientemente grandes cantidades de glucagón
humano de grado terapéutico. Un estudio anterior mostró que el inhibidor de la tripsina secretora pancreática
recombinante humana (PSTI) podría expresarse con éxito como una proteína de fusión químicamente escindible en
Escherichia coli utilizando la productividad de alto nivel de interferón humano recombinante 7 / (IFN 7 /) (Kikuchi et al.
1987 ) Esto nos llevó a aplicar la estrategia de expresar el glucagón humano recombinante en E. coli.

En este artículo, informamos la expresión de alto nivel de glucagón humano recombinante utilizando E. coli como célula
huésped en forma de una proteína de fusión con IFN-r humano y la recuperación del glucagón utilizando endopeptidasa
específica del ácido glutámico, una proteasa de Staphylococcus aureus cepa V8 (proteasa V8). La estrategia aquí descrita
también debería ser aplicable a la producción de otros polipéptidos individuales que no contienen residuos de ácido
glutámico.

Método

Construcción de plásmido que expresa glucagón fusionado con IFN. Se sintetizaron catorce oligonucleótidos (designados
F-1 a F-14 como se muestra en la Fig. La) usando un sintetizador de ADN automatizado "Gene Assembler Plus"
(Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia) seguido de fosforilación con polinucleótido quinasa T4, mientras que F-
1 y F-14 se dejaron sin fosforilar. Estos oligonucleótidos se ligaron para construir un gen de glucagón sintético precedido
por GAA que codifica el ácido glutámico. La secuencia de nucleótidos del glucagón se diseñó sobre la base del uso
preferencial de codones en E. coli (Ernst 1988). El gen construido se purificó por electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 12%. Se produjo un plásmido expresable para el glucagón fusionado con IFN y mediante la ligadura de
tres fragmentos de ADN: (i) un fragmento de 102 pb con extremos PstI-BamHI (Fig. La, una secuencia que codifica el
glucagón que precede al ácido glutámico); (ii) un adaptador SalI-PstI (Fig. lb) que codifica cuatro residuos de aminoácidos
(Pro-Phe-Arg-Cys); y (iii) un gran fragmento de pAT-Trp huIFN y / PSTI (Kikuchi et al. 1987), digerido con BamHI y SalI,
que codifica 135 residuos amino terminales de IFN-r humano y cinco residuos de aminoácidos derivados del enlazador
(Lys -Ser-Leu ValAsp) expresado bajo el promotor trp. Este fragmento se trató con E. coil fosfatasa alcalina para evitar la
reciclación antes de la ligadura. La estrategia para construir el plásmido de expresión se muestra en la Fig. 2. El plásmido
resultante (designado pAT-Trp huIFN-r glucagón) se introdujo en la cepa HB101 de E. coli y se caracterizó por mapeo de
restricción-endonucleasa y las secuencias de nucleótidos para la unión y el glucagón fueron confirmados por el método
de terminación de cadena didesoxi (Sanger 1981).

Expresión de la proteína de fusión lFN r-glucagón en E. coli. Se usó la cepa C600 de E. coli que alberga pAT-Trp huIFN r /
glucagón para producir glucagón fusionado con IFN humano. Las células se cultivaron en 1 l de un medio M9 modificado
(0.6% Na2HPO4, 0.3% KHzPO4, 1% glicerol, 2% casaminoácido, 0.1% K2CO3, 0.1 mM CaCI2, 2.0ram MgCI ~, 2.0 Ixg / ml
vitamina B1) que contiene 15 mg / 1 de tetraciclina durante 24 ha 37 ° C.

Análisis de electroforesis en gel de dodeeil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDSPAGE). El lisado total de E. coli para el
análisis de SDS-PAGE se preparó a partir de sedimentos celulares hervidos en tampón de muestra Laemmli (TRIS-HC1 0,1
M, pH 6,8, sacarosa al 20%, SDS al 1%, fl-mercaptoetanol al 1%) para 3 lluvias. SDS-PAGE se realizó según lo descrito por
Laemmli (1970). Las bandas de proteínas se visualizaron mediante tinción con Coomassie Brilliant Blue R250.

Escisión de la proteína de fusión. Las células de E. coli se cosecharon por centrifugación a 5000 g durante 10 min. Las
células se lavaron y se volvieron a suspender en una solución salina tamponada con fosfato modificada (PBS, que
contiene EDTA 5 mM, fl-mercaptoetanol 10 mM y clorhidrato de benzamidina 10 mM). Después del tratamiento con
lisozima (2 mg / g de peso celular húmedo a 35 ° C durante 1 h) seguido de sonicación, los materiales insolubles, incluida
la proteína de fusión, se recogieron por centrifugación a 20000 g durante 20 min. El sedimento resultante se disolvió
luego en el PBS modificado que contenía guanidina-HCl 6 M, y los restos no disueltos se eliminaron por centrifugación. El
sobrenadante aclarado se dializó contra NH4HCO3 50 mM, EDTA 5 mM y guanidina-HCl 1 M, pH 7,8, y luego se trató con
proteasa V8 durante 1 ha 37 ° C a concentraciones de proteasa y proteínas totales de 0,2 mg / ml y 2,2 mg. / ml,
respectivamente.

Purificación de glucagón recombinante. Después de la centrifugación de la muestra digerida a 5000 g durante 5 minutos,
el sobrenadante se sometió a HPLC de fase inversa C18 empleando un gradiente lineal de acetonitrilo (32-42%) en ácido
trifluoroacético al 0,1% en 20 minutos a una velocidad de flujo de 1,5 ml. / min. Una fracción eluida con el mismo tiempo
de retención que la del glucagón auténtico se purificó adicionalmente por HPLC de intercambio iónico bajo las
condiciones de un gradiente lineal de NaC1 (0-0.1 M) en 10 mM TRIS HC1, pH 8.5, acetonitrilo al 20% en 30 minutos. a
un caudal de 0,5 ml / min (columna: DEAE-5PW, Toso, Tokio, Japón). El pico principal resultante se recuperó y se
evaporó al vacío hasta sequedad. El rendimiento de glucagón recombinante se calculó a partir del área del pico de
absorbancia a 210 nm en el perfil de HPLC basado en el del glucagón estándar.

Análisis de glucagón recombinante. Después de la hidrólisis en ácido metanosulfónico 4 M que contiene 0.2% de 3- (2-
aminoetil) indol a 110 ° C durante 24 h (Simpson et al. 1976), la composición de aminoácidos se determinó con un
analizador de aminoácidos (Modelo 835 Hitachi, Tokio, Japón). El análisis de secuencia de aminoácidos se realizó en un
secuenciador de proteínas de fase gaseosa 477A de Applied Biosystems (Foster City, California, EE. UU.) (Iwanaga et al.
1969; Tsunasawa et al. 1985)

Discusión

En un experimento preliminar, intentamos expresar el glucagón directamente en E. coli, pero solo se observó un bajo
nivel de expresión (datos no mostrados). En general, la expresión directa de una proteína pequeña en las células
procariotas no es eficiente, probablemente debido a la rápida degradación intracelular por las proteasas del huésped
(Uhlen y Moks 1990). Aunque Moody et al. (1987) informaron la expresión directa de glucagón por una cepa de levadura
transformada, se descubrió que el glucagón expresado era escindido en cierta medida por el sistema enzimático de
levadura. Dado que el glucagón es una hormona polipeptídica única que no requiere modificación eucariótica
postraduccional para la actividad biológica cuando se produce como una forma recombinante en huéspedes extranjeros,
se esperaba que E. coli fuera un huésped adecuado que produjera grandes cantidades de glucagón recombinante.

Para mejorar la eficiencia de expresión y prevenir la degradación del producto, expresamos glucagón como una proteína
de fusión con IFN r humano en E. coli. Dado que el glucagón (29 aminoácidos) es solo una pequeña proporción de la
proteína de fusión (175 aminoácidos) en el lado carboxilo, el comportamiento de la proteína de fusión en E. coli sería
similar al del IFN r recombinante, es decir, nosotros podría esperar una producción de alto nivel de la proteína de fusión
como con IFN r solo (Simons et al. 1984), y la proteína de fusión resultante formaría cuerpos de inclusión insolubles
resistentes a la degradación proteolítica, lo que también es ventajoso para la purificación (Marston 1986 ) Dado que el
glucagón no contiene residuos de ácido glutámico, el glucagón intacto podría recuperarse de la proteína de fusión por
digestión con la proteasa V8. La proteasa V8 es bastante adecuada para este propósito, porque la proteasa todavía
exhibe su actividad sustancial en presencia de guanidina ~ HCl. La estricta especificidad de secuencia en la reacción de
escisión de la proteasa V8 la convierte en una opción frecuente para el mapeo de péptidos y proporcionaría una
liberación precisa y eficiente de glucagón intacto.

Para construir el plásmido de expresión para el glucagón fusionado con IFN r, utilizamos un plásmido de expresión PSTI
fusionado con IFN r como un vector original, que dirige la expresión de grandes cantidades de proteína de fusión IFN r-
PSTI. Los genes sintéticos para el glucagón y el ADN adaptador (Fig. 1) se insertaron en el plásmido de expresión en lugar
de la región de codificación de PSTI para obtener el constructo pATTrp hulFN r glucagón que se muestra en la Fig.2. La
proteína de fusión expresable se diseñó para consistir en 135 residuos amino terminales de IFN r humano y 29 residuos
de glucagón interpuestos por 11 aminoácidos (Lys-Ser-Leu-ValAsp-Pro-Phe-Arg-Cys Ser-Glu) derivados de una conexión
secuencia que incluía un residuo de ácido glutámico. Dado que el resto de glucagón estaba conectado a IFN r a través de
un residuo de ácido glutámico anterior, se podía escindir de la proteína de fusión por la proteasa V8.

Después de 24 h de cultivo de E. coli C600 transformada, se pudieron ver cuerpos de inclusión insolubles en las células
de E. coli por microscopía, y la SDS-PAGE del lisado celular total mostró la expresión de una proteína de fusión de 21 kDa
(34.5% del total proteína y casi el mismo nivel que IFN r recombinante; este valor corresponde a 42 mg de glucagón
intacto en la proteína de fusión de 1 l de cultivo), que no se pudo detectar sin el vector de expresión (Fig. 3). Esta
proteína de fusión se encontró exclusivamente en la porción insoluble, y la presencia de glucagón en ella se confirmó
mediante análisis de transferencia Western usando antisuero de conejo antiglucagón (datos no mostrados). La proteína
de fusión se solubilizó completamente en presencia de guanidina-HCl 6 M. Redujimos la concentración de guanidina-HCl
por diálisis y descubrimos que 1 M era el nivel crítico para mantener la proteína de fusión en forma soluble. Finalmente,
se utilizó la proteasa V8 para recuperar el glucagón en tampón de bicarbonato de amonio, pH 7,8, que contiene 1 M de
guanidina-HCl. Un aumento de la concentración de guanidina-HCl resultó en una digestión incompleta de la proteína de
fusión.

Como hay diez residuos de ácido glutámico en la proteína de fusión, se liberaron varios fragmentos peptídicos de varios
tamaños, incluido el glucagón intacto, de la proteína de fusión. Esta mezcla de péptidos digeridos se separó por HPLC de
fase inversa C18 como se describe en Materiales y métodos (Fig. 4). Los péptidos en la fracción rayada que se muestra
en la Fig. 4 con el mismo tiempo de retención que el del glucagón auténtico se analizaron mediante secuenciación de
aminoácidos. El resultado indicó que esta fracción consistía en glucagón (13,6 mg de 1 l de cultivo) con una pureza de
aproximadamente el 90%. Estaba contaminado por un péptido de 53 residuos que tenía glucagón en su terminal
carboxilo, que podría formarse por digestión incompleta de la proteína de fusión. Esta fracción pico se purificó
adicionalmente por HPLC de intercambio de iones a una única composición (datos no mostrados). El tiempo de
retención de esta muestra purificada en HPLC de intercambio iónico fue idéntico al del glucagón auténtico. La
composición de aminoácidos (datos no mostrados) y la secuencia de aminoácidos (Tabla 1) del producto final
coincidieron con los valores teóricos. El rendimiento global del glucagón recombinante fue de aproximadamente 12 mg
de 1 1 de cultivo (aproximadamente 3,3 g de peso celular húmedo).