PRÁCTICA Nº 02

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA ESTUDIO MICOLÓGICO

Prof. Liduvina Sulca Quispe

I. FUNDAMENTO TEÓRICO

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que semejan el nicho ecológico de
los hongos y, son utilizados para su cultivo, aislamiento y conservación.

Los medios de cultivo deben contener los nutrientes indispensables y condiciones

físicas óptimas para asegurar el desarrollo y reproducción de los hongos. Tales
nutrientes son: Carbono, Nitrógeno, Azufre, fósforo y sales inorgánicas que suplan
iones como potasio, magnesio, calcio, hierro, Zinc, Cobre, Manganeso, Molibdeno y
Gallium. Los oligoelementos son requeridos específicamente para la activación de
enzimas o para la síntesis de vitaminas y otros metabolitos. Los nutrientes
generalmente se aportan con extracto de malta, extracto de levadura, peptona y
productos naturales como papa, zanahoria, maíz, avena, etc.
Los requisitos mínimos que debe contener un medio de cultivo son:

 Una fuente de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, potasio, magnesio, cobre

y molibdeno.
 pH ligeramente ácido (5 a 6)
 Temperatura entre 20 a 30 ºC
 Humedad
Todos los hongos utilizan glucosa como fuente de carbono, la mayoría utilizan
sacarosa y algunos utilizan diferentes carbohidratos.

Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos. Como agente solidificante para
obtener un medio sólido se emplea el agar - agar (1,5 a 2 %) el cual no tiene valor
nutritivo sino que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo más o
menos prolongado.

La mayoría de hongos de suelo, crecen bien en agar harina de maíz (CMA), un

medio relativamente pobre en comparación a PDA. Los hongos que habitan en la
madera y hongos dematiáceos a menudo esporulan mejor en CMA o agar avena
(OA). Los hongos que degradan la celulosa pueden ser cultivados en Agar Agua
(AA) o Agar papa zanahoria que contenga un trozo de papel filtro o paja de trigo
estéril en la superficie del agar.

Los hongos se pueden cultivar fuera de su hábitat normal, para lo cual es importante
la preparación y selección adecuada de los medios de cultivo. Los medios de cultivo
para el aislamiento primario de los hongos se deben seleccionar en función del hongo
que se sospeche y del tipo de muestra.

Si la muestra procede de una zona con flora mixta, se deben utilizar medios que
contengan inhibidores como: cloranfenicol, para inhibir el desarrollo bacteriano y
cicloheximide, rosa de bengala, dicloran, etc. para inhibir el desarrollo de hongos de
rápido crecimiento. Los antibióticos más empleados para inhibir el desarrollo
bacteriano son: gentamicina (40 mg/L), cloranfenicol (0,4 g/L), tetraciclina (0,1 g/L)
bencilpenicilina (0,1 g/L), estreptomicina (40 ug/ml), gentamicina (40 mg/L) y
ciprofloxacino. El cicloheximide (actidiona) en una concentración de 0.5 mg/ml evita
el desarrollo de hongos contaminantes de crecimiento rápido.

Clases de medios de cultivo. - Por su composición:

1. Medio enriquecido. - Son aquellos que además de las sustancias nutritivas

normales contienen una serie de factores indispensables para el crecimiento de
hongos nutricionalmente exigentes. Son útiles para la recuperación de hongos
dimórficos más exigentes como Blastomyces dermatitidis. Ejemplo: El Agar
cerebro corazón (BHI) con 5 - 10% de sangre de cordero más cloranfenicol y
cicloheximida.

2. Medios complejos o naturales. - Contienen únicamente tejidos vegetales como

hojas, raíces, vainas y granos; en trozo o macerados que han sido esterilizados.
Ejemplo: agar hojas de clavel.

3. Medios definidos o sintéticos. - Son aquellos que tienen una composición

química definida cualitativa y cuantitativamente y se usan en investigación, no
son de uso sistemático. Ejemplo el Agar Czapek’s

4. Medios semisintéticos. - Contienen sustancias naturales (extractos de animales y

extractos o preparados vegetales como harina de maíz y hojuelas de avena) y
elementos sintéticos. Ejemplo: Agar extracto de levadura y extracto de malta
(MEA)

5. Medios carentes de nutrientes.- Son utilizados para obtener cultivos

monospóricos, aislar patógenos que se encuentran en tejido vegetal, para forzar la
esporulación de algunos hongos. El más común es el agar agua.

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA HONGOS

AZUL DE LACTOFENOL.- Líquido de montaje para el exámen microscópico. Es

útil para examinar la estructura fúngica en montaje a partir de cultivo o microcultivo.

La glicerina previene la desecación, el ácido láctico es un agente aclarante que

preserva la estructura del hongo, el fenol mata al hongo y el azul de algodón colorea
la pared celular.

 Glicerina 40 ml
 Ácido láctico 20 ml
 Fenol en cristales 20 g
 Azúl de algodón al 1% 2 ml (ó 0,05 g de azul de algodón en polvo)
 Agua destilada 20 ml
 HIDROXIDO DE POTASIO AL 20% y 30%- Liquido aclarante empleado para la
observación directa de muestras de dermatofitosis. Disuelve la queratina y aclara la
preparación sin afectar la morfología de las estructuras fúngicas, permitiendo una
mejor visualización.

HIDROXIDO DE POTASIO AL 2%- Se emplea para ablandar trozos de material

vegetal enfermo seco o duro, por exposición de 5 minutos y facilitar el corte
histológico para el examen microscópico de la estructura fúngica.

AGAR INFUSION CEREBRO CORAZÓN

Es un medio de cultivo fúngico que permite el crecimiento de prácticamente todos

los hongos clínicamente importantes. Se utiliza para la recuperación primaria de
hongos dimórficos.

AGAR CZAPEK’S

Se utiliza para el subcultivo de especies de Aspergillus para su diagnóstico

diferencial.

AGAR MYCOSEL/ MYCOBIOTIC

Es generalmente agar Sabouraud Dextrosa añadido con cicloheximida y

cloranfenicol. Se utiliza para la recuperación primaria de dermatofitos.
AGAR SABOURAUD DEXTROSA

Es utilizado para el cultivo, aislamiento y conservación de hongos patógenos y no

patógenos. El agar de Sabouraud es muy usado para la recuperación de dermatofitos
a partir de muestras cutáneas y levaduras a partir de muestra vaginal.

El agar dextrosa de Sabouraud (2%) es más útil como un medio para el subcultivo de
hongos recuperados en medio enriquecido para mejorar la esporulación típica y
proporcionar la morfología característica de las colonias.

Componentes:

 Neopeptona 10g
 Dextrosa 20 g
 Agar 15 g
 Agua destilada 1000 ml

Preparación por componentes:

Disolver la glucosa en el agua destilada, adicionar la peptona y el agar. Dejar en

reposo por 5 minutos y mezclar hasta uniformizar. Calentar agitando frecuentemente
y hervir 1 minuto hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 15libras de presión por 15
minutos.
Enfriar aproximadamente a 45ºC y añadir el antibiótico. Verter en placas de Petri
estériles en un volumen de 20 a 25 ml por placa.

Cuando se requiera el medio en tubo de ensayo, distribuir el volumen requerido antes

de esterilizar y posteriormente enfriar en posición inclinada. Conservar en
refrigeración hasta su uso.

AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

Es utilizado para el aislamiento, recuento y conservación de una amplia gama de

hongos.

Componentes:

 Papa pelada y picada 250 g

 Glucosa 20 g
 Agar agar 20 g
 Agua destilada 1000 ml

AGAR HARINA DE AVENA (OA)

Es un medio de cultivo adecuado para el aislamiento de Pythium, phytophthora,

Fusarium, Phoma y otros fitopatógenos; particularmente para la producción de
picnidios y esporangios.

Componentes:

 Avena (hojuelas) 30 g
 Agar 15 g
 Agua destilada 1000 ml

Preparación por componentes:

Colocar la avena en el agua destilada y calentar en baño maría por 30 minutos a una
temperatura de 60 °C removiendo constantemente. Filtrar a través de tres o cuatro
capas de gasa y llevar el filtrado nuevamente al volumen inicial con agua destilada.
Añadir agar. Disolver completamente por calentamiento hasta ebullición. Autoclavar
para esterilizar.

Nota

Para inducir abundante formación de esporangios en P. parasitica var. Nicotianae,

transfiera el micelio aéreo de un cultivo de 15 a 20 días a una placa de Petri que
contenga suficiente KNO3 0.01 M para humedecer el micelio, pero no sumergirlo.
Incubar de 2 a 10 días a temperatura ambiente.
AGAR HARINA DE MAÍZ

Es un medio de bajo poder nutricional. Se emplea para el cultivo de hongos

fitopatógenos y para la producción de clamisdosporas por Candida albicans.

 Harina de maíz amarillo 47 g

 Agar 17 g
 Agua destilada 1000 ml

MEDIO AGAR JUGO V-8

Es empleado para el aislamiento de Pythiaceos y otros hongos

Componentes:

 Jugo V8 200 ml
 Carbonato de calcio 3 g.
 Agar – agar 18 g.
 Agua destilada 800 ml

Preparación:

 Agreqar 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua destilada tibia.

 Agregar el Carbonato de calcio y luego el agar.
 Mezclar los componentes por rotación del matraz o con ayuda de una varilla de
vidrio.
 Disuelver los componentes por calentamiento en baño maria .
 Restaurar el volumen total adicionando agua destilada.
 Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15 minutos.

AGAR AGUA

Es un medio pobre en nutrientes que permite el crecimiento del hongo en forma muy
rala. Es especialmente usado para hacer aislamientos de punta de hifa, para aislar y
hacer germinar esporas, para obtener cultivos monospóricos y verificar la viabilidad
del inóculo.

Componentes:

 Agar – agar 16 g
 Agua destilada csp 1 litro

Preparación:

 Disolver el agar en el agua destilada por calentamiento en baño maria.

 Esterilizar en autoclave a 15 lb. De presión por 15 minutos
 AGAR FITOLEVADURA.- Es generalmente usado para el aislamiento de hongos
de insectos. Permite el crecimiento exuberante del micelio y una buena producción
de esporas.

Componentes:

 Dextrosa 20 g
 Extracto de levadura 5g
 Peptona 5g
 Agar – agar 18 g
 Agua destilada 1 litro

AGAR ROSA BENGALA + CLORANFENICOL

Usado para el recuento de hongos en alimentos, agua y materiales ambientales.
Componentes:
Peptona 5g
Dextrosa 10 g
KH2PO4 (fosfato dipotásico) 2g
MgSO4.7H2O (sulfato magnésico) 0,5 g
Rosa bengala 0,05 g
Agar-agar 15 g
Cloranfenicol 0,1 g

II. OBJETIVO

 Reconocer los reactivos y medios de cultivo más utilizados en Micología

 Adiestrar al estudiante en la preparación de los medios de cultivo empleados para

el aislamiento de hongos.

III. MATERIALES
 Matraz . Probeta
 Varilla de vidrio . Vaso de precipitado
 Agua destilada . Papa blanca
 Harina de maíz . Harina de avena
 Gasa . Cloranfenicol, estreptomicina
 Calculadora

IV. PROCEDIMIENTO

4.1 Preparación de Agar papa Dextrosa

- Hacer los cálculos para preparar 200 ml de PDA.
- Lavar y pelar una papa, cortarla en pedazos pequeños y pesar.
 - Hacer hervir en un vaso de precipitado en el volumen total de agua destilada,
hasta que se cocine (10 -20 minutos).
- Filtrar a través de una gasa y reponer el volumen anterior.
- En un matraz disponer la mitad del filtrado, añadir la glucosa y disolver.
- Adicionar el agar. Dejar en reposo por 5 minutos y disolver completamente por
calentamiento en baño maría hasta ebullición, removiendo constantemente.
- Taponar la boca del matraz con una torunda de algodón y cubrir con papel craft.
- Rotular adecuadamente y esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15
minutos.

4.2 Preparación de Agar Harina de Maíz (CMA)

- Hacer los cálculos para preparar 50 ml del medio de cultivo.
- Colocar la harina de maíz en un vaso de precipitado conteniendo el agua destilada,
remover con una varilla de vidrio y mantener en baño maría de 60°C por 30
minutos, removiendo constantemente. Filtrar a través de una gasa y reponer el
volumen inicial (infusión).
- Verter la infusión en un matraz y agregar el agar. Dejar en reposo por 5 minutos y
disolver completamente por calentamiento en baño maría hasta ebullición.
- Taponar la boca del matraz con una torunda de algodón y cubrir con papel craft.
- Rotular adecuadamente y esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15
minutos.

4.3 Preparación de Agar Avena (OA)

- Hacer los cálculos para preparar 100 ml del medio de cultivo.
- Colocar la avena en un vaso de precipitado conteniendo el agua destilada, remover
con una varilla de vidrio y mantener en baño maría de 60 ºC durante 30 minutos,
removiendo constantemente.
- Filtrar a través de una gasa y reponer su volumen inicial (infusión).
- Verter la infusión en un matraz y agregar el agar. Dejar en reposo por 5 minutos y
disolver por calentamiento, en baño maría, hasta ebullición.
- Taponar la boca del matraz con una torunda de algodón y cubrir con papel Kraft.
- Rotular adecuadamente y esterilizar en autoclave a 15 libras de presión por 15
minutos.

V. RESULTADOS
5.1 Preparación de Agar Papa Dextrosa
a) Cálculos para preparar 200 ml del medio de cultivo, por componentes:
Componentes Cantidad Cantidad Cantidad

Papa 250 g
Glucosa 20 g
Agar agar 20 g
Agua destilada 1000 ml 100 ml 200 ml
 b) Pasos para preparar 200 ml del medio de cultivo PDA
Desarrolle los pasos mediante un esquema.

5.2 Preparación de Agar Harina de Maíz

a) Cálculos para preparar 50 ml del medio de cultivo, por componentes:
Componentes Cantidad Cantidad Cantidad

Papa 250 g
Glucosa 20 g
Agar agar 20 g
Agua 1000 ml 100 ml 50 ml
destilada

b) Pasos para preparar 50 ml del medio de cultivo PDA

Desarrolle los pasos mediante un esquema.

5.3 Preparación de Agar Avena

a) Cálculos para preparar 100 ml del medio de cultivo, por componentes
Componentes Cantidad Cantidad

Papa 250 g
Glucosa 20 g
Agar agar 20 g
Agua destilada 1000 ml 100
b) Pasos para preparar 50 ml del medio de cultivo PDA
Desarrolle los pasos mediante un esquema.

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VII. CONCLUSIONES
VIII. BIBLIOGRAFÍA
CUESTIONARIO
1. Qué nutrientes aporta cada uno de los componentes de los siguientes medios de
cultivo: Agar BHI, Agar Czapek’s, Agar Mycosel, Agar Harina de Avena, Agar
Harina de Maíz, Agar Rosa de Bengala + Cloranfenicol y Agar jugo V-8.
2. En los siguientes medios de cultivo señale que componentes son la fuente de C,
energía, N, minerales y vitaminas: Agar Fitolevadura, PDA y Agar Extracto de
Malta.
3. De acuerdo a su composición los medios de cultivo son de 5 clases: ¿ A qué clase
de medios de cultivo pertenecen los siguientes? Agar Mycosel, Agar Sabouraud,
PDA, OA, CMA, Jugo V8, Agar Fitolevadura y Agar Rosa de Bengala +
Cloranfenicol.