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9.1 COMPETENCIAS
9.2 INTRODUCCION
9.3.1 Generalidades
Medios de cultivo y reactivos: la importancia que tiene la calidad en la fabricación de los
medios de cultivo deshidratados así como su preparación, conservación y uso, es el punto
de partida para lograr que estudios los microbiológicos y sus resultados sean confiables.
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
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Manual Práctico de Microbiología de Alimentos
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1. Pesar. Debe tenerse en cuenta la cantidad a pesar dependiendo del volumen final de
medio a preparar. Siempre es conveniente pesar un poco más de la cantidad requerida si el
pesaje se hace a parte del recipiente que contendrá el medio final. Para aquellos medios que
no deben autoclavarse es recomendable emplear recipientes estériles para la preparación de
los mismos.
2. Disolver. Adicionar 2/3 partes del volumen de agua destilada (estéril en el caso de
aquellos medios que no deben autoclavarse) a temperatura templada sobre las paredes del
recipiente para arrastrar el medio deshidratado que haya quedado adherido a las mismas.
Agitar y adicionar el contenido restante de agua.
3. Calentamiento-Ebullición. Este paso se lleva a cabo siempre en constante agitación y su
fin es facilitar la disolución completa del medio deshidratado. En aquellos medios que no se
autoclavan el calentamiento se debe llevar a ebullición por el tiempo indicado en las
instrucciones del medio con el fin de facilitar la formación del gel y la no destrucción de sus
componentes más termosensibles.
4. Esterilizar. Esta etapa solo se realiza para aquellos medios que en su formulación /
composición no posean componentes termosensibles o cuando el fabricante así lo
recomiende. En general, el régimen de temperatura-tiempo para la esterilización de medios
de cultivo es 121ºC por 15 minutos pero pueden emplearse temperaturas más bajas por
tiempos más largos. Es recomendable emplear frascos taparosca para este fin, teniendo en
cuenta que la tapa debe quedar algo floja para, facilitar la salida del aire frío con el
subsecuente calentamiento más rápido y por otro lado, evitar la acumulación de gases en el
espacio de cabeza del medio y no elevar su presión más de lo debido.
5. Servir. Finalmente, una vez terminado el tiempo de esterilización debe dejarse atemperar
el medio hasta alcanzar temperaturas de 55ºC antes de dispersarlo en las placas. No se
recomienda verter más caliente ya que desprende vapor de agua y así las placas quedarán
muy húmedas y consensadas, pero tampoco más frío por la compactación del gel.
Cepas control. Las cepas control se usan para determinar la eficiencia de los medios de
cultivo sintéticos y semisintéticos deshidratados, estas cepas son un cultivo de un
microorganismo conocido y certificado por alguna entidad o laboratorio conocido, por
ejemplo la American Type Culture Collection (ATCC, USA) que cuenta con la colección más
amplia de bacterias, hongos y levaduras patógenas y no patógenas o la National Collection
of Type Cultures (NCTC, Gran Bretaña), la cual es una colección de bacterias en general.
Otras colecciones de cepas son:
∗ DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganisman., hongos y bacterias no patógenas).
∗ NCIB (National Collection of Industrial Bacteria: Bacterias no patógenas).
∗ NRRL (Northern Regional Research Laboratory ARS Culture Collection:
Procedimiento.
A continuación vamos a explicar la forma como se debe realizar el test Ecométrico:
4 2
3
2. Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deberá ser de unos 4
mm.
3. A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en crecimiento toda
la noche o 18 horas de incubación), tome con una asa calibrada de 1 microlitro y trace
sobre la superficie del medio 5 estrías paralelas a las líneas dibujadas en cada
cuadrante y una estría central, de forma progresiva y sin recargar, retorcer, repisar o
esterilizar el asa (Fig. 2). Hacer lo mismo con el medio de referencia.
Primer paso
Segundo paso
Quinto paso
4 2
5. Transcurrido el tiempo, efectuar la lectura de las cajas, teniendo en cuenta que cada
estría tiene un valor de 0.2 y la estría central de 1.0.
7. Efectuar la misma operación con el medio de referencia. Una vez obtenida las lecturas
en cada medio (ICA), sacar el Índice de Crecimiento Relativo (ICR), comparando el ICA
del medio en evaluación y el medio de referencia.
ICAmedioevaluado
ICR
ICAmedioreferencia
OBSERVACIONES:
¾ Para evaluar la productividad de un medio selectivo, se mide teniendo en cuenta que las
cepas esperadas (microorganismos deseados) deben dar un ICA no menor a 2.5 – 3.
3. A partir de cultivos en fase exponencial (18 horas de incubación), se siembran los caldos
por duplicado con 0.1 ml de cultivo de cada microorganismo que contenga 105 UFC/ml
(Fase exponencial 1:100).
4. Se retira 0.1 ml del caldo de análisis y se coloca sobre la superficie de una caja bien
seca que contenga agar no selectivo. Con ayuda de un asa de Hockey se extiende
sobre la superficie de la caja.
6. A intervalos de tiempo diferentes, se retira una parte de cada caldo con asa calibrada,
pipeta o micropipeta, si es necesario se diluye y distribuye sobre cajas de petri que
contenga el mismo medio utilizado anteriormente. Es posible evaluar resultados
mediante observación directa o registrando el recuento en función del tiempo en una
gráfica. Se debe analizar cada lote de caldo selectivo adquirido por el laboratorio para
verificar el número de células del microorganismo deseado que permite detectar. Para
ello se verifica el desempeño del medio con una mezcla de cultivos deseados e
indeseados.
El método de la evaluación del desempeño del caldo selectivo con una mezcla de cultivos
deseados e indeseados se desarrollo inicialmente para valorar medios para Salmonella spp., y
consiste en lo siguiente:
1. Preparar cajas petri con Agar Tripticasa de Soya u otro Agar no selectivo.
2. Con cultivos de la cepa deseada en fase estacionaria, preparar diluciones decimales
consecutivas (10–1 a 10–10) en solución salina peptonada, preparada según la
formulación que se indica enseguida (NaCI 8.5 g, peptona 1.0 g y agua destilada 1L pH
(7 – 7.2), estimar el número de UFC/ml con siembra en superficie sobre un Agar no
selectivo, seleccionar una dilución que permita un recuento. Al mismo tiempo preparar
un pool de cepas patrón no deseadas tomando 1 ml de cada uno de los
microorganismos no deseados y diluir 10-1 en solución salina peptonada
3. Para determinar la capacidad que tiene el caldo de enriquecimiento selectivo de
recuperar pequeñas concentraciones del microorganismo deseado, siembre 1 ml de
cada dilución de dicho microorganismo en 10 ml de ese caldo.
4. Incube en las condiciones normales del método y siembre por estrías sobre la superficie
del Agar no selectivo y selectivo que normalmente se usa en el método.
5. Observar las placas y calcular el número de microorganismos necesarios para activar el
desarrollo en el caldo de enriquecimiento selectivo
9.4 PROCEDIMIENTO
9.4.1 Material
Material de vidrio y otros
Tubos para dilución.
Cajas de petri.
Pipetas de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml.
Asas de platino calibradas.
Tubos tapa rosca.
Incubadoras a 25ºC, 35ºC y 45ºC.
Material biológico
Cepas bacterianas de 18 horas de incubación y repicadas por tres días
consecutivos:
- Staphylococcus aureus.
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
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- Escherichia coli.
- Salmonella typhimurium.
- Staphylococcus epidermidis.
- Enterobacter aerogenes.
- Micrococcus spp.
Medios:
Agar BHI, CASO, SPC, Baird Parker, Salado Manitol, VRBA, EMB, XLD,
Salmonella – Shigella, Bismuto sulfito, Hektoen, Chromocult, Caldo
tetrationate, Caldo Rapaport, Caldo selenite, Caldo Brilla.
9.4.2 Métodos
Evaluación de medios sólidos y líquidos
Seguir la metodología descrita anteriormente. En las tablas 1 y 2 se presentan algunos ejemplos
de medios de cultivo a evaluar con sus respectivos microorganismos deseados e interferentes.
Estas listas no son excluyentes, esto es, que se pueden emplear otros géneros bacterianos para
evaluar la selectividad y productividad de los medios cuando estos lo permitan.
Tabla 1. Microorganismos deseados e interferentes para evaluación de medios sólidos por
ecometría.
MICROORGANISMO TIEMPO MEDIO
AGAR EVALUAR
DESEADO INTERFERENTE INCUBACION REFERENCIA
Baird Parker S. aureus. E. coli. 48 horas. TSA / BHI
EMB E. coli. S. aureus. 24 horas. TSA / BHI
VRBA E. coli. P. vulgaris. 24 horas. TSA / BHI
Bismuto Sulfito Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
Hektoen Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
S–S Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
XLD Salmonella spp E. coli. 24 horas. TSA / BHI
9.5 RESULTADOS
A manera de ejemplo vamos a suponer que se está evaluando un medio de cultivo “X”. Después de
incubado se observa el crecimiento del microorganismo deseado en el medio notándose que en las
5 líneas del primer cuadrante hubo crecimiento y en tres líneas del segundo cuadrante. Así las cosas
el ICA obtenido para este medio es 1,6. Este resultado sale de multiplicar las 5 líneas del primer
cuadrante por 0,2 + 3 líneas del segundo cuadrante por 0,2.
9.6 BIBLIOGRAFÍA
Mossel, D.A.A., Bonants-Van Laarhoven, T., Ligtemberg-Markus, A.M.Th., et al. (1983). Quality
assurance of selective culture media for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at
standardization at the international level. Journal of Applied Bacteriology, 54, 313-327.
Mossel, D.A.A., Correy, J.E.L., Struijk, C.B., et al. (1995). Essentials of the Microbiology of Foods.
Chichester, UK: John Wiley.
Harrigan, W.F. (1998). Laboratory Methods in Foo Microbiology, 3rd Ed. San Diego, California, USA:
Academic Press.
9.7 ANEXOS
A continuación encontrará 2 modelos de formatos para la evaluación de medios sólidos y
líquidos selectivos y no selectivos.
FORMATO 1
VALORES DE REPRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD - MÉTODO ECOMÉTRICO
FECHA: _____________________
Cepa Interferente: ________________________________
Cepa deseada: ________________________________
Instrucciones:
Frente a la línea de cada cuadrante coloque un (+) si se presenta crecimiento y (-) si no hay crecimiento.
Sume el número de positivos para cada cuadrante y multiplique por 0.2. En la fila correspondiente a suma
coloque el resultado para cada cuadrante, y en la línea 5 si hay crecimiento coloque un valor de 1.
Finalmente sume los resultados y obtendrá el ICA para cada medio.
Medio de referencia: Agar ________________________.
1 2 3 4 5 SUMA
Cuadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 3 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 4 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Línea 5 ______
ICA: _______
Medio a valorar productividad: Agar ________________________.
1 2 3 4 5 SUMA
Cuadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 3 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 4 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Línea 5 ______
ICA: _______
Medio a valorar selectividad: Agar ________________________
1 2 3 4 5 SUMA
Cuadrante 1 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 2 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 3 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Cuadrante 4 ____ ____ ____ ____ ____ ______
Línea 5 ______
ICA: ________
Valor de Índice de Crecimiento Relativo (ICR): _______
FORMATO 2
REGISTRO DE VALORES DE REPRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD
MEDIOS LÍQUIDOS (ej. Caldo Lauryl sulfato + MUG para Coliformes Totales y fecales)
FECHA: _____________________
Medios evaluados: ______________________________________________________
Cepa deseada: ________________________________
Instrucciones:
Frente a la línea de cada cuadrante coloque un (+) si se presenta crecimiento y (-) si no hay crecimiento.
Sume el número de positivos para cada cuadrante y multiplique por 0.2. En la fila correspondiente a suma
coloque el resultado para cada cuadrante, y en la línea 5 si hay crecimiento coloque un valor de 1.
Finalmente sume los resultados y obtendrá el ICA para cada medio.
Caldo __________________________________________.
Dilución -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
Turbidez
_______________________________________________________________________________
Gas
_______________________________________________________________________________
Fluorescencia
_______________________________________________________________________________
Control (+) Control (-)
Medio __________________________________________.
Dilución -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
Crecimiento
Productividad
_______________________________________________________________________________
Selectividad
_______________________________________________________________________________
Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
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Manual Práctico de Microbiología de Alimentos
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Valor ecométrico
_______________________________________________________________________________
Control (+) Control (-)
Medio __________________________________________.
Dilución -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
Crecimiento
Productividad
Kovacs/gas______________________________________________________________________
Selectividad
Kovacs/gas______________________________________________________________________
Productividad
Colonias (+) _____________________________________________________________________
Selectividad
Colonias (-) _____________________________________________________________________
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