GUÍA N°2

Análisis microbiológico

2021- I

Laboratorio N°2: Análisis microbiológico

LABORATORIO DE BIOLOGIA Y MICROBIOLOGIA

 Biología y Microbiología 2021 – I Marzo

LABORATORIO Nº2
ANALISIS MICRIOBIOLOGICO
I. OBJETIVOS
- Aplicar la siembra por agotamiento o estrías para realizar
el análisis bacteriológico de alimentos y superficies en agar nutritivo
- Evaluar la eficacia de la lejía en la desinfección de superficies y alimentos

II. PRINCIPIOS TEÓRICOS

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y
otros componentes que suministran los compuestos necesarios para el
desarrollo de los microorganismos.
El agar Mac Conkey es un medio de cultivo sólido que permite el
aislamiento exclusivo de bacilos Gram negativos. Por esta razón es un
medio selectivo y además permite distinguir entre bacilos
fermentadores y no fermentadores de la lactosa, lo que lo hace un
medio diferencial. Es uno de los medios de cultivo más utilizado en un
laboratorio de microbiología.
Este medio se usa principalmente para el aislamiento de bacilos Gram
negativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, incluyendo
las especies oportunistas y las enteropatógenas.
COMPOSICION DEL AGAR MAC CONKEY :
Peptona de gelatina 17.0 g
Peptona de carne y caseina 3.0 g
Monohidrato de Lactosa 10.0 g
Sales biliares 1.5 g
Cloruro de Sodio 5.0 g
Rojo Neutro 0.03 g
Cristal Violeta 0.001 g
Agar 13.5 g
El medio agar MacConkey debe tener un pH final ajustado a 7,1 ± 0,2.
Para un litro de medio Mac Conkey se debe pesar 50 gr del medio
deshidratado, luego se coloca en un matraz y se disuelve en un litro de agua
destilada. Después de 10 minutos de reposo se calienta mezclando
constantemente hasta dejar hervir por 1 minuto.
Luego se coloca el matraz en la autoclave y se esteriliza a 121°C por 20
minutos. Culminado el tiempo, se saca de la autoclave y se deja enfriar hasta

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alcanzar una temperatura de 45°C, para posteriormente colocar 15 ml de este

medio en las placas de Petri estériles.

Resultados

La morfología característica de las colonias en el medio de cultivo Mac

Conkey es la siguiente:

1 E. coli Colonias de color de rosa a rojo (pueden estar

rodeadas de una zona con precipitación de bilis)
2 Enterobacter, Colonias mucoides de color rosa
Klebsiella
3 Proteus Colonias incoloras, inhibición de agrupamiento
dinámico alrededor de colonias aisladas
4 Salmonella, Shigella Colonias incoloras. Color del medio: Anaranjado
a ámbar
5 Pseudomonas Colonias irregulares, de incoloras a color rosa

Inhibición entre parcial y completa de bacterias gram positivas.

En los alimentos y superficies existen miles de bacterias, parásitos, hongos y

otra gran cantidad de agentes infecciosos que son imperceptibles para el ojo
humano. Obtener las superficies limpias y los alimentos inocuos es un
requisito obligatorio para evitar la transmisión de enfermedades e infecciones
no sólo a nuestro organismo sino a otras personas.
Es evidente que si los trabajadores no siguen prácticas de higiene adecuadas
pueden contaminar los alimentos que manejan así como ingerir o brindar
alimentos contaminados con microorganismos patógenos.
Mantener los alimentos y las superficies libres de estos peligrosos organismos
es sencillo, basta con lavarlos adecuadamente y con la concentración de lejía
u otro desinfectante en la concentración precisa. Por supuesto que también es
una medida importante lavarse las manos antes de cocinar tras usar el teclado
del ordenador, cuando nos apoyamos en el pasamanos de escaleras, al usar
el teléfono o incluso al estrechar la mano de otras personas.

Bacterias y hongos en los alimentos

En los alimentos se encuentran muchas bacterias patógenas cuya presencia
depende de la forma en la que son manipulados, envasados, conservados y
cultivados. Es decir que aquellos vegetales que son cultivados en contacto con
el suelo suelen tener una mayor cantidad de bacterias que pueden ocasionar
enfermedades gastrointestinales. La única manera de evitar infecciones es
realizar una buena desinfección de estos vegetales y una alternativa es

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lavarlos con lejía, amonio cuaternario u otro desinfectante.

Lo mismo sucede con las superficies, especialmente con aquellas que se
utilizan para cortar, picar o servir los alimentos, los cuales deben encontrarse
en buenas condiciones higiénicas para garantizar la buena calidad de los
alimentos que son tratados y con mucho mayor cuidado aquellos que son
consumidos sin cocción como las verduras u hortalizas.
Algunas de las bacterias que podemos encontrar son:
1. Salmonella: se puede encontrar en
- Los huevos crudos en primer lugar y todos los derivados en cuya
elaboración se utiliza huevo crudo, como mayonesa, clara batida o
leche con huevo.
- Aves crudas o poco cocinadas.
- Alimentos ya elaborados que se dejan a temperatura ambiente durante
varias horas.
2. E. coli :
- Carne de res cruda o poco cocinada.
- Productos frescos crudos.
- Leche cruda.
- Jugos de fruta sin pasteurizar.
- Agua contaminada o sin un adecuado tratamiento de potabilización

3. Listeria monocytogenes
- Alimentos refrigerados (se multiplica de forma rápida durante el
almacenamiento de los alimentos a una temperaturas de refrigeración).
- Alimentos listos para consumir a base de carne de res, pollo o pescado.
- Leche cruda.
- Quesos blandos.
- Verduras con un excesivo almacenamiento en origen.
- Productos en conserva o ahumados

4. Campylobacter jejuni
-Carne de pollo cruda o poco cocinada.
-Leche sin pasteurizar.
-Agua sin un adecuado tratamiento de potabilización o contaminada.
-Pescado crudo o poco cocinado.

5. Staphylococcus aureus
- Alimentos cocinados ricos en proteínas: jamón cocido, carne de
ave.
- Productos de pastelería (sobre todo los rellenos de crema).
- Productos lácteos.
- Ensaladas.

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6. Shigella
- Productos lácteos.
- Carne de res y de pollo.
- Ensaladas.
- Frutas y verduras crudas.
- Ostras crudas.
- Agua no potabilizada o contaminada

7. Yersinia enterocolítica
- Carne de res.
- Pescado.
- Marisco crudo.
- Productos lácteos.
- Productos frescos.
- Agua no potabilizada o contaminada.

BIBLIOGRAFÍA
1. Gaviño, G. Juárez, C y Figueroa H. (1995) Técnicas biológicas selectas
de laboratorio y de campo, México, Editorial Limusa
2. Jawetz, E. (1989) Microbiologia Médica. México Editorial Manual
Moderno
3. Zinsser, H. (1997) Microbiologia. Buenos Aires. Editorial Panamericana

III. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. PROCEDIMIENTO CUALITATIVO:

4.1.1. Laboratorio:
a. Preparación de medio de cultivo: El agar Mac Conkey (50 g /L.)
es disuelto en agua destilada con ayuda de calor hasta obtener
una coloración transparente.
b. Esterilización del medio de cultivo y material: El medio será
colocado en una autoclave a una temperatura de 121 °C y 15 Lb
de presión por espacio de 20 minutos. Al mismo tiempo se
colocarán en el autoclave el material a ser utilizado en la siembra
como los hisopos, agua destilada y placas Petri en donde se
realizara la siembra. Todo este material será colocado en una
bolsa de polipropileno.
c. Plaqueo: Se llevará a cabo en una cámara de flujo laminar
previamente desinfectada con luz UV y alcohol. Aquí se colocaran
aproximadamente 10 ml de medio en cada placa Petri. Cuando el
medio haya enfriado se realizará su sellado con Plástico film.
d. Conservación de los medios de cultivo: Los medios de cultivo
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ya en las placas serán colocadas en una refrigeradora hasta el

momento de utilizarlas.
e. Preparación de la cámara de siembra:
Para desinfectar la cámara de siembra se utilizará alcohol al
70% y se colocará un mechero por espacio de 10 minutos y luego
de ello se colocara el material a utilizar.
f. Hisopado de manos: Se tomará el hisopo que ha sido esterilizado,
el cual será humedecido con agua destilada estéril, luego se
realizará el hisopado de la palma de las manos sin lavar y luego
de lavadas. Para realizar la comparación de UFC.
Luego la muestra será sembrada por el método de agotamiento
en el medio de cultivo Mac Conkey. Cada muestra deberá
sembrarse en un cuarto de la placa. Para poder realizar la
comparación de número de (UFC). La muestra obtenida será
sembrada por el método de agotamiento en el medio de cultivo
Mac Conkey.
g. Hisopado de las superficies: Se tomará el hisopo que ha sido
esterilizado el mismo que será humedecido con el agua destilada
estéril y se pasará por la superficie a evaluar. Se debe medir la
misma para obtener el área y poder realizar el cálculo de UFC
(Unidades Formadoras de Colonias). En primer lugar se realizará
hisopado de la superficie sin desinfectar con lejía y luego se tomará
otra muestra luego de pasar la superficie con lejía a 200 ppm. Cada
muestra deberá sembrarse en un cuarto de la placa. Para poder
realizar la comparación de número de (UFC). La muestra obtenida
será sembrada por el método de agotamiento en el medio de
cultivo Mac Conkey.
h. Hisopado de los alimentos: Con un hisopo humedecido en agua
destilada estéril se realizará el hisopado de la superficie de los
vegetales a evaluar. Esta muestra al igual que la anterior será
sembrada en un cuarto de la placa. Y en el cuarto de placa
aledaño se realizará la siembra del hisopado del alimento
desinfectado con lejía a 200 ppm. La muestra obtenida será
sembrada por el método de agotamiento en el medio de cultivo
Mac Conkey.
i. Sellado de la placa: Terminada la siembra de toda la placa para
evitar que se contamine, se procede a realizar el sellado de la
misma con plástico film.
j.. Rotulado: Para terminar se realizará el rotulado de la placa Petri,
colocando el nombre del estudiante que sembró, el nombre del
vegetal evaluado y si fue desinfectado con lejía o no y la fecha.
k. Incubación: Las placas serán colocadas en un sobre de papel con
los datos señalados en el punto anterior e incubadas a 37°C por
48 horas o más si es necesario.

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4.2. Materiales, equipos y reactivos

i. Materiales de laboratorio:
- Vaso de precipitados de 1000 ml (4)
- Mecheros de alcohol (6)
- Hisopos
- Papel toalla
- Pipetas 10 ml (2)
- Pizeta
- Agua destilada
- Asa de Khole
- Probeta de 1000 ml y 100 ml
- Alcohol para mecheros
- Plastic film
- Papel Aluminio
- Matraz de Kitasato 500 ml
- Medio de cultivo Mac Konkey
- Bolsas de polipropileno
- Placas Petri
- Papel craft o papel periódico A4
- Pabilo
- Plumón indeleble

- Material biológico
- Fruta
- Gaseosas
- Agua de bebida
- Jaboncillos

ii. Equipos
- Cocinilla eléctrica
- Phmetro

iii. Reactivos
- Alcohol de 96%
- Lejía Clorox (250 ml)

4.3. PROCEDIMIENTO CUANTITATIVO:

Transcurridas las 48 horas se procederá a la lectura de la placa. Para ello
se realizará el conteo de la Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en
cada cuarto de la placa Petri con la finalidad de realizar la comparación entre
el número de colonias presentes sin desinfectar y luego de desinfectar tanto
los vegetales como las superficies con lejía.

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Limites permisibles para superficies vivas

SUPERFICIES
ENSAYO
VIVAS
Coliformes <100 ufc / manos(*)
Staphylococcus aureus <100 ufc / manos(*)
Salmonella sp. Ausencia / manos

Límites permisibles para superficies inertes regulares

ENSAYO SUPERFICIES INERTES

Coliformes <1 ufc / cm2 (*)
Salmonella sp. Ausencia / 100 cm2

Límites permisibles para superficies inertes irregulares

ENSAYO SUPERFICIES INERTES

Coliformes <100 ufc / utensilio (*)
Salmonella sp. Ausencia / utensilio(s)

5. PROCEDIMIENTO DE MANEJO DE RESIDUOS

Una vez culminada la práctica de laboratorio, con ayuda del docente se
procederá a la identificación y segregación de los residuos generados
(ejemplo: residuos químicos y/o residuos sólidos) para su manejo, según se
detalla a continuación:

A. Residuos químicos:
1. Verter el residuo líquido que contiene el matraz en el sistema armado que
se encuentra dentro de la campana extractora o en la mesa indicada por el
docente.
2. Agregar agua destilada al matraz, repetir el procedimiento N°01.
Nota: Usar guantes de seguridad durante este procedimiento. Usar la
menor cantidad de agua posible.
1.Doblar y colocar el papel filtro impregnado con el residuo sólido en el
recipiente indicado por el docente.

Nota: Usar guantes de seguridad durante este procedimiento.

B. Residuos Sólidos:

Según las indicaciones del docente se realizará la segregación de los residuos

sólidos en los tachos correspondientes para su recolección.

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Importante: El asistente de laboratorio responsable del ambiente, procederá a recoger el

residuo químico segregado y/o tratados para luego envasarlo, rotularlo y almacenarlo
temporalmente hasta su disposición final.

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REPORTE DE LABORATORIO: BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 02:

PROFESOR: Biol. Brenda Gamarra Cornejo.

FECHA: 16/05/2021
HORARIO: 07:00 – 8:15 a.m.

INTEGRANTES:
Apellidos y Nombres
1 Arias Gutiérrez Felipe Félix

I. PROCEDIMIENTO CUALITATIVO
Se realizará la observación de las colonias presentes y para su evaluación se tomará en
cuenta el color y su morfología. Para esta última característica comparar con el cuadro
adjunto.

Superficie Lisa Rugosa

Consistencia Seca Cremosa

Luz reflejada Mate Brillante

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II. PROCEDIMIENTO CUANTITATIVO

a. Se realizará el conteo de las UFC en cada cuarto de la placa Petri con la
finalidad de realizar la comparación entre el número de colonias presentes
en el hisopado de manos.
b. Se presentarán cuadros resumen de todas las placas sembradas por el
grupo tomando en cuenta el número UFC y características de las colonias
sin desinfección y luego de desinfectar los vegetales, hisopado de manos
e hisopado de superficies anotando los resultados. Asimismo se tomarán
las fotos respectivas de cada placa Petri y rotularlas. Colocar los datos
mencionados en el siguiente cuadro.

CUESTIONARIO
1. Que medios de cultivo existen para evaluar bacterias coliformes?

Suero esterilizado (Lavado de Manos), MacConkey y Humus.

2. Cuál es la concentración adecuada de lejía y Amonio cuaternario para

desinfectar superficies y por qué?

Para lejía la concentración debe ser de 20 ml (4,8 a 5%) para la

desinfección de superficies.

Para el caso de amonio cuaternario se debe tener una concentración

de 20 ml por litro de agua, para obtener una concentración adecuada
de desinfección.

3. Realice un flujograma indicando la metodología empleada para la

determinación de bacterias Coliformes en superficies inertes (mesa),
dibuje o coloque fotos

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4. Que es una autoclave y en que se basa el principio de esterilización de

la misma?

Un autoclave es un recipiente de presión metálico de estructura

gruesa, compuesta por dos canastillas y cierre hermético, su
funcionamiento se da a alta presión para realizar cocciones o
esterilizaciones de utensilios y materiales, a través del mecanismo de
vapor de agua

5. En el siguiente cuadro Indicar las características de 4 colonias

mostradas en la siguiente placa:

CUADRO N°1
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

Bacterias
Características 1 2 3 4

UFC <100 <10 <1 <100

Color Piel Amarillo Rojo Transparente
Forma Irregular Circular Puntiforme Filamentosa
Margen o borde Ondulado Entero Entero Filamentoso
Elevación Umbonada Pulvinada Pulvinada Umbonada
Superficie Rugosa Lisa Lisa Rugosa

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DEFINICIÓN DE pH
El pH es una medida de acidez o alcalinidad de una sustancia. El pH
indica la concentración de iones de Hidrógeno presentes en determinadas
disoluciones. La sigla significa potencial de Hidrogeniones.

CUADRO Nº 10
MEDICIONES DE pH

Sustancia pH
evaluada
1 Cal 11.7
2 Ceniza 10.5
3 Sangre 7.3 – 7.4
4 Gaseosa 2.4
5 Humus 7.5
6 Vinagre 2.7
7 Jabón de ropa 10
8 Jaboncillo de 9.9 - 10
tocador
9 Saliva 5.6
10 Agua destilada 5.8

III. CONCLUSIONES:

1. Los medios de cultivo son indispensables para determinar la carga bacteriana

de cualquier superficie inerte o viva.

2. El uso de lejía es útil para desinfectar superficies a nivel de concentración de

0.1% y alimentos a 500 bpm.

3. El uso de alcohol a una concentración de 70% es útil para la desinfección de

manos, esencial para esta época del COVID-19.

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IV. CUESTIONARIO
1. ¿Qué sustancias químicas existen para la desinfección de alimentos o
superficies?
• Detergentes.
• Desinfectantes.
• Hipocloritos.
• Ácido peracético
• Compuestos de Amonio cuaternario
2. Se tiene un alcohol al 96% y se desea preparar 3500 ml de una solución
de alcohol al 70%. ¿Cuánto de alcohol al 96% se requiere para preparar
dicha solución?

𝑪𝒊 ∗ 𝑽𝒊 = 𝑪𝒇 ∗ 𝑽𝒇
𝟗𝟔 ∗ 𝑽𝒊 = 70 ∗ 3500𝑚𝑙
245000
𝑽𝒊 =
96
𝑽𝒊 = 𝟐𝟓𝟓𝟐 𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝑨𝒍𝒄𝒐𝒉𝒐𝒍 𝟗𝟔%

3. Se desea preparar 6.5 Lt de una solución de lejía al 0.1% para desinfectar

una superficie en la cocina ¿Cuánto de lejía se requiere si la
concentración de la misma es de 40000 ppm? Y cuánto de esta solución
se debe preparar si se requiere desinfectar un área de 165 m2, si el gasto
por m2 es de 130 ml?

6500 ∗ 4000
𝑽𝒊 =
0.1% ∗ 10

𝑽𝒊 = 26000 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝐿𝑒𝑗í𝑎

26000 ∗ 100
𝑽𝒊 =
21450
𝑽𝒊 = 𝟏𝟐𝟏% 𝑺𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏

4. ¿Cómo se debe almacenar la lejía para que conserve su propiedad

desinfectante y cuál es la concentración recomendada para desinfectar
alimentos, utensilios, superficies (pisos, techos y paredes), áreas
contaminadas con sangre, vómito, heces u otras fuentes de materia
orgánica?
Debe almacenarse en lugares cerrados (no herméticamente) limpio y con

LABORATORIO N° 2: Aná lisis Microbiológico PÁGINA 15

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buena ventilación, no exponer a temperaturas elevadas, luz solar, junto a

sustancias reductores y metales, además de que cualquier recipiente que haya
contenido este producto deberá ser lavado cuidadosamente.
5. ¿A qué se denominan bacterias coliformes y donde se les encuentra?

Son aquellas bacterias relacionadas al suelo, humedad y el tracto intestinal

animal, estas se utilizan como indicador de condición higiénica para la
producción de alimentos y bebidas. Estas se encuentran en el intestino
humano y animal, también son encontradas en suelos, semillas y vegetales.

6. ¿Qué es una ETA y que es una ETS mencionar 5 ejemplos?

Las Enfermedades de Transmisión alimentaria (ETA), Son enfermedades de

carácter infeccioso o tóxico causadas por el consumo de alimentos o de agua
contaminada. Ejemplos: Salmonella, Listeria, Triquinela, Clostridia y toxina
botulínica.

Las Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) son enfermedades causadas

por bacterias, parásitos y virus. Ejemplos: clamidia, gonorrea, papiloma
humano, sífilis y Sida (VIH).

7. Que es el amonio cuaternario, cuál es su fórmula química y para que se

usa?
El amonio cuaternario (NH3), es un producto químico derivado del amoniaco,
su uso es común en la industria alimenticia como desinfectante que actúa
sobre bacterias, hongos, esporas y levaduras, es un desinfectante efectivo
para alimentos y superficies.

8. A que se denominan Dioxinas y cuándo y dónde se forman?

Las Dioxinas son compuestos producidos a partir de la combustión del cloro ,

estas se encuentran en el medio ambiente por todo el mundo y debido a su
persistencia se van acumulando a lo largo de la cadena alimentaria,
principalmente en el tejido adiposo de los animales por su solubilidad en las
grasas.
Los productos de origen animal son los mayores contribuyentes a la ingesta
de dioxinas por los humanos.

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9. Cuáles son los Límites Máximos Permisibles (LMP) de Coliformes en

alimentos y superficies? ¿Puede haber presencia de E. coli en alimentos
y su presencia que nos indicaría?

El límite máximo permisible en alimentos es igual a 150,000 UFC para frutas y

vegetales crudos, además de carnes blancas y rojas, mientras que el límite de
superficies es igual a < 1 UFC en superficies inertes y < 100 UFC en
superficies vivas.

Si, aunque la mayoría de las cepas de E. coli son inocuas, pero algunas
pueden causar graves intoxicaciones alimentarias, su presencia es parte
determinante para la insalubridad de procesamiento de alimentos o falta de
limpieza.
10. Porque el Virus “muere” cuando nos lavamos las manos con jabón o nos
aplicamos alcohol?
El lavado con agua y jabón en las manos son importantes para este proceso
porque la combinación crea más burbujas de jabón, que interrumpen los
enlaces químicos que permiten que las bacterias, virus y otros gérmenes se
adhieran a las superficies, cuando nos enjuagamos los gérmenes son
lastimados por las moléculas de jabón, siendo eliminadas.

El efecto que produce el alcohol es importante, matando gérmenes,

necesitando un 60%, actuando eficientemente al ponerlo sobre palma de la
mano y limpiando rápidamente, al igual que la capacidad del agua y el jabón
para atrapar y eliminar los microorganismos.

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HOJA DE CÁLCULOS
Presentar en esta hoja los cálculos realizados para la preparación de la solución de
alcohol y lejía.

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