Vitamina B12

La estructura química del compuesto activo de la vitamina B12 es compleja, la más famosa e
importante es la cianocobalamina. La vitamina B12 solo se encuentra en materiales de origen
animal y metabolitos microbianos. Las fuentes importantes de vitamina B12 son el hígado, los
riñones y la yema de huevo.

Fórmula y propiedades
Fórmula empírica

Vitamina B12: C63H88O14N14PCo

(P.M.  1355,4).

Descripción

Polvo cristalino rojo oscuro.

Punto de fusión

210-220°C carbonización.

Espectro de absorción

La solución acuosa muestra una absorción máxima a 278, 361 y 550 nm.

Estabilidad..

La cianocobalamina cristalina y sus soluciones neutras o débilmente ácidas son relativamente

estables al aire y al calor, pero son atacadas por la luz y la radiación ultravioleta. La vitamina B12
es solo ligeramente estable a los álcalis, ácidos fuertes y agentes reductores.

Método34

El contenido de vitamina B12 en los alimentos es muy bajo y los métodos microbiológicos son la
única forma de estimar la vitamina B12 de manera satisfactoria.

Extracción

La vitamina B12 es extraída de la muestra con agua o buffer a una temperatura de

aproximadamente 100°C durante 10-30 minutos con la adición de cianuro de potasio. El pH
del extracto se ajusta a 6 ya sea con hidróxido de potasio o ácido clorhídrico. Diluir el extracto
con agua para obtener una concentración de aproximadamente 2 mg / ml.

Microorganismos de ensayo y  método

El microorganismo de prueba Lactobacillus reesei (ATCC 7830) se mantiene en agar de cultivo

de microensayo (Difco Laboratories, Detroit USA; n ° 031902). Los subcultivos se preparan
incubando en un medio de fermentación que contiene B12 (caldo de microinoculación (Difco No.
0320-02) a 37 ° C durante 16-18 horas. Para ello se utiliza el medio Difco No. 0457-15. medio de
cultivo (10 ml), añadir 25, 50 y 100 μl de extracto o solución estándar. 6 tubos de ensayo en
blanco no contienen aditivos. Los tubos de ensayo se bañan con vapor a 100 ° C durante 10
minutos o en autoclave a 121 ° C durante 5 minutos. Enfriar A continuación, todos los tubos,
excepto los 2 blancos, se inocularon con 1 gota de inóculo y luego se incubaron a 37 ° C durante
16-18 horas.

Medición de la turbidez

La turbidez de la suspensión celular se midió a 580 nm después de una mezcla completa. Debe
utilizar una curva de calibración para el cálculo y corregir el valor en blanco.
Resumen

 El análisis de la vitamina B12 se realiza mediante métodos microbiológicos

 Prueba de Lactobacillus leichmaniison más utilizada

Folatos
La estructura del compuesto de ácido fólico activo siempre contiene una o
más moléculas de glutamato necesarias para la actividad biológica. El
ácido fólico se encuentra principalmente en forma conjugada en la
naturaleza y se encuentra en el hígado, los riñones, los músculos, la
leche, el queso, las verduras de hoja oscura, la coliflor, las legumbres
y el germen de trigo.
Fórmula y propiedades

Fórmula empírica

Ácido fólico: C19H19O6N7

(P.M. 441,4).

Descripción

Polvo cristalino amarillo a naranja amarillento.

Punto de fusión

A 250°C se oscurece seguido por carbonización.

Rotación específica

[] 20-D = + 20o (c=0,5 en NaOH 0,1N).

Espectro de absorción

El ácido fólico tiene un espectro de absorción característico que depende

del pH de la solución. A 0,1 N NaOH, los picos están a 256, 283 y 365
nm.

Estabilidad

El ácido fólico cristalino es completamente estable al aire y al calor, pero

es degradado por la luz y los rayos ultravioleta. La solución neutra es
relativamente estable. Los ácidos, álcalis, oxidantes y agentes
reductores tienen efectos destructivos.
Método

La cantidad total de ácido fólico en los alimentos es muy baja (por

ejemplo, 6 g / 100 g en la leche) y las pruebas microbiológicas son la
única forma de estimar correctamente la actividad del ácido fólico. El
ácido fólico contiene varias unidades de ácido glutámico, por lo que el
extracto de la muestra debe tratarse con una reductasa. El uso de un
organismo de prueba resistente al cloranfenicol facilita la prueba porque
no es necesario preparar muestras o manipular el organismo de
prueba en condiciones estériles.

Extracción y de conjugación

El material (equivalente a aproximadamente 1 μg de ácido fólico) se mezcla bien con buffer
fosfato pH 6,1 y se auto clava durante 5 minutos a 121°C. Después de enfriar, se agrega una
solución de páncreas de pollo y se incuba durante 18 horasa37°C.

La enzima es desactivada ebulliendo la solución durante 5 minutos. Después de enfriar, la

solución es diluida a un volumen definido con una solución de ácido ascórbico 2% y filtrada.
El contenido estimado de ácido fólico en el extracto de muestra debe ser
de aproximadamente 0,2 - 0,4 ng / 100 ul.

Microorganismo de ensayo y método

Se suspendieron cultivos liofilizados del organismo de ensayo

Lacticaseibacillus casei (NCIB 10 63) en un tubo de vidrio que contenía
medio (medio de ácido fólico L. casei Difco nº 0822 159) y ácido fólico y
se incubaron a 37ºC durante 20 horas. (Cultura I).
Transfiera una gota de este cultivo muy turbio a un tubo nuevo que
contenga 5,0 ml de medio de prueba y ácido fólico. Incubar este tubo
nuevamente a 37 ° C durante 20 h (cultivo II). El medio de prueba que
contenía 20 mg de cloranfenicol / litro se inoculó con 2 ml de Inoculum II.

Llene estos tubos con medio (ml) y agregue 25, 50, 100 µl de extracto o
solución estándar. Los 6 tubos blancos no contienen aditivos. Estos
tubos se incubaron a 42 C durante 23 horas.

Medición de la turbidez

La turbidez de la suspensión de células se midió a 660 nm después de

una mezcla completa. Se utiliza una curva de calibración en el cálculo y
el valor en blanco debe ser correcto.

Resumen

 El ensayo de la actividad del folato natural necesita de un tratamiento con

deconjugasa.
 La determinación se realiza mejor a través de un método microbiológico.
 Usar el caso de lactobacilos resistentes al cloranfenicol como
organismo de prueba facilita enormemente la prueba.
Acido pantoténico

El ácido pantoténico libre es un aceite higroscópico muy inestable. Por lo

tanto, no se recomienda para uso práctico y se usa principalmente en
forma de sales de calcio y sodio.

En la naturaleza el ácido pantoténico se encuentra raramente al estado libre; sin embargo, está
ampliamente distribuido como un componente de la coenzima A y se encuentra sobre todo en
el hígado, riñón, músculo, cerebro y yema de huevo, así como también en la levadura,
cereales, y plantas verdes, especialmente leguminosas.
El ácido pantoténico es ópticamente activo; sólo las formas dextro-rotatorias (D-
pantotenatos) tienen actividad de vitamina.

Fórmulas y propiedades

Fórmula empírica

Ácido pantoténico
Sal de calcio (C9H16O5N)2Ca
(P.M. 476,5)

Sal de sodio C9H16O5NNa (P.M. 241,2).

Descripción

Polvo blanco.

Punto de fusión

Sal de calcio: 200°C (descomposición)

Sal de sodio: 160-165°C

Rotación específica

Sal de calcio:[] 20-D = + 26° a + 28°

(c=4 en agua)
Sal de sodio: [] 20-D = + 26,5° a + 28,5°
(c=4 en agua).

Estabilidad

Cuando se almacenan en el refrigerador y se protegen de la humedad,

el Dpantotenato cálcico y el Dpantotenato sódico son aparentemente
estables al oxígeno atmosférico y a la luz. Los compuestos,
especialmente las sales de sodio, son higroscópicos. Las soluciones
acuosas son inestables al calor y se hidrolizan, especialmente en
condiciones alcalinas o ácidas.

Método
El ácido pantoténico en mezclas complejas solo se puede medir
mediante métodos microbiológicos. El ácido pantoténico estará
disponible pronto. No existe un procedimiento realmente estándar para esto, de tal
modo que el método difiere de un caso a otro, por ejemplo, la extracción con agua o con
diferentes mezclas de solventes con o sin tratamiento enzimático (papaína, diastasa, extracto
de hígado, etc.)35. El método descrito más adelante intenta medir principalmente los
pantotenatos suplementados en los alimentos.

Extracción

El material es agitado con agua durante 30 minutos a 37°C en un agitador. Si el material

contiene una gran cantidad de grasa, es necesario eliminar la grasa.
Esto se hace, por ejemplo, agregando 20 ml de acetato de etilo al agua.
La capa de agua se utiliza para el siguiente proceso. El extracto acuoso
se diluye con agua hasta un volumen específico y se filtra. La leche en
polvo y materiales similares son extraídos auto clavando la suspensión acuosa a 100°C por 30
min. Después de enfriar, el pH se ajustó a 4 , 5 con ácido sulfúrico, se
diluyó hasta la cantidad especificada con agua y se filtró. El pH de la
solución filtrada se ajusta a 6,8 con hidróxido de sodio y se ajusta a un volumen definido.
Esta solución es utilizada para el ensayo micro-biológico.

Microorganismo de ensayo y método

El organismo Lactobacillus plantarum (ATCC 801 ) en estudio se cultivó

en microcultivos Bacto estériles (Difco Detroit USA Laboratories; n.
032002) a 37 ° C durante 2 horas. Los primeros 0,1 ml de material de
inóculo. Este es el material de inoculación para la prueba (cultivo 2).
Estos tubos se utilizan para el medio de prueba (Difco; medio de prueba
de ácido pantoténico No. 060 15), agregue un volumen igual de agua (5
ml cada uno) y agregue 250, 500 y 1000 litros de extracto o solución
estándar.

Los tubos utilizados como blancos no contienen aditivos. Tape el tubo y

esterilice a 118 ° C durante 10 min. Después de inocular 100 µl de
solución de cultivo 2, incubar los tubos a 37 ° C durante 19 h. Luego, los
tubos son sometidos a un baño de vapor durante 5 minutos a 100°C para detener el
crecimiento.

Medición de la turbidez

La turbidez de la suspensión celular se mide a 660 mn después de mezclar bien. Para el

cálculo se utiliza una curva estándar y se debe corregir el blanco.

Resumen

 La determinación de D-pantotenato suplementado en los alimentos se realiza mejor

por un método microbiológico.
 El microorganismo de ensayo es Lactobacillus plantarum

Biotina

La biotina se encuentra parcialmente libre en verduras, frutas, leche y

salvado de arroz y parcialmente unida a proteínas en tejidos animales,
semillas de plantas y levadura. Las fuentes importantes de biotina son el
hígado, los riñones, la carne, la levadura, las yemas de huevo, la leche,
los champiñones y las verduras.
Fórmula y propiedades

Fórmula empírica 

Biotina C10H16O3N2S
(P.M. 244,3).

Descripción

Polvo cristalino blanco.

Punto de fusión

228-232°C (descomposición).

Rotación específica

[] 20-D = + 90 a + 94° (c=l,0 en

NaOH 0,1N).
Estabilidad

La dobiotina seca en forma cristalina transparente

es resistente al aire, la luz solar y el calor. Es destruido gradualmente
por la luz ultravioleta. La solución acuosa es relativamente estable en
condiciones débilmente alcalinas o débilmente ácidas. En soluciones
fuertemente ácidas o alcalinas, el calentamiento pierde parcialmente su
actividad biológica.
Método

El método microbiológico es el mejor método para la biotina. El organismo

de prueba más utilizado es Lactobacillus plantarum. La biotina debe
extraerse de la muestra antes de realizar la prueba. Esto se logra
mediante una combinación de hidrólisis ácida seguida de degradación
enzimática.
Extracción y  digestión enzimática

El material de ensayo es calentado en ácido sulfúrico 1M durante 30 minutos a 118°C. El

extracto es luego neutralizado a un pH de 7,5 con hidróxido de sodio 20% y diluido a un
volumen definido con agua. La porción (510 ml), que debería contener 530 ng
de biotina (0,10,6 ng / ml), se diluyó con solución de papaína (10 mg / ml)
hasta un volumen de 50 ml y se dejó durante la noche a 37 ° C (aprox.
18 h Tiempo)

. La enzima es desactivada auto clavando durante 10 minutos a 118°C. Luego el extracto es

centrifugado, filtrado y se utiliza la solución transparente para el ensayo microbiológico. La
papaína utilizada en el ensayo debe comprobarse primero (los
compuestos que interfieren dan lugar a valores de blanco elevados).

Microorganismos de ensayo y  método

El organismo de prueba Lactobacillus plantarum (ATCC 801 ) se cultivó

en medio de cultivo BactoMicro estéril (Difco Detroit Laboratories USA;
No. 032002) a 37 ° C durante 2 h. La segunda inoculación se realizó
con 6 ml de medio y 0,1 ml del primer cultivo. Este es el inóculo para la
prueba (cultivo 2). Los tubos son llenados con el caldo de ensayo (Difco; medio de
ensayo Bactobiotin no. 419-15), se agregan volúmenes iguales de agua (5 ml a cada uno) y
250, 500 y 1000 μ del extracto o de la solución estándar. Los tubos utilizados como
blancos no contienen aditivos. Tape el tubo y esterilice a 118 ° C durante
10 min. Después de la inoculación de 100 cultivos 2, incubar los tubos
a 37 ° C durante 19 h. Luego, los tubos son sometidos a un baño de vapor 100°C
durante 5 minutos a para detener el crecimiento.

Medición de la turbidez

La turbidez de la suspensión celular se midió 660 mn después de una

buena mezcla. Debe utilizar la curva de calibración para calcular y
corregir
Resumen
 La medición de Dbiotin se realizó mediante métodos microbiológicos.
 Microorganismos considerados Lactobacillus plantarum.
 La liberación de biotina unida se logra mejor mediante hidrólisis ácida
seguida de degradación enzimática con papaína.

Acido nicotínico y nicotínamida (niacina)

El ácido nicotínico y la nicotinamida tienen la misma actividad vitamínica.

Los ácidos libres se convierten en amidas en el cuerpo. Los sinónimos
menos utilizados, como Vitamina PP y Factor PP, se refieren a un
efecto protector contra la pelagra. La nicotinamida se encuentra en todas
las células y comúnmente se encuentra en forma unida como un grupo
de extremidades protésicas. El hígado y la carne de los ungulados son
fuentes nutricionalmente importantes de esta vitamina. También existe en
el maíz y otros granos en una forma no utilizada por los humanos.
Fórmula y propiedades

Fórmula empírica

Acido nicotínico C6H5O2N

(P.M. 123,1)

Nicotinamida C6H6ON2
(P.M. 122,1).

Descripción
 Polvos cristalinos blancos.

Punto de fusión

Acido nicotínico: 234-237°C

(sublimación)

Nicotinamida: 128-131°C.

Espectro de absorción

El ácido y la amida muestran espectros de absorción similares en soluciones acuosas con un

máximo a 261 nm con una extinción dependiente del pH.

Estabilidad

Ambos compuestos son estables al oxígeno atmosférico, la luz y el calor

en soluciones secas y acuosas. Las amidas son hidrolizadas por
ácidos calentando en una solución fuertemente ácida o alcalina.
Método

La extracción de niacina se realiza mediante hidrólisis ácida (la hidrólisis alcalina liberaría
también nicoti-niléster ligado, el cual no es biodisponible). El ensayo microbio-lógico es fácil
de realizar. El microorganismo de ensayo más comúnmente utilizado
es Lactobacillus plantarum37. El análisis colorimétrico basado en la reacción
de Konigs utiliza bromuro de cianógeno para la oxidación y procaína
(paminobenzoildietilaminoetanol) para formar los componentes
colorantes enumerados.

Extracción y digestión enzimática

El material conteniendo aproximadamente 300 μg de niacina es hidrolizado en 125 ml de

ácido sulfúrico 0,1 M durante 15 minutos a 110°C. Después de enfriar, el pH se ajusta a 4,5
utilizando acetato de sodio, se agregan 500 mg de Takadiastasa y la mezcla es incubada
durante 20 minutos a 45°C. Acidificar la solución con 25 ml de ácido sulfúrico al
30%, diluir con agua a 250 ml y filtrar. Se acidificaron 50 ml del filtrado
con 1 ml de ácido sulfúrico al 30% y se añadieron gota a gota una
solución de permanganato de potasio al 3% (26 ml) (26 ml) hasta que
quedó un color rosa. El exceso de permanganato es destruido por la adición de una
solución de peróxido de hidrógeno 3% hasta que desaparezca el color rosado. Se suspende 1
g de sílice tratada (tierra de diatomeas) con 25 ml de la solución oxidada, se agita
vigorosamente durante 1 minuto, se centrifuga y se deja decantar. El niacina absorbido en la
sílice tratada es lavado con 25 ml de ácido sulfúrico 0,1 M, se centrifuga y se deja decantar.
Se agregan 25 ml de hidróxido de potasio 0,5 M, se agita durante 1 minuto y se centrifuga. Se
colocan 20 ml del sobrenadante en un vaso precipitado, se cubre con un vidrio de reloj y se
calienta durante 10 minutos en una autoclave a 110 ° C para hidrolizar la nicotinamida a
ácido nicotínico. La solución enfriada se ajusta a un pH de 4,5 con ácido clorhídrico (0,1 M),
se transfiere a un matraz volumétrico de 50 ml y se agregan 3 ml de una solución de bromuro
de cianógeno 3% y se ajusta a volumen con agua.

Precaución: no inhalar el vapor de esta solución. Tomar todas las precauciones necesarias
para trabajar con compuestos tóxicos.

Colocar el matraz en un baño de agua a 7585 ° C durante 10 minutos y

dejar enfriar a temperatura ambiente. Pipetee 10 ml de solución en la
cubeta del fotómetro y agregue 1 ml de ácido clorhídrico 1 M para ajustar
el espectrómetro a absorbancia cero. Se agrega 1 ml de una solución de procaína
5% (5 g en 100 ml de HC1 1M), se mezcla y se mide la absorción dentro de 15-20 segundos a
420 nm.En una serie paralela, la muestra es "spiked" con aproximadamente la misma
cantidad de ácido nicotínico (300 μg) como estándar interno.

Cálculos

Donde:

A: absorbancia de la muestra
Z: absorbancia de la muestra + estándar interno
N: cantidad de ácido nicotínico como estándar interno en μg
W: peso de la muestra en g

Resumen

 La determinación del niacina se realiza mejor por un método microbiológico

 El microorganismo de ensayo es Lactobacillus plantarum
  Las pruebas que utilizan la reacción de Königs son pesadas,
requieren mucha experiencia y tienen graves limitaciones
de reactivos. Sin embargo, obtendrá resultados buenos y
reproducibles.

Vitamina C

El ácido ascórbico se encuentra en todos los tejidos vivos como un

importante compuesto redox en el metabolismo celular. Las fuentes
importantes de vitamina C son las frutas frescas (cítricos, grosellas
negras, escaramujos, pimientos rojos) y verduras (repollo, patatas,
lechuga, tomates, etc.).

Fórmula y propiedades

Fórmula empírica

Acido ascórbico C6H8O6

(P.M. 176,1)

Ascorbato de sodio C6H7O6Na

(P.M. 198,1).

Descripción

Acido ascórbico: Polvo cristalino blanco

Ascorbato de sodio: Polvo cristalino con tinte amarillo.

Punto de fusión

Acido ascórbico 190°C (descomposición)

Ascorbato de sodio

Descomposición sin un punto de fusión definido a los 220°C.

Espectro de absorción
Bajo luz ultravioleta, el ácido ascórbico en soluciones ácidas fuertes
mostró una absorción máxima a aproximadamente 1 ° C.Cambia a pH
neutro a 2 5 nm y 265 nm, y cambia a aproximadamente 300 nm a pH 14

Rotación específica

Acido ascórbico: [] 20-D = -22° a -23° (c=2,0 en agua)

Ascorbato de sodio: [] 20-D = + 103° a 106° (c=5,0 en agua).

Estabilidad

El ácido ascórbico cristalino es relativamente estable en el aire en

ausencia de humedad, pero las sales de sodio tienden a volverse
amarillas. Las soluciones acuosas son atacadas por el oxígeno
atmosférico y otros oxidantes. El primer ácido formado, el ácido
deshidroascórbico, se oxida entonces de forma irreversible. Los iones
alcalinos y de metales pesados (como el cobre) actúan como
catalizadores.

Métodos

El ácido ascórbico (AA) se oxida fácilmente a ácido deshidroascórbico

(ADA), por lo que se requiere una selección cuidadosa de las
condiciones de extracción para minimizar las pérdidas que pueden ocurrir
durante el paso de pretratamiento de la muestra. Las soluciones de
extracto más utilizadas son las soluciones de ácido oxálico potencial,
ácido acético y sus mezclas. Se puede agregar EDTA a agentes
reductores como complejos de iones metálicos y ditiotreitol (DTT) en
una variedad de procesos.

Básicamente existen dos enfoques diferentes para la determinación del ácido ascórbico:

 La determinación del ácido ascórbico presente en la muestra

o en el extracto de muestra ignorando alguna presencia
posible de ADA.
 La determinación del ácido ascórbico "total" que incluye la
 suma de AA y ADA utilizando un método que transforma
ya sea AA a ADA o ADA a AA con la consiguiente
cuantificación de ADAoAA.
Todos los métodos que utilizan la propiedad reductora de la molécula de
ácido ascórbico se incluyen en la primera categoría. Aunque hay muchos
reactivos, el 2,6-diclorofenolindofenol (DCFI) es sin duda el más
utilizado porque es fácil de usar y los resultados son generalmente
fiables. DCFI es azul oscuro, pero cuando se reduce de AA se vuelve
incoloro. Por lo tanto, es fácil valorar una cantidad fija de extracto de
muestra hasta que permanezca el color rosa y comparar la cantidad de
reactivo utilizado con la cantidad de solución estándar de AA a
concentraciones conocidas. En algunos casos, es posible que el
cambio de color no se note porque el extracto contiene otros
ingredientes colorantes. En estos casos, el punto final de la titulación puede
visualizarse midiendo el cambio de potencial en la solución con un electrodo de platino-
plata/cloruro de plata (Pt-Ag/AgCl)38.

Uno de los métodos más específicos de este último tipo fue desarrollado
por Deutsch y Weeks39 y por la ADA después de oxidar todos los AA
utilizando otro oxidante, como oxígeno o yodo ligado al carbono. El ADA
formado es luego derivatizado con o-fenilendiamina para formar un derivado fuertemente
fluorescente, el que puede cuantificarse fácilmente por la comparación con soluciones
estándares. El método es un procedimiento AOAC de acción final

En los últimos años, varios investigadores han publicado procedimientos

para la separación y cuantificación de AA y / o ADA por HPLC. El
siguiente procedimiento de ensayo permite la determinación simultánea de AA y ácido
eritórbico y se ha utilizado para determinar AA en carne, productos cárnicos, alimentos
procesados, alimentos enriquecidos, verduras, frutas, leche y bebidas.

Extracción

El material (15 g) se extrajo con 2550 ml de ácido metofórico al 0,5% que

contenía ditiotreitol (DTT) al 0,2% usando un homogeneizador o mediante
agitación. Después de la centrifugación, el extracto se diluyó con tampón
de acetato de pH ,8 que contenía DTT al 0,2%, se filtró a través de un
filtro de 0, 5 µm y se inyectó en HPLC.
La Tabla 22 muestra las condiciones de HPLC.

Resumen

 Esta medición de ácido ascórbico se puede realizar fácilmente

mediante titulación DCFI, pero solo se mide AA y, en algunos
casos, se puede superar el ruido.
 El método Deutsch y Weeks con derivados de quinolina
fluorescentes suplementados con etilendiamina proporciona un
medio válido para medir la vitamina C "total".
 Si se protege el ácido ascórbico "total", la HPLC puede
proporcionar una alternativa confiable, asumiendo que el ADA se
reduce a AA mediante la extracción de límites adecuada antes de
la cuantificación por HPLC.