PROTEÍNAS TOTALES EN ALIMENTOS

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OBJETIVO
● Realizar la determinación de proteínas en muestras de alimentos por medio
de un método para determinar nitrógeno orgánico, convirtiéndolos con un
factor a proteínas presentes en el alimento, analizando las bondades del
método y su aplicación en la práctica.
● Conocer el fundamento de las distintas etapas del método Kjeldahl
● Conocer las diferencias y aplicaciones de los métodos para determinación de
proteínas en alimentos.

JUSTIFICACIÓN Y NORMAS
El método planteado por Kjeldahl considera tres etapas fundamentales:
1. Digestión
Se emplea ácido sulfúrico concentrado y sulfato de cobre como catalizador que con ayuda
de calor y sulfato de potasio oxidan la materia orgánica hasta CO2 y agua, y transforman
todo el nitrógeno amínico (NH2) e imínico (NH=NH) provenientes de proteínas y
aminoácidos en ión amonio (NH4+).
Cuando la digestión termina, la solución queda transparente, libre de partículas
carbonosas. En el caso de haber empleado como catalizador el sulfato de cobre,la solución
toma un color azul verdoso.

2. Destilación
En la muestra digerida se trata con un álcali (NaOH 40% m-V) añadido en exceso,el cual
reacciona descomponiendo el sulfato de amonio en amoníaco, que es volátil y se
destila por arrastre con vapor. La reacción que tiene lugar es la siguiente:
(𝑁𝐻4)2𝑆𝑂4 + 2 𝑁𝑎𝑂𝐻 ↔ 2 𝑁𝐻3(𝑔) + 𝑁𝑎2𝑆𝑂4 + 2 𝐻2𝑂
(Bromocresol verde-rojo de metilo) y solución alcohólica de ácido bórico.
La reacción que ocurre es:
𝐻3𝐵𝑂3 + 𝑁𝐻3(𝑔) ↔ 𝑁𝐻4++ 𝐵𝑂2− + 𝐻2𝑂

3. Valoración
El borato de amonio formado se valora entonces utilizando como patrón valorante una
solución estandarizada de ácido clorhídrico, según: BO2- + H+ + H2O H3BO3 El punto final
de la valoración estará a pH ácido, por la presencia de ácido bórico finalmente formado:El
contenido de nitrógeno finalmente calculado se multiplica por un factor
característico de cada alimento y se obtiene entonces el contenido de proteínas totales.

Norma Oficial Mexicana NOM-F-68-S-1980 Alimentos Determinación de Proteínas,

(esta Norma cancela la NOM-F-68-1977).

OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta Norma Oficial Mexicana establece el procedimiento para determinar proteínas en
productos alimenticios.

REFERENCIA
Esta Norma se complementa con la siguiente Norma Oficial Mexicana vigente:

NOM-BB-14 Utensilios de vidrio usados en laboratorio

-Clasificación y tamaños nominales.

(Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidrio usados en el laboratorio).

FUNDAMENTO
Este método se basa en la descomposición de los compuestos de nitrógeno orgánico por
ebullición materia orgánica se oxidan para formar agua y bióxido de carbono. El ácido
sulfúrico, se transforma en SO2, el cual reduce el material nitrógeno a sulfato de amonio.

El amoniaco se libera después de la adición de hidróxido de sodio y se destila recibiéndose

en una disolución al 2% de ácido bórico. Se titula el nitrógeno amoniacal con una disolución
valorada de ácido, cuya normalidad depende de la cantidad de nitrógeno que contenga la
muestra. En este método de Kjeldahl Gunning se usa el sulfato de cobre como catalizador y
el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la digestión.

Norma Oficial Mexicana NOM-Y-118-A-1982, Alimentos balanceados e ingredientes

para animales -determinación de proteína cruda.( Esta norma cancela a la
NOM-Y-118-1976).
OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Esta norma oficial establece el procedimiento para determinar el contenido de proteína
cruda en alimentos balanceados e ingredientes para animales.

FUNDAMENTO
Este método se basa en la transformación del nitrógeno en sulfato de amonio, mediante la
acción del ácido sulfúrico a altas temperaturas en presencia de catalizadores y su posterior
liberación en forma de amoniaco para proceder a su valoración.

REPETIBILIDAD
La diferencia máxima permisible entre una serie de determinaciones efectuadas a una
misma muestra por un mismo analista debe ser de más menos 1% del porcentaje mínimo
garantizado.
Tomado de:
COMPARACIÓN ENTRE EL MÉTODO KJELDAHL TRADICIONAL Y EL MÉTODO DUMAS
AUTOMATIZADO ( N CUBE ) PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN DISTINTAS
CLASES DE ALIMENTOS
METODOLOGÍA

PROPIEDADES FISICAS Y QUIMICAS DE LOS REACTIVOS A UTILIZAR

Método micro-kjeldahl
➔ HCl (ver pág)
➔ NaOH (ver pág)
➔ Ácido bórico
Fórmula molecular: H₃BO₃
Masa molar: 61,83 g/mol
Estado físico: sólido
Forma: polvo cristalino
Color: blanco
Olor: inodoro
Punto de fusión/punto de congelación: >100 °C (descomposición lenta)
Temperatura de descomposición: >100 °C
pH (valor): 3,8 – 4,8 (en solución acuosa: 30 g/l, 20 °C)
Hidrosolubilidad: 49,2 g/l a 20 °C
Densidad 1,489 g/cm³ a 23 °C
Densidad aparente 400 – 600 kg/m³
Reactividad: Este material no es reactivo bajo condiciones ambientales normales.
Estabilidad química: El material es estable bajo condiciones ambientales normales y en
condiciones previsibles de temperatura y presión durante su almacenamiento y
manipulación.
Reacciones fuertes con: muy comburente
Condiciones que deben evitarse: Conservar alejado del calor. La descomposición comienza
a partir de temperaturas de: >100 °C.
➔ Fenolftaleína
Fórmula molecular: C₂₀H₁₄O₄
Masa molar: 318,3 g/mol
Estado físico: sólido
Forma: polvo cristalino
Color: blanco
Olor: inodoro
Punto de fusión/punto de congelación: 258 – 263 °C
Punto de ebullición o punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición: >450 °C
Temperatura de autoinflamación: 397 °C
Hidrosolubilidad <0,01 g/l a 20 °C
Densidad 1,3 g/cm³ a 20 °C
Densidad aparente 350 – 450 kg/m³
Reactividad: El producto en la forma de entrega no es capaz de producir una explosión de
polvo; pero la acumulación de polvo fino conduce a un peligro de explosión de polvo.
Estabilidad química: El material es estable bajo condiciones ambientales normales y en
condiciones previsibles de temperatura y presión durante su almacenamiento y
manipulación.

➔ Etanol (ver pág)

➔ Sulfato de cobre pentahidratado
Fórmula molecular: CuSO₄ · 5 H₂O
Masa molar: 249,7 g/mol
Estado físico: sólido
Color: azul
Olor: inodoro
Punto de fusión/punto de congelación: 30 – 110 °C (Liberación de agua de cristal)
Temperatura de descomposición: >30 °C (Liberación de agua de cristal)
pH: 3,5 – 4,5 (en solución acuosa: 50 g/l, 20 °C)
Hidrosolubilidad 317 g/l a 20 °C
Densidad 2,286 g/cm³
Reactividad: Este material no es reactivo bajo condiciones ambientales normales.
Estabilidad química: El material es estable bajo condiciones ambientales normales y en
condiciones previsibles de temperatura y presión durante su almacenamiento y
manipulación.
Reacciones fuertes con: Acetileno, Magnesio, Lejía fuerte
Condiciones que deben evitarse: Conservar alejado del calor. La descomposición comienza
a partir de temperaturas >30 °C.
 ➔ H2SO4 (ver pàg)
➔ H3PO4 (ver pág)

CÁLCULOS Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Método de micro kjeldahl
- HCl 0.01N
# 𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑁 = 𝑉
𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
#𝑒𝑞𝑢𝑖𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑃𝑒𝑞. 𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑁= 𝑉
= 𝑉
= 𝑃𝑒𝑞 (𝑉)
𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 × 𝑃𝑒𝑞 × 𝑉
𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = (0. 01 𝑁) (36. 5 ) (1) = 0. 365 𝑔
0.365 g de HCl
𝑤 0.365 𝑔
𝑣= 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑
= 1.15 𝑔/𝑚𝐿
= 0. 317 𝑚𝐿

En un matraz volumétrico de 1000 mL, depositar 200 mL de agua, agregar lentamente

0.317 mL de ácido clorhídrico. Enfriar a temperatura ambiente y llevar a volumen con agua.

- NaOH 60%
𝑊 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
%𝑃/𝑉 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
× 100
%𝑃/𝑉
𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 100 × 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛
60
𝑤 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 100 × 100 𝑚𝑙
w= 60 g de NaOH
Pesar aproximadamente 60 g de NaOH y transferir a vaso de pp, disolver con 30 ml de
agua, transferir a un matraz aforado de 100 ml y llevar al aforo con agua.

- Solución de ácido bórico con indicador

Cálculos: NA
Preparación: Pesar 2.5g de ácido bórico, colocarlo en un matraz aforado de 500 mL,
adicionar agua destilada hasta disolver. Agregar 17.5 mL de indicador A (25mg de
fenolftaleína aforados a 25 mL de etanol), y 5 mL de indicador B (8mg de verde de
bromocresol y 15 mg de rojo de metilo aforados a 25 mL de etanol). Se ajusta el color a un
tono café rojizo con ácido o base según se requiera y se afora a 500 mL

- Mezcla digestiva
Cálculos: NA
Preparación: Mezclar 0.75g de CuSO4 pentahidratado, 75 mL de ácido sulfúrico
concentrado y 25 mL de ácido fosfórico, más 10 mL de agua

CÁLCULOS Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

NA
DESARROLLO DE LA TÉCNICAS
Pesar de 20 a 40 mg de muestra, colocar la muestra en un matraz Micro-Kjeldahl de 30 mL,
añadir 3mg de óxido de mercurio, 2mL de mezcla digestiva y cuerpos de ebullición.

PRECAUCIONES
● Utilizar guantes y gafas de protección
● Identificar las situaciones de riesgo y las medidas que deben tomarse
● No utilizar el sistema de Kjeldahl para sustancias explosivas o inflamables
● Siempre que se liberen gases, sustancias o vapores peligrosos, las normas
generales de seguridad para laboratorios establecen la obligatoriedad de utilizar
campanas de extracción de vapores.

MEDIDAS EMERGENTES
De manera general en caso de:
- Inhalación: proporcionar aire limpio, reposo y asistencia médica.
- Piel: enjuagar con abundante agua
- Ojos: enjuagar con abundante agua y proporcionar asistencia médica
Para Sulfato de cobre pentahidratado
- Ingestión: no provocar vómito, dar a beber 1 o 2 vasos de agua
- Derrame: barrer la sustancia derramada e introducirla en un recipiente tapado.

Para el ácido bórico

- Ingestión: acudir inmediatamente al médico
- Derrame: recoger mecánicamente y colocar en recipientes apropiado para su
eliminación.

FUNDAMENTO Y MANEJO DEL EQUIPO

AParato de digestión y destilación Kjeldahl

Fundamento
Destilador: se realiza una destilación de vapor, se añade un álcali mediante un sistema de
dispensación integrado. El destilador recoge en un matraz de recepción para la titulación
posterior, y así poder realizar determinaciones de nitrógeno orgánico.
Digestor: el equipo realiza una descomposición de nitrógeno contenido en muestras
orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene calentando y
haciendo hervir la muestra en un concentración de H2SO4, dando como resultado una
solución de sulfato de amonio
 Aparato combinado

https://grupo-selecta.com/wp-content/uploads/M.80188.00-E.pdf

Manejo
Digestor
1. Adicionar la muestra a un tubo de digestión
2. Agregar catalizador Kjeldahl (sulfato de cobre + sulfato de potasio)
3. Adicionar H2SO4 a la muestra
4. Ajustar cada unidad de calentamiento en el aparato de digestión
5. Coloque los tubos
6. Calentar a ebullición hasta que la solución sea transparente.
Destilación
 1. Prepare los balones Kjeldahl
2. Coloque el balón en el soporte e introduzca el tubo de salida del destilador cuidando
que quede sumergido en la solución absorbente
3. Realice un enjuague a las paredes del tubo con una pequeña porción de agua,
coloque el tubo de digestión en el soporte del equipo
4. Verifique en la programación del equipo las siguientes condiciones: 10 ml, agua, 15
ml de NaOH 32%, tiempo de destilación de 3 min.
5. Recoja el destilado y realice la valoración
6.
CRONOGRAMA

Actividad 01-Mar-2022 08-Mar-2022

Preparación de la muestra X

Colar la muestra en el X
aparato de digestión

Destilación de la muestra X

Valoración de la muestra X

Cálculos X

DIAGRAMA DE FLUJO
 COMPARACIÓN DE MÉTODOS (todas)

Método 1. Método de micro Método 2. Método de Método 3 . Método de Lowry

kjeldahl Bradford

Aplica para varios tipos de “Ensayo de proteína de Aplicación: lácteos

alimentos. colorante Coomassie” Principio:
El método involucra tres procesos: Utiliza el colorante 1. Reacción de biuret
digestión, destilación y valoración. Coomassie
Ventajas
 - Es apropiado para varios Ventajas: 2. Tratamiento con reactivo de
tipos de productos - Es un procedimiento fenoles Folin/Ciocalteu
- Alta confiabilidad y rápido (30 min aprox) El proceso de oxido-reducción se
disponibilidad - Se pueden analizar
acompaña de la formación de un
- Está incluido en los métodos varias muestras en un
aprobados por las corto período. color azul característico.
organizaciones
- Utiliza luz visible (595 Ventajas: alta sensibilidad, fácil de
Desventajas nm) para medir la operar, Fácil de manejar con un
- Llega a haber interferencia absorbancia de la gran número de muestras
de compuestos nitrogenados muestra.
no proteicos
Desventajas: interfieren varios
- Durante la digestión se - Puede detectar una gran
producen gases variedad de proteínas, compuesto
- Uso de catalizadores caros y detectando cantidades Inestabilidad del reactivo de
tóxicos tan pequeñas como 1 Folin/Ciocalteu a pH alcalino
Microgramo en una
muestra Reactivos
Reactivos Tartrato de sodio y potasio
- HCl 0.01 N Desventaja: No funciona si Carbonato de sodio
- NaOH 60% hay presencia de NaOH
- Mezcla digestiva detergentes o tensoactivos Sulfato de cobre pentahidratado
- Solución de ácido bórico con en la muestra o si la reactivo de fenol Folin-Ciocalteu
indicador muestra es básica.
Lectura de la absorbancia: 650 nm
Reactivos:
Resultados ● Reactivo de Bradford Resultados:
● Estándar de proteína la concentración de proteínas se
(BSA 0.5 mg/ml) obtiene al realizar la curva estandar

El contenido de nitrogeno se
multiplica por un factor característico
de cada alimento

REFERENCIAS
1. Kit para determinación de proteínas. Método de Bradford. [Internet] Consultado el 28
de marzo de 2022. Disponible en:
http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-content/uploads/2017/04/kit-proteinas-bradfor.pdf
 2. Ricardo R. Ensayo de proteínas de Bradford: ventajas y desventajas. [Internet].
[Publicado el 07 septiembre de 2020]. Consultado el 28 de marzo de 2022.
Disponible en:
https://estudyando.com/ensayo-de-proteinas-de-bradford-ventajas-y-desventajas/
3. Torres M. Métodos para análisis de proteínas. [Internet]. Consultado el 28 de marzo
de 2022. Disponible en:
https://www.achipia.gob.cl/wp-content/uploads/2016/06/4-M--todos-Proteina-Lic.-Q.-
Marcela-Torres.pdf
4. Destilador Kjeldahl semiautomatico. [Internet]. Consultado el 28 de marzo de 2022.
Disponible en: https://grupo-selecta.com/wp-content/uploads/M.80188.00-E.pdf
5.

MÉTODO 2
Método de Bradford
Fundamento: La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la
cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína,
comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar /Albúmina
de suero bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un
espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs. la concentración de proteínas,
obteniendo una curva de calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración,
se puede interpolar la concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a
595 nm.
Reactivos:
● Reactivo de Bradford 1x —-------------250 ml
● Solución de dilución —-----------------100 ml
● Estándar de proteína (BSA 0.5 mg/ml)-----1 ml

Procedimiento:
1. Prepare diluciones del estándar de proteína de 25, 50, 75 y 100 g/mL, usando la
solución de dilución: En 4 tubos tipo Eppendorf, añada 5, 10, 15 y 20 L del estándar
de proteína (0.5 mg/mL) y complete el volumen de 100 L con la solución de dilución.
En otro tubo añada 100 L de la solución de dilución. Este es el blanco.
2. Prepare la(s) muestra(s) tomando un volumen igual o menor a 100 L; completando
los 100 L con la solución de dilución.
3. Añada a cada tubo 1 mL del reactivo de Bradford, mezcle con agitador vórtex, e
incube la reacción a temperatura ambiente por 2 minutos.
4. Mida la absorbancia a 595 nm (A595) en un espectrofotómetro, en un plazo no
mayor de 1 hora.
5. Haga la curva de calibración estándar graficando la A595 vs la concentración de
proteína estándar.
6. Determine la concentración de proteína en las muestras a partir de la curva de
calibración estándar y los valores de A595. Si la concentración es muy alta (queda
fuera del rango del estándar), diluya la muestra o tome una alícuota menor para la
determinación.
Kit para determinación de proteínas. Método de Bradford. [Internet] Consultado el 28 de
marzo de 2022. Disponible en:
http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-content/uploads/2017/04/kit-proteinas-bradfor.pdf

Ricardo R. Ensayo de proteínas de Bradford: ventajas y desventajas. [Internet]. [Publicado

el 07 septiembre de 2020]. Consultado el 28 de marzo de 2022. Disponible en:
https://estudyando.com/ensayo-de-proteinas-de-bradford-ventajas-y-desventajas/

Norma Oficial Mexicana NOM-Y-118-A-1982, Alimentos balanceados e ingredientes para

animales -determinación de proteína cruda. Diario Oficial de la Federación, 5 de noviembre
de 1982.
http://www.dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4790976&fecha=04/01/1983

Norma Oficial Mexicana NOM-F-68-S-1980 Alimentos Determinación de Proteínas. Diario

Oficial de la Federación, 9 de Julio de 1980.
http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4858024&fecha=04/08/1980#:~:text=NOM%2DF
%2D68%2DS%2D1980%20%22ALIMENTOS%2D,F%2D68%2D1977)

Lanza J, Churión P, Gómez N. Comparación entre el método Kjeldahl tradicional y el método

Dumas automatizado ( N cube ) para la determinación de proteínas en distintas clases de
alimentos. Saber [Internet]. 2016 Jun [citado 2022 Mar 30] ; 28( 2 ): 245-249. Disponible
en:http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-01622016000200007&lng=e
s.

MÉTODO 3
Método de Lowry
Aplicación: lácteos
Principio:
3. Reacción de biuret
4. Tratamiento con reactivo de fenoles Folin/Ciocalteu
El proceso de oxido-reducción se acompaña de la formación de un color azul característico.

Ventajas: alta sensibilidad, fácil de operar, Fácil de manejar con un gran número de
muestras

Desventajas: interfieren varios compuesto

Inestabilidad del reactivo de Folin/Ciocalteu a pH alcalino

Método
Tratamiento de la muestra: se homogeneizaron 0.5 g de materia prima con 30 ml de NaOH
0.1 M en cloruro de sodio al 3.5%.

El ensayo se realizó diluyendo los extractos a 1 ml con agua y agregando 0.9 ml de solución
A (2 g/L de tartrato de sodio y potasio con 100 g/L de carbonato de sodio en NaOH 0.5 M)
antes de la incubación durante 10 min a 50°C. Posteriormente, las muestras se enfriaron a
temperatura ambiente, se agregó 1 ml de solución B (0.2 g/L KNaC4H4O6.4H2O y 0.1 g/L
de sulfato de cobre pentahidratado en NaOH 0.1 M) y se dejó durante 10 min. Finalmente,
se añadieron 3 ml de solución C (reactivo de fenol Folin-Ciocalteu en agua (1:16 v/v)) antes
de la incubación durante 10 min a 50°C. Se realizo una curva estandar de albumina serica
bovina (soluciones patron 0, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1 g/L) y se leyo la absornacia a 650
nm.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5789268/
https://www.achipia.gob.cl/wp-content/uploads/2016/06/4-M--todos-Proteina-Lic.-Q.-Marcela-
Torres.pdf
https://amyd.quimica.unam.mx/pluginfile.php/14545/mod_resource/content/1/An%C3%A1lisi
s%20de%20alimentos%20fundamentos%20y%20t%C3%A9cnicas.pdf