ULTRACENTRIFUGACIÓN

INTEGRANTES:
4IM1 ~Barron Gasca Erick
Sección I ~Botello Monsiváis Elliot
~Castillo Gutiérrez Juan Carlos
~Márquez Pacheco Alpha Celeste
~Martinez Vazquez Osiris Tais
~Pimentel Calzada Gonzalo
~Rubio Velazquez Brenda Anaid
ANTECEDENTES
La ultracentrífuga fue ideada en 1923 por el
bioquímico sueco Theodor Svedberg puede
alcanzar velocidades de hasta 100,000 rpm.

● Se basó en el principio de equilibrio

utilizado en el proceso de descremación de
la leche, usando un motor eléctrico, como
mecanismo básico de impulsión y un rotor
de acero.
● Svedberg consiguió desarrollar una
centrífuga capaz de aplicar fuerzas
gravitatorias (g) 7,000 veces el valor
de la fuerza de gravedad a muestras
coloides.
● Aparece la primera ultracentrífuga,
denominada así porque permitía
determinar partículas que no se
podían ver al ultramicroscopio.
● Midió las masas moleculares de más
de 30 proteínas comenzando por la
hemoglobina, y muestras biológicas.
 ¿Qué es la
ULTRACENTRIFUGACIÓN?
Método por el cual se
logran separar sólidos de
líquidos de diferente
densidad mediante una
fuerza rotativa que imprime
una fuerza mayor que la de
la gravedad provocando la
sedimentación de los
sólidos o de las partículas
de mayor densidad.
 CAMPO CENTRÍFUGO
Se expresa generalmente en en múltiplos del campo gravitacional

g (981 cm/seg2).

Campo centrífugo relativo (CCR): Razón entre la aceleración

centrífuga a un radio y velocidad especificados, y la aceleración de
gravedad:

CCR = 4 π2 x(rpm)2 r /3600 x 981

Las unidades del CCR se expresan en “x G” y las “revoluciones por

minuto” se abrevian como rpm.
 FUERZA
CENTRÍFUGA
Fuerza que aparece cuando
un cuerpo se mueve en una
trayectoria curva, debido a
la propiedad que tienen los
cuerpos con masa de
conservar su estado de
reposo o rectilíneo uniforme.

Fuerza Centrífuga (Fc):
donde:
v → velocidad tangencial
expresada en (m/s)
N → velocidad de centrifugación
expresada en rpm
Si
Por lo tanto
La fuerza centrífuga (Fc) aumenta
linealmente con el radio (r) de la
centrífuga, pero aumenta
proporcional al cuadrado de la
velocidad de centrifugación (N).
**En la ultracentrifugación se
manejan valores grandes de N
 DIFUSIÓN
La difusión es el movimiento
térmico aleatorio de las
moléculas disueltas o
suspendidas en un solvente.
Ecuación de Svedberg
por Theodore Svedberg
Las fuerzas que afectan a una partícula son :

Fuerza de sedimentación
● w=velocidad angular de rotación
● r=distancia del eje de giro hacia el fondo de la muestra
● mb= masa flotante de la partícula, que es igual a la masa menos el
término de flotación(determinado por el volumen específico de la
partícula y la densidad de la disolución).
Fuerza de fricción
Es una fuerza contraria al movimiento
a cierta velocidad v .

=coeficiente de fricción traslacional

= velocidad
En régimen estacionario las dos fuerzas se igualan
dando como resultante 0

entonces:

y despejando v se obtiene:
Constante de sedimentación:
Relación de la velocidad lineal de la partícula con la
aceleración centrífuga.
Donde :
S es el coeficiente de sedimentación
v es la velocidad lineal de sedimentación
w es la velocidad angular
r es la distancia al centro de rotación.

Nota: Cuando la aceleración de la centrífuga es unitaria, el coeficiente

de sedimentación S, es igual a la velocidad de sedimentación V
Sustituyendo valores de manera que:

NA= número de avogadro (N = 6,023 x 10 23)

De manera general el coeficiente de sedimentación tiene

unidades de tiempo, los valores más bajos son de
10 seg = 1 Svedberg
-13
La velocidad de sedimentación se relaciona
con su peso molecular a través de la
ecuación de Svedberg.
Se puede estimar la masa de la molécula a partir
de:
Tipos de centrífugas.
CENTRÍFUGA
CENTRÍFUGA DE BAJA VELOCIDAD
CENTRÍFUGA DE ALTA VELOCIDAD
ULTRACENTRÍFUGAS
CRITERIO: velocidad
MENORES DE 10,000rpm
ENTRE 10,000-25,000rpm
MAYORES a 25,000rpm

CENTRÍFUGA según su propósito

PREPARATIVA
ANALÍTICA
CENTRÍFUGA DE BAJA VELOCIDAD (<10,000rpm)
No necesita de sistema de refrigeración, usualmente son de
rotor de ángulo fijo. APLICACIÓN: preparación de
disolventes.
CENTRÍFUGA DE ALTA VELOCIDAD (<25,000rpm)
Necesario el sistema de refrigeración lo más común es que
sean de rotor de ángulo fijo. APLICACIÓN: separación de
plasma de células rojas de la sangre.

ULTRACENTRÍFUGA (>25,000rpm) Pueden usar distintos

tipos de rotor, están refrigeradas y al vacío. APLICACIÓN:
aislamiento de microvesículas de fluidos biológicos.
CENTRÍFUGAS

Analítica

Preparativa
★ CENTRÍFUGAS PREPARATIVAS
Requieren un
fraccionamiento del
contenido de la celda
de centrifugación y
medir la concentración
en cada fracción para
obtener su
distribución.
★ CENTRIFUGAS ANALÍTICAS
Equipadas con sistemas ópticos
para determinar la distribución de
concentraciones en cualquier
momento durante la medición.

COMPONENTES ESENCIALES:

❖ motor
❖ rotor
❖ sistema fotográfico
 -Ventajas de Ultracentrífuga análitica.
-Permiten la obtención de datos precisos de
propiedades de sedimentación:

♦ coeficientes de sedimentación
♦ pesos moleculares

-Permite en tiempo real apreciar la sedimentación y

obtener una determinación exacta de parámetros
hidrodinámicos y termodinámicos.
INSTRUMENTACIÓN
ROTOR
ROTOR
Suspendido del centro del motor por un
cable.

-Agujero para celda de centrifugación

-Agujero para equilibrar el peso
-Agujero de referencia para determinar la
distancia al centro de rotación

Existen varios tipos de rotores según el

tipo de centrífuga y el tipo de separación
que se quiera realizar.
TIPOS DE ROTORES: MATERIALES:

1. Cabezal horizontal o ❖ Aluminio:sensible a la

basculante corrosión de sales de
rubidio y cesio
2. Ángulo fijo ❖ Titanio

3. Vertical
ROTOR ÁNGULO FIJO

Al moverse el material únicamente a corto

trecho hasta la pared del tubo de la
centrífuga aquí se acumula y resbala
rápidamente hasta el fondo el tubo.
Cavidad con un ángulo entre 25° y 45°
***Permite aceleraciones superiores.
ROTORES BASCULANTES O DE
CABEZAL HORIZONTAL:
Preferibles para equilibrios analíticos y
centrifugaciones zonales.
** No permite trabajar con muy altas aceleraciones.
● En reposo: Posición vertical
● Durante la rotación: Horizontal
ROTOR VERTICAL:
● Utilizados en técnicas de separación
por gradientes.
● Requieren un control de aceleración y
frenado ajustado.
● Menor tiempo de rotación.
● Mayor número de tubos.
Diferencia entre rotor de una ultracentrifuga
análitica y ultracentrifuga preparativa.
CELDAS PARA LA MUESTRA
Diseñadas de modo que paredes serán
paralelas a las líneas del campo centrífugo lo
cual impide la acumulación en paredes de la
celda.
~CILINDRO SOPORTE donde se introduce la
pieza central.
~COMPUERTA DE ALIMENTACIÓN.
~DOS VENTANAS (cuarzo o zafiro).
~PIEZA CENTRAL esta contiene la muestra
líquida (aluminio, epoxi-resina, o titanio).
Recipientes de la muestra:
 SISTEMAS ÓPTICOS.
- Sistema óptico de absorbancia: Basado en una
lámpara de Xe, un rastreador monocromático que permite
la medición de la concentración de la muestra en un rango
de longitud de onda de 200 a 800 nanómetros.

- Sistema óptico de interferencia Rayleigh: mide la

concentración de la muestra basado en cambios en el
índice de refracción.
El sistema óptico de interferencia Rayleigh es utilizado
para el análisis de macromoléculas que carecen de
cromóforos intensos.
- Sistema óptico Schlieren: La luz que atraviesa las
regiones de concentración uniforme prosigue su camino
sin desviarse, mientras que la que atraviesa regiones de
concentración cambiante se desvía debido al cambio del
índice de refracción que varía con la concentración. El
sistema óptico de las modernas centrífugas convierte
estas desviaciones en una curva que muestra el
gradiente de concentración.

El valor del sistema Schlieren reside en su gran

capacidad para examinar el perfil del frente de
sedimentación y se ha utilizado muy ampliamente, sobre
todo para la determinación del coeficiente de
sedimentación de las proteínas.
Otros componentes…

Componente Descripción
MOTOR ● Crea la fuerza centrípeta
SISTEMA DE VACÍO ● En centrifugas de mediana y alta aceleración
● Reduce la fricción del rotor al girar y el calor que con ello
conlleva.
ESTABILIZADOR ● Mantiene a la centrífuga en su lugar
SISTEMA DE ● La rotación a alta aceleración produce aumento de calor en el
REFRIGERACIÓN interior de la cámara
● Necesario mantener una temperatura constante

VENTILADOR ● Expulsa el calor generado por el motor

CONTROL DE ● Colocar los tubos en el rotor de manera que las cargas estén
EQUILIBRIO equilibradas.
● Igual en masa y mismo centro de gravedad
 Diferencial
TIPOS DE
CENTRIFUGACIÓN:
(Según el medio en el que se Zonal
centrifuga y la forma como se
aplica la muestra)
Isopicnica
 ULTRACENTRIFUGACIÓN
DIFERENCIAL
Separa los componente celulares sobre la base de su
tamaño y su densidad. Los componentes de mayor tamaño
y de densidad experimentan la mayor fuerza centrífuga y
se mueven con mayor rapidez (precipitado), mientras que
los componentes más pequeños y menos densos se
mantienen en suspensión (sobrenadante.)
 Las centrifugaciones repetidas a velocidades cada
vez más elevadas fraccionaran los homogeneizados
celulares en sus componentes.
 ULTRACENTRIFUGACIÓN
ZONAL
La muestra se coloca en forma de capa fina (Vmuestra ≯ 5%
Vsolución con el gradiente ) sobre un gradiente de densidad
preformado (sacarosa, CsCl). Durante la centrifugación
cada partícula sedimenta a una velocidad que depende
principalmente de su masa (S); sin embargo, también es
influencia de la densidad de ésta.
Luego de la centrifugación el tubo se punza y las partículas
separadas (zonas o bandas) se recogen.

Este método permite separar

partículas cuyo tamaño difiere en
sólo un 10 % o menos.
 ULTRACENTRIFUGACIÓN
ISOPÍCNICA
Aislar las partículas en medios que presenten su misma
densidad.

Puede realizarse utilizando o no un gradiente de densidad, o

bien:
1. Ultracentrifugación diferencial de la muestra.
2. Resuspender el sobrenadante (paquete) en un medio que
presente la misma densidad a la fracción de interés de la
muestra.
3. Ultracentrifugación isopícnica (las partículas que quieren
aislarse sedimentan, mientras que las menos densas
quedarán flotando sobre el medio.)
Otra posibilidad...
1. Depositar la muestra en forma de capa en un gradiente de
densidad contínuo.
2. Centrifugar la muestra y las partículas se separan en función
de su densidad, formando bandas o zonas en sus
correspondientes
regiones de densidad.
 MATERIALES PARA LA FORMACIÓN
DE GRADIENTES DE DENSIDAD

Sales de metales
CsCl, Cs2SO4, LiBr
alcalinos

Sacarosa,
Hidratos de carbono Glucógeno,
Dextranos, Ficoli

Polialcoholes Sorbitol, Glicerol

FUNCIÓN DEL GRADIENTE DE DENSIDAD
Coloides derivados
Percoil - Separaciones zonales: Estabilizar la
del sílice sedimentación.
- Separaciones isopícnicas: Generar un
Metrizamida, gradiente que incluya la densidad de
Derivados yodados las partículas que se pretenden aislar.
Nycodenz
 APLICACIONES
● Separación de los elementos formes de la sangre,
separación de productos aglutinados o precipitados
(desproteinización, técnicas inmunológicas).
● Separación de fases para extracciones.
● Obtención de la fracción citosólica de homogeneizados, por
ejemplo para el estudio de receptores hormonales.
● Indican el grado de homogeneidad o heterogeneidad de las
especies macromoleculares que sedimentan.
● Detectar y cuantificar la estequiometría y la afinidad de
complejos macromoleculares.
● Estimar la forma aproximada de macromoléculas en
disolución.
● Separación de ácidos nucleicos, virus y ciertos orgánulos
subcelulares como los ribosomas.
● Separar fragmentos de DNA de distintas composiciones
de bases y moléculas DNA de diferente conformación
(superenrollado, circular y lineal).
● Distinguir DNA normal de DNA marcado con un isótopo
pesado de nitrógeno.
● Ineficaz para el fraccionamiento de mezclas proteicas,
dado que la mayoría de las proteínas tienen densidades
similares (además las concentraciones salinas elevadas
insolubilizan y es posible que desnaturalizan proteínas).