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Métodos de Centrifugación

Métodos de Centrifugación

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BIO 368 ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos de centrifugación

CENTRIFUGACION: aplicación de una fuerza superior a la de la gravedad (g = 981 cm/seg2).

CENTRIFUGACION ANALITICA: uso principal en el estudio de propiedades fisico-químicas de macromoléculas y complejos supramoleculares. CENTRIFUGACION PREPARATIVA: uso en separación de estructuras subcelulares, vescículas de membranas, precipitados proteicos, etc.

TIPOS DE CENTRIFUGA Características comunes: Un motor que hace girar un rotor donde se colocan los tubos que contienen las muestras a centrifugar. Diferencias: Velocidad que puede alcanzar la centrífuga Presencia o ausencia de refrigeración Presencia o ausencia de vacío Volumen máximo de muestra Tipos más usados en el laboratorio: Microfugas; utilizan tubos Eppendorf (hasta 10 000 x g) Centrífugas refrigeradas; volúmenes mayores (hasta 100 000 g) Ultracentrífugas preparativas (hasta 600 000 x g)

Tipos de rotores utilizados en centrifugación: d) Rotor de ángulo fijo f) Rotor de tubo vertical (menos usado). c) Rotor “swinging bucket” (vasos basculantes).

Como calcular la velocidad de sedimentación:

G = ω2 x r

ω = 2π x (rev. x min-1)/60

G: campo centrífugo aplicado (aceleración; cm/seg2) ω : velocidad angular (en radianes/seg) r: distancia de la partícula al eje de rotación (cm) G = 4 π2 (rev. x min –1)2 x r/ 3600
Fuerza centrífuga aplicada:

F = m x G = m x ω2 x r (m = masa de la partícula)

EL CAMPO CENTRIFUGO Se expresa generalmente en en múltiplos del campo gravitacional g (981 cm/seg2). El campo centrífugo relativo (CCR) es la razón entre la aceleración centrífuga a un radio y velocidad especificados, y la aceleración de gravedad:

CCR = 4 π2 x (rpm)2 r/ 3600 x 981
Las unidades del CCR se expresan en “x G” y las “revoluciones por minuto” se abrevian como rpm. Habitualmente estos cálculos se hacen con un nomograma.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION DE UNA ESFERA La velocidad de sedimentación depende no sólo del campo centrífugo aplicado sino también de la densidad y radio de la partícula y de la viscosidad del medio. La relación entre estas variables está definida por la ley de Stokes para una partícula esférica rígida:

donde: υ es la velocidad de sedimentación de la esfera 2/9 es una constante para la forma esférica r el radio de la partícula ρp la densidad de la partícula ρm la densidad del medio g el campo gravitacional η la viscosidad del medio Así, dos partículas esféricas pueden separarse en función de su densidad y/o su tamaño

EL COEFICIENTE DE SEDIMENTACION La velocidad de sedimentación de una partícula puede también expresarse como su “coeficiente de sedimentación” s:

Estos valores se expresan habitualmente como unidades Svedberg. Una unidad Svedberg equivale a 10-13 segundos.

Coeficiente de sedimentación y peso molecular de una serie de proteínas
Protein S value (Svedberg units) Molecular weight

  Pancreatic trypsin inhibitor Cytochrome c Ribonuclease A Myoglobin Trypsin Carbonic anhydrase Concanavlin A Malate dehydrogenase Lactate dehydrogenase 1 1.83 1.78 1.97 2.5 3.23 3.8 5.76 7.54 6,520 12,310 13,690 17,800 23,200 28,800 51,260 74,900 146,200

DATOS NECESARIOS PARA DEFINIR UNA CENTRIFUGACION - Velocidad del rotor - Distancia radial - Duración de la centrifugación La velocidad de sedimentación de una partícula depende, además de la masa de la partícula, de la densidad y viscosidad del medio y el grado de desviación de la partícula de una forma esférica. Las partículas generan fricción, la que se opone a su movimiento, la que depende del tamaño, forma e hidratación de la partícula y de la viscosidad del medio.

Al centrifugar una partícula, pronto se llega a un equilibrio entre la fuerza centrífuga y la fuerza de fricción, con lo que la partícula avanza a una velocidad constante. Lo que define la separación de dos partículas diferentes es su diferencia de tamaño y de densidad. Estos son la base de la separación de macromoléculas biológicas o de organelos subcelulares. También influye la forma de las partículas. Todo esto puede expresarse matemáticamente. La situación es aún más compleja, pues como la fuerza centrífuga depende de la distancia de la partícula al centro de rotación, a medida que avanza el proceso de centrifugación, la fuerza (y velocidad) se van haciendo mayores.

APLICACIONES DE LAS CENTRIFUGAS PREPARATIVAS - Centrifugación diferencial. Utilizada en fraccionamiento celular y subcelular. Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación de partículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Se somete un homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vez la fuerza centrífuga. Se logra así obtener las siguientes fracciones: Núcleos Mitocondrias Lisosomas Microsomas Fracción soluble - Centrifugación en gradiente de densidad. Permite separar partículas de similar tamaño pero distinta densidad. Puede usarse sedimentación de velocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana). En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).

Densidad y coeficiente de sedimentación de diversos componentes celulares.

CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD

CENTRIFUGACION ISOPICNICA Y DENSIDAD DE FLOTACION DEL DNA Utilizado para la purificación de DNA, basado en la diferencia de densidad entre DNA, RNA y proteínas. También es útil para separar DNA de hebra simple del de hebra doble. Se genera un gradiente de CsCl y el DNA se equilibra en el tubo según su densidad de flotación.

Esquema del fraccionamiento de un homogeneizado de músculo esquelético. Primero se utiliza centrifugación diferencial, seguido de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa.

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