Cuestionario Previo:

1. ¿Qué es cromatografía de líquidos una separación por técnica de fase inversa y por fase
normal?

Considerando las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se distinguen dos tipos
de cromatografía.

En la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es polar, utilizándose como tales,

rellenos en los que R en la estructura del siloxano puede ser un grupo 𝑐𝑖𝑎𝑛𝑜 (– 𝐶2 𝐻4 𝐶𝑁), diol
(−𝐶3 𝐻6 𝑂𝐶𝐻2 𝐶𝐻𝑂𝐻𝐶𝐻2 𝑂𝐻), amino (–𝐶3 𝐻6 𝑁𝐻2) y dimetilamino [–𝐶3 𝐻6 𝑁(𝐶𝐻3 )2 ]. La elución
se lleva a cabo con disolventes no polares, como etiléter, cloroformo o nhexano. Operando en
fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que es el más soluble en la
fase móvil, y un aumento de la polaridad de ésta, hace disminuir el tiempo de elución.

En la cromatografía en fase inversa, que es la utilizada en la mayoría de las aplicaciones, la fase

estacionaria es no polar, tratándose frecuentemente de hidrocarburos tales como 𝐶8 (n-octilo)
ó 𝐶18 (n-octadecilo). Los tiempos de retención aumentan al hacerlo la longitud de la cadena de
la fase enlazada. Para una determinada fase, en esta modalidad de fase inversa, los
componentes más polares aparecen primero y un aumento de polaridad de la fase móvil
aumenta el tiempo de elución. Los grupos de hidrocarburos de cadena larga se alinean unos
junto a otros, perpendicularmente a la superficie de la partícula, originando una estructura
semejante a la de un cepillo. La elución se lleva a cabo con una fase móvil de polaridad elevada,
como disoluciones acuosas conteniendo metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.

La principal limitación de estas fases enlazadas con base silícea reside en que el pH del eluyente
debe estar comprendido entre 2 y 8, para evitar la hidrólisis de la fase estacionaria. El
mecanismo de retención por las fases enlazadas no está suficientemente claro. Para algunos, el
proceso es análogo al que tiene lugar en la cromatografía convencional líquido-líquido, si bien,
parece que simultáneamente puede participar también un mecanismo de adsorción.

2. ¿Cuál es el principio de operación de un detector UV-VIS para CLAE y que características

importantes presenta?

Los detectores de absorbancia ultravioleta (también visible) son los más utilizados en HPLC. Su
fundamento es la espectrofotometría de absorción.

Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son transductores que

convierten la energía radiante en una señal eléctrica Un detector ideal deberá presentar las
características siguientes:

* Sensibilidad elevada en la región espectral de interés.

* Respuesta lineal para la energía radiante.
 * Tiempo de respuesta pequeño.
* Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda.
* Elevada relación señal/ruido.
* Mínima señal de salida en ausencia de radiación.
* Buena disponibilidad para la amplificación.
Para adaptar un espectrofotómetro convencional a medidas en HPLC, la modificación más
importante es diseñar adecuadamente la célula de flujo. Esta deberá contener un volumen
mínimo (entre 1 y 10 L) y ser capaz de soportar presiones de varias atmósferas.

El detector ultravioleta más sencillo utiliza la emisión intensa a 254 nm de una lámpara de
mercurio y la detección a una sola longitud de onda. Se estima que casi las dos terceras partes
de los solutos orgánicos analizados por HPLC presentan absorción a esa longitud de onda,
especialmente los compuestos aromáticos, los cuales tienen absortividades molares del orden
de 104 .

Los datos de absorbancia se representan en función de la longitud de onda y del tiempo, con lo
que se obtienen gráficos, donde se muestra el mapa espectral correspondiente a la separación
de los compuestos 1, 2 y 3 por HPLC.

3. ¿Qué tipo de bombas se utiliza en los Cromatografos de Liquidos?

Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeño tamaño de las
partículas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que proporcionen un flujo
aceptable de eluyente.

Los sistemas de bombeo usados en HPLC deberán reunir las siguientes características:
* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados
* Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en el margen comprendido entre 0.1 y
10 mL/min con una precisión del 0.5 %.
* Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2)

La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las denominadas bombas recíprocas. Estas
bombas consisten en un pistón de zafiro situado en el interior de una cámara de volumen
reducido (35–400 µL) que, alternativamente succiona eluyente contenido en un depósito a baja
presión y lo impulsa hacia la columna a presión alta, mediante un sistema de válvulas. Con este
dispositivo se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudiéndose
adaptar fácilmente a la técnica de elución con gradiente, debido a su pequeño volumen interno.
Sin embargo, producen un flujo pulsante que se ha de amortiguar convenientemente, para lo
cual se utiliza en ocasiones un sistema constituido por dos pistones.

Las bombas de desplazamiento se utilizan mucho menos que las anteriores y básicamente
consisten en una cámara relativamente grande equipada con un mecanismo de tornillo.
Suministran un flujo libre de pulsaciones, pero presentan el inconveniente de su capacidad
limitada (≅250 mL).

Las bombas neumáticas hacen uso de la presión de un gas aplicado al recipiente conteniendo
la fase móvil. Estas bombas son muy sencillas y no provocan pulsaciones, si bien, están limitadas
a presiones relativamente bajas.