UNIDAD DE CIENCIAS BÁSICAS

ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICAS

SEGUNDO AÑO

PRACTICA 6. DETERMINACION DE
HEMOGLOBINA GLICOSILADA EN SANGRE
 DETERMINACION DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA EN SANGRE

1. INTRODUCCION.

La hemoglobina glicosilada también denominada glicohemoglobina o HbA1c es el

producto de la unión no enzimática de la glucosa con el residuo N-terminal de la
cadena β de la hemoglobina A.

La concentración de HbA1c depende de los niveles medios de glucosa durante la

vida de los hematíes y por tanto tiene utilidad para estimar la media de glucemia
de los últimos 120 días.

Es importante tener en cuenta que también depende de la concentración de

hemoglobina y de la vida media del hematíe.

Los pacientes con diabetes mellitus tendrán mayor cantidad de hemoglobina

glicosilada porque su hemoglobina A tiene contacto con concentraciones más
elevadas de glucosa.

Por ello es utilizado para el control de la persona diabética junto con la

monitorización de la glucosa en sangre capilar.

A partir de la hemoglobina glicosilada, se puede determinar la glucemia media

estimada, es decir si una persona tiene una concentración de HbA1c de 7 %
significa que en los últimos 120 días ha tenido una glucemia media de 155 mg/dL.

En los últimos años la Asociación Americana de la Diabetes (ADA) ha incluido una

hemoglobina glicosilada superior a 6.5 % como un criterio más para el diagnóstico
de diabetes mellitus.
2. OBJETIVO.

Determinar la hemoglobina glicosilada (HBA1c) en sangre según un método de

cromatografía de intercambio iónico.

Comparar el valor de nuestro resultado con los rangos de referencia de

hemoglobina glicosilada.

3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.

Al inicio se prepara un hemolizado para liberar la hemoglobina y eliminar la

fracción lábil.

Este hemolizado se adiciona a la columna cromatográfica donde las hemoglobinas

serán retenidas por la resina de intercambio catiónico.

Se elimina la HbA1a y HbA1b por medio de un lavado.

Luego la HbA1c se eluye de forma específica, y se cuantifica por lectura en el

espectrofotómetro a 415 nm.

También se determina la hemoglobina total a la misma longitud de onda.

Y por ultimo se calcula el porcentaje de HbA1c, dividiendo la densidad óptica de

HbA1c a la de hemoglobina total, multiplicado por un factor.
4. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA.

4.1. EQUIPOS.

Espectrofotómetro Cronometro

4.2. MATERIALES.

Tubos de vidrio Gradilla

Micropipetas Tips de micropipetas

Recipiente de bioseguridad Cubetas del espectrofotómetro

Microcolumnas: Resina de intercambio catiónico con tampón fosfatos 72 mmol/L,

pH 6.5

4.3. REACTIVOS.

Reactivo 1. Ftalato de potasio 50 mmol/L, detergente 5 g/L pH 5,0.

Reactivo 2. Tampón fosfatos 30 mmol/L, pH 6.5.

Reactivo 3. Tampón fosfatos 72 mmol/L, pH 6.5 4.

4.4. MUESTRA.

Sangre venosa recolectada mediante procedimientos estándar y con EDTA como

anticoagulante. La HbA1C en sangre se puede conservar 7 días a 2-8°C. No es
necesario que la persona se encuentre en ayunas.
5. PROCEDIMIENTOS.

5.1. Dejar atemperar reactivos y columnas durante unos minutos.

5.2. Pipetear en un tubo de ensayo 50 ul de sangre y 200 ul de Reactivo 1.

5.3. Agitar y dejar durante 10-15 min. Este hemolizado se utilizará en los pasos 5.6
y 5.11.

5.4. Destapar la parte superior de la columna y romper a continuación la lengüeta

inferior.

5.5. Con la ayuda del extremo plano de una pipeta, bajar el disco superior hasta el
nivel de la resina, evitando comprimirla. Dejar gotear hasta que el líquido alcance
el nivel del disco, desechando el eluido.

5.6. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior 50 ul de hemolizado.

Desechar el eluido

5.7. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir 200 ul de Reactivo 2,

procurando arrastrar los posibles restos de este. Desechar el eluido

5.8. Pipetear 2 ml de Reactivo 2. Desechar el eluido

5.9. Colocar la columna sobre un tubo de ensayo y añadir 4.0 ml de Reactivo 3.

Recoger el eluido (Fracción HbA1c)

5.10. Agitar bien y leer la densidad óptica (DO) de la fracción HbA1c a 415 nm
frente a agua destilada (DO HbA1c).

5.11. Pipetear en un tubo de ensayo 12 ml de Reactivo 3 y 50 ul del hemolizado.

5.12. Agitar y leer la densidad óptica (DO) de la Hb total a 415 nm frente a agua
destilada (DO Hb total).
6. CÁLCULOS.

Calcule la concentración de hemoglobina glicosilada utilizando la siguiente

formula:

HbA1c (%) = DO Hb A1c x 100

DO Hb total x 3

Ejemplo:

DO Hb A1c = 0.15

DO Hb total = 1.25

HbA1c (%) = 0.15 x 100 = 13.3 %

1.25 x 3

7. VALORES DE REFERENCIA.

Para diagnóstico de diabetes:

Normal: < 5.7 %

Prediabetes: 5.7 – 6.4 %

Diabetes mellitus: > 6.5 %

Para control glucémico en diabetes:

Meta general < 7.0 %

8. BIBLIOGRAFIA.

Alvaro Gonzales Hernandez. Principios de bioquímica clínica y patología

molecular. 3ª ed. Elsevier España. 2019

Campuzano MG, Latorre SG. La HbA1c en el diagnóstico y en el manejo de la

diabetes. Medicina & Laboratorio; 16 (5-6), 2010. Disponible en:

https://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2010/myl105-6b.pdf

Asociacion Latinoamericana de Diabetes. Guías ALAD sobre el diagnóstico,

control y tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 2 con Medicina Basada en
Evidencia Edición 2019.Disponible en:

http://www.revistaalad.com/guias/5600AX191_guias_alad_2019.pdf