DETERMINACION DE ACIDO URICO EN SANGRE TEST ENZIMATICO AMINOFENAZONA COLORIMETRICO, CON EL METODO DE LA 4-

FUNDAMENTO DEL METODO: Este mtodo se basa en la especificidad de la reaccin del cido rico catalizada por la uricaza, a alantona y perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno producido reacciona oxidativamente con el cido 3,5-dicloro-2-hidroxibencensulfnico (DCHBS) y 4aminofenazona (PAP), en presencia de perxidasa, para formar un colorante rojo de quinonimina. La absorbancia de la quininimina tiene un mximo a 512 nm, pero se mide a 520 nm para evitar la interferencia espectral por hemlisis, bilirrubina y turbidez. Acido rico + O2 + 2H2O 2H2O2 + DCDHBS + PAP Reactivo enzimtico Buffer fosfato PAP DCHBS Uricasa Peroxidasa 50 mmol/l 0.3 mmol/l 4 mmol/l >200 U/l >1 KU/l Alantona + CO2 + H2O2 Quinonimina + HCl + 4H2O

Estandar de cido rico: 8 mg/dl Muestra: Suero, plasma heparinizado o con EDTA, orina. La orina debe diluirse en proporcin 1:10 con agua destilada. PROCEDIMIENTO: Marque tres tubos como blanco, estndar y muestra y procede a pipetear las cantidades de cada uno de ellos, de acuerdo a la siguiente tabla. BLANCO ESTANDAR MUESTRA REACTIVO ENZIMATICO 1000 l 1000 l 1000 l ESTANDAR 20 l MUESTRA 20 l Mezcle e incube por 10 minutos a 20 25 C o por 5 minutos a 37 C Mida la absorbancia de la muestra, estndar y blanco de reactivo a 520 nm dentro de 15 minutos.

CALCULOS: Concentracin de cido rico en suero o plasma: ABS Muestra Concentracin = 8 x ABS Estndar Concentracin de cido rico en orina: ABS Muestra Concentracin = 88 x ABS Estndar mg/dl mg/dl

Linealidad: El test es lineal hasta una concentracin de cido rico de 20 mg/dl. Las muestras con una alta concentracin se deben diluir con solucin salina normal. VALORES DE REFERENCIA MUJERES HOMBRES ORINA 2.4 5.7 mg/dl 3.4 7.0 mg/dl 250 750 mg/24h

INTEGRACIN BIOQUMICA-CLINICA El cido rico es el producto final del metabolismo de las bases purinicas en el hombre, es un tautmero que existe en dos formas, enlica y cetnica; su grupo hidroxilo en el carbono 8 tiene un pK aproximadamente de 5.4 y por lo tanto existe en estado aninico (urato de sodio) a pH fisiolgico. Es excretado en la orina a una velocidad de 0.4 a 0.8 gramos en 24 horas. El nivel promedio normal superior es de 7 mg/100 ml, que est por encima de la solubilidad del cido rico en agua, o sea, 6.4 mg/100 ml. Dado que el cido rico es un producto final del metabolismo delas purinas, entonces es normal que sus niveles flucten en forma directa con la ingestin de purinas, las dietas ricas en nucleoprotenas, por ejemplo, carnes, en especial las carnes glandulares y legumbres, conducen a una mayor excrecin de cido rico. Un individuo hiperuricmico presenta aparentemente una sobresaturacin de cido rico respecto a los uratos en el suero sanguneo. En circunstancia que conducen a hiperuricemia, el organismo utiliza otras vas de depuracin sangunea de cido rico, adems de la excrecin urinaria. Esto implica que el cido rico se deposita como sal monosdica en las articulaciones y tejidos conectivos, formando racimos de cristales denominados tofos. La insolubilidad de los uratos puede plantear dificultades en el metabolismo de los mamferos. En el ser humano, aproximadamente 3 individuos de cada 1000 sufren hiperuricemia, elevacin crnica de las concentraciones de cido rico en sangre por encima de los lmites normales. La elevacin prolongada o aguda de las concentraciones de urato en sangre causa su precipitacin (este trastorno se conoce con el nombre clnico de gota), en

forma de cristales de urato sdico, en el lquido sinovial de las articulaciones. Estos precipitados producen inflamacin, que causa una artritis dolorosa, y finalmente sino se trata, conduce a degeneracin grave de las articulaciones. La gota se debe, bien a una sobreproduccin de nucletidos de purina, que da lugar a una sntesis excesiva de cido rico, o bien a un deterioro de la excrecin de cido rico a travs de los riones. Una forma de gota se caracteriza por una actividad elevada de PRPP sintetasa, que puede deberse a una falla de sensibilidad a la retroinhibicin ejercida por los nucletidos de purina. La gota puede deberse tambin a mutaciones de PRPP aminotransferasa que hacen que esta sea menos sensible a la retroinhibicin ejercida por los nucletidos de purina. Otra forma de gota es la que se debe a un dficit de la enzima de salvamento hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa. La gota tambin es una consecuencia de la quimioterapia del cncer, presumiblemente como consecuencia de una sobrecarga de purinas causada por la degradacin de los cido nuclecos tras la muerte de las clulas tumorales. Una deficiencia de glucosa 6-fosfatasa (enfermedad de almacenamiento del glucgeno, tipo I; enfermedad de Von Gierke) lleva a un incremento de la sntesis de novo de nucletidos purnicos. La falta de conversin de glucosa 6-fosfato a glucosa conduce a un aumento de la actividad de la desviacin de las hexosas monofosfato. El incremento de la utilizacin de la glucosa 6-fosfato por la desviacin da lugar a un aumento de los niveles de ribosa 5-fosfato y en consecuencia aumento en los niveles de PRPP. El incremento de los niveles de PRPP conduce a un incremento en la actividad de la PRPP amidotransferasa, que finalmente se traducir en un aumento de la produccin de cido rico. El incremento de la actividad de la glutatin reductasa tambin se ha correlacionado con incrementos en los niveles de cido rico. La glutatin reductasa genera NADP+ el cual es requerido para impulsar las dos primeras reacciones de la desviacin de las hexosas monofosfato. Esto tambin conduce a incrementos en los niveles de PRPP y por consiguiente de purinas y cido rico. En el sndrome de Lesch-Nyhan tambin hay una artritis gotosa grave, pero asociada a disfuncin dramtica del sistema nervioso, que se manifiesta en trastornos de la conducta, discapacidad para el aprendizaje y comportamientos hostiles o agresivos, a menudo contra si mismos. El sndrome de Lesch-Nyhan es un rasgo ligado al sexo, ya que se debe a una mutacin nula que ocurre en el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, situado en el cromosoma X, que causa una ausencia total de la enzima. PREGUNTAS 1. 2. 3. 4. Qu es la gota? Qu es el sndrome de Lesch-Nyhan? Explique el mecanismo por el cual es til el alopurinol en el tratamiento de la gota? La cafena, teofilina y teobromina son bases purinicas, usted cree que su metabolismo aumentar los niveles de cido rico en un paciente hiperuricmico? Justifique su respuesta. 5. En la leucemia y en el tratamiento con quimioterapia hay una gran excrecin de cido rico, Explique a qu se debe este aumento en cada caso? 6. Qu es la alantoina? 7. Explique dos mecanismos por los cuales se produzca gota primaria, como defecto en el metabolismo de las purinas. 8. Explique el mecanismo por el cual se produce un incremento de la produccin de cido rico en la enfermedad de Von Gierke 9. Qu relaccin se puede encontrar entre el metabolismo del alcohol y la secrecin de cido rico? 10. Qu relacin existe entre la glutatin reductasa y la hiperuricemia?