DENIS ES EL MEJOR

CAPITULO I
I. Definiciones y ambitos
• Concepto de biotecnologia
• Usos de biotecnologia
• Realidad en el mundo actual y sus problemas. ¿que tanto puede contribuir la biotecnologia para
solucionar?
Caso desecho de alimentos: no es tan simple como aprovechar alimentos que se desperdician,
todo esta asociado a normativas sanitarias.
Caso demanda energetica: razones geopoliticas que permiten el cambio.
Caso cambio climatico: en la historia han habido etapas de glaceaciones y calentamiento. Antes
de la historia del hombre los cambios climaticos ya estaban presentes. La diferencia es que
actualmente hay una aceleracion del cambio. Consecuencias:, alteracion en la dinamica de
poblaciones, etc. Los estrategas R: aparicicion de plagas (fitopatogenos en diversos climas).
Empleo de petroleo, gas natural son fuentes de energia no sostenible.
Estructura de lignocelulosa (residuos de sistemas agricolas). Diseñada con anillos aromaticos, de
tal manera que tiene alta resistencia quimica y mecanica. Actualmente no se logran
tratamientos enzimaticos eficientes. Los tratamientos mas usados son fisicoquimicos, entre los
quimicos usan acidos o bases fuertes y entre los fisicos emplean calor o altas presiones. Quizas
esto es una solucion energetica pero no ambiental.
• Bioeconomia:
El modelo economico ya existe en paises del primer mundo, sin embargo, ¿con que velocidad se
esta cambiando el remplazo de productos existentes? Importancia de la etica profesional.
Retos: (1)crecimiento inteligente: desarrollar una economia basa en la aplicacion del
conocimiento y de la innovacion. Estudios metabolomicos de plantas para obtener informacion
de metabolitos presentes en cultivos. Con ello y el uso de genomica estructural y funcional
puedo utilizar esta informacion para diseñar levaduras transformadas. , (2)crecimiento
sostenible: promover una economia mas eficiente en los recursos mas ecologica y mas
competitiva. Busca no sobrepasar la oferta de un recurso de un ecosistema. Por ello se busca
mejorar la produccion primaria. (3)crecimiento inclusivo: fomentar una economia de alto nivel
de empleo que aporte cohesion social y territorial. Va en contra de la economia de petroleo,
por ello , estos ejes geopoliticos deciden los precios. Se busca la formacion de clusers
productivos de biopetroleo , moviendo la economia de la ciudad al campo. Cuando uno
promete una tecnologia tiene que verificar que esta tecnologia es reproduciible y es apta para
el mercado. Esto requiere conocimiento cientifico profundo, es decir, bajar al maximo la
incertidumbre. Esto significa que uno no puede prometer algo basado en una primera
experiencia.
• Biologia de sistemas: ¿que es un sistema? Se estudia a los seres vivos desde todos sus niveles
de organizacion. Todos tienen en comun la capacidad de organizacion de la informacion
genetica. Recordadno que el ARN es una informacion de la celula en determinada condicion.
Ademas, mas del 50% de la masa de la celula son proteinas. Ademas las diferentes proteinas
forman estructuras. En la carrera se han estudiado como se van a cuantificar esta informacion.
Esta informacion podra juntarse para construir un mapa metabolomico. A partir de este mapa
yo puedo clasificar modulos que puedan permitirme determinadas funciones (modularidad).
Una vez identificados modulos que funcionen independientemen (reduccionismo o biologia
sintetica). De tal forma que yo veo que sus enzimas no tienen regulacion compleja. Busqueda
de promotores, reguladores minimos para construir un circuito basico de gasto minimo.
Secuenciamiento: para DNA, para RNA (microarray da transcroptoma), para proteina
(proteoma por espectrometros), metabolitos ( metabolomas con resonancia magnetica). Para el
manejo de toda esta informacion es requerido el manejo de la bioinformatica. Este tipo de
 DENIS ES EL MEJOR
organismos, dado que son tan basicos, son incapaces de competir con organismos si fuese
liberado en la naturaleza. Sintesis in vitro de adn: metodo de la fosforiolita. Entonces retos del
estudiante de biotecnologia: descubrir, conocer (todas las leyes fisicoquimicas se cumplen,
conocimiento de disposicion de herramientas tecnologicas) , y crear. Esto es lo que se llama
“INNOVACION BASADA EN EL CONOCIMIENTO”. Otra labor es la de divulgacion de informacion
cientifica. Cuidarse de la pseudiciencia, pues puede traer retraso tecnologico.
• Colores de biotecnologia: (1)industrial: genera bioprocesos, nuevos catalizadores, nuevos
productos, biocombustibles. (2) agricola: mejoramiento de cultivos, biofortificacion,
biofertilizantes. (3) medica: diagnostico molecular, terapia genica, medicina personalizada,
nuevas drogas y medicinas (4) ambiental: biorremediacion, nuevos materiales, biomineria. (5)
marina: nuevos compuestos quimicos, fuentes alternativas de energia. (6) animal:
mejoramiento genetico, Sanidad, manejo reproductivo. Todo va de la mano de
“HERRAMIENTAS MOLECULARES”.

III. HISTORIA DE LA BIOTECNOLOGIA

• Principio de los anticuerpos para uso contra el cancer. Mamiferos inoculados con antigeno,
liberan anticuerpos producidos en el linfocito. Anticuerpos recuperados en el suero son
inespecificos. La idea de los anticuerpos monoclonales es que de todos podamos recuperar un
tipo de ellos. Para evitar que cumplan un ciclo de vida y mueran se inmortalizan, para ello, se
fusionan con celulas cancerigenas (por ejm del mieloma), produciendose hibridomas. Estos
crecen a gran velocidad, y a partir de ellos podremos recuperar los clones monoclonales que
nos interesan. Actualmente estas tecnicas se han mejorado identificando determinantes
antigenicos, desarrollando membranas que mejoren la liberacion. Epitofe.
• Tecnologias de secuenciamiento de adn. sintesis de nucleotidos por via quimica. Primera
tecnica de secuenciamiento era por rotura quimica. Esta fue antes de la de sanger. Mediante
agentes alcalinos , se iban rompiendo el adn a nivel de nucleotidos.
• En los años 80 aparece la primera la primera proteina recombinante. El estado se dan cuenta
que las ciencias biologicas tenian un papel en la economia. Aparece el libro llamado: “ciencias
de la vida y de la sociedad”. En este documento se coloco cuales son las contribuciones de las
ciencias biologicas, lo que hoy conocemos como biotecnologia azul, rojo, etc. A la par se
presenta el informe Spink, en donde se informaba que insumos biologicos eran posibles utilizar
en la industria alimentaria.
• Caso Chakrabarty, que es el primer precedente para que se acepte la propiedad intelectual de
M.O., el encontro cepas de pseudomonas muy utilizadas para degradacion de hidrocarburos.
Este señor junto tres plasmidos en una sola pseudomona. La controversia evaluo si esto era o
no patentable. Se considero un invento por parte de la corte suprema de USA.
• El bloque europeo da su propia definicion sobre que es biotecnologia.
• Se aprobo en europa el uso de la primera vacuna recombinante para animales.
• Se empiezan a desarrollar las primeras estructuras de arreglo de adn (microarrays). Tuvieron su
auge desde el 2000 – 2006. Actualmente son remplazados por secuenciamiento de proxima
generacion.
• Tambien en esa epoca se avanzo con el cultivo de tejidos vegetales. Llegando al conocimiento
de la transformacion en plantas con plasmido Ti recombinado. Las plantas dañadas producen
exudados. Algunos de estos envian una señal quimica como la psetil psirimona hace que la
bacteria infecte a la planta. Este pedazo de adn lleva genes de auxinas, descontrolando el ciclo
celular de la planta, generando tumores en el cuello. Actualmente se remplazan estos genes por
genes de interes, apareciendo la tecnologia de adn recombinante por A. tumefasciens.
• Se desarrollo la primera planta transgenica: tabaco con gen Bt, gen que viene de Bacilus
turingensis, que vive en el suelo, se puede propagar masivamente, liofilizar, el polvo de esta
bacteria se puede espolvorear en los campos de cultivo. Con esto se esta introduciendo una
especie invasora. Una de las limitantes , es que la viabilidad de colocar bacterias deshidratadas
 DENIS ES EL MEJOR
es baja. Otra alternativas es transferirle genes de proteinas Cry. Un mecanismo de defensa de
las plantas es producir toxinas, uno de ellas es producir genes Cry. Estos estan en altisimas
concentraciones. Estos son toxinas para lepidopteros, este cristal de la toxina se solubiliza en pH
alcalino, que es el pH del intestino de estos, causandoles hemorragias. El epitelio intestinal de
estos insectos tienen receptores para esta toxina. La primera reaccion es un desequilibrio
osmotico, luego de esto hay lisis celular, infeccion y muerte. Este gen se puede insertar en una
copia, dos o combinaciones de variantes. Al insertar este gen a plantas adquieren resistencia, a
ellas se les llama .....
• Desarrollo de la PCR por Kary Mulis, que actuamente se siguen pagando regalias para
desarrollar modificaciones. El proceso de apertura de la helice se da por calor, evitandose el uso
de helicasa. La profe empezo a preguntar conceptos basicos sobre el proceso de PCR.
• Manipulacion de embriones. Se clona la primera oveja. La diferencia con dolly, en este caso solo
se dio intercambio de nucleos. Luego se empezaron a probar celulas embrionarias diferenciadas
(blastula), surgiendo dolly. En dolly usaron celulas mamarias. Hasta ese entonces se ponia el
nucleo de otra celula mamaria. Se coloco el nucleo en un ovulo. El objetivo de hacer a dolly fue
conocer el proceso de reprogramacion de celulas madres, para pasar luego a la reprogramacion
de celulas diferenciadas.
• Modificacion del metodo de sanger con revelado radioactivo.
• Se patentan ratones recombinados que desarrollan tumores.
• La FDA aprueba la primera terapia genica en humanos en una niña de 4 años, introduciendo
celulas, no secuencias especificas.
• Sale a la venta el primer tomate transgenico producido por silenciamiento de genes. Cual es la
diferencia entre el nock out y nock down. En el primer caso, uno elimina parte del gen, de esa
manera ya no cumple su funcion , nock out es una intervencion a nivel de adn. pero si
queremos solo apagar el gen y no sacarlo del genoma usamos el nock down. En este caso se
expresara a arn mensajero, pero se interrumpe su paso a proteina, para ello se utilizan
complejos propios de la celula que hibridaran con el arn mensajero e hibridizarlo. Es decir, se
manda un arn de interferencia. Este tomate tenia maduracion retardada, es decir, con cascara
mas resistente. Durante la maduracion se produce etileno se producen pectinasas que
hablandan la pared celular.
• Se logra secuenciar el genoma de Hemophilus influenzae. Bacteria que causa la influenza
bacteriana. Esta tiene un genoma bastante pequeño.
• Se secuencia levadura S. cerevisae
• Se secuencia animal C. elegans
• Se secuencia planta E.coli
• Clonamiento de polly a partir de celulas de tejido.
• Produccion de plantas transgenicas. Produciendose el arroz dorado en este se colocaron hasta 7
genes. Este es el primer experimento de ingenieria metabolica. Se coloco un gen de sintesis de
B- caroteno. Y de los genes de las enzimas. Tambien se fortifico con fierro, para ello se necesita
transportador de Fe, se quito el agente quelante con otra enzima. Actualmente aun no hay
evidencias de efectos adversos para la salud.
• Secuenciamiento de otras plantas.
• Secuenciamiento genoma humano con metodo sanger, el genoma humano tiene 1000 000 000
pb.
• En africa producen su propias plantas transgenicas.
• Aparicion publica de la biologia sintetica en el 2010. Produccion del primer genoma sintetico de
Micobacterium mycoides, que es un genoma que toma como molde un genoma comun,
armandose mediante sintesis quimica de ADN. (paper)
• Secuenciamiento de genoma de quinua. El instituto genomico de Beiging esta secuenciando
todos los genomas vegetales.
 DENIS ES EL MEJOR
• Edicion genica por CRIPR/cas9. Es algo descubierto, un proceso natural en donde las celulas se
protegen por genomas virales. Este proceso fue descubierto en bacterias. Ellas guardan una
memoria inmune conservando fragmentos de adn viral insertado en su genoma, señalandolos
como invasores. Cuando la celula sufre el ataque viral, estos pequeños pedazos en el genoma
activan un complejo de endonucleasas que iran en busca del invasor (ADN foraneo). El RNA guia
y el activador se juntaron. Se cambiaron las memorias naturales por RNA guias diseñados y
aquellas regiones que seran intervenidas “secuencias PAM” deben estar flanqueadas por
guaninas. Este complejo introduce corte en el adn para proteger a la bacteria. Las celulas van a
querer reparar. Una opcion es por pegados de los extremos no mediados por recombinacion. En
ese caso se pueden introducir otros fragmentos. La otra opcion emplea recombinacion
homologa. Cuando el adn se rompe, se activa el complejo CRISPR/cas9. Es un tipo de knock out.
Actualmente cada uno puede diseñar su propio rna guia. Actualmente es saber si esto es adn
recombinante o no. Dependiendo del uso, se asemeja mas o no a la tecnologia del arn
recombinante, por ejm, en el caso de que quiera hacer knock in, es parecida.
• Sintesis in vitro de genoma de levaduras. Estamos hablando de genomas mas grandes en
biologia sintetica.
• Se produce morfina por levaduras desarrolladas por ingenieria metabolica. Con esta tecnica uno
puede rastrear si existe un precursor y se le puede introducir las enzimas restantes para
completar esta via. Actualmente la tendencia es que todo lo que se extraiga de las plantas, por
ejemplo de plantas medicinales, seran introducidos en levaduras.
• Antiguamente se utilizaban marcadores de resistencia, luego se usaron aquellos que al
cortarlos, se dejan de ver efectos fenotipicos.
• Se aprueba la primera terapia genica para tratar leucemia con CRISPR/cas9
• Se aprueban salmones transgenicos con gen de hormona de crecimiento. Los salmones tienen
de un ciclo de vida muy particular.
• Se conoce el primer caso de eficiion genica en embriones humanos realzdo por dr en china. Eso
esta prohibido.

PROCESO BIOTECNOLOGICO
• Los bioreactores pueden ser medios sinteticos o organismos. En el caso de organismos tenemos
plantas o animales transgenicos. Aprovechandose el control del proceso del microorganismo. El
objetivo de biotecnologia es romper la parsimonia (manipulacion genica) para hacer que el
rendimiento del proceso sea mayor. Para reducir costos ya no se usan medios sinteticos, sino se
emplean materias primas, buscando uniformidad en los lotes. Esto va de la mano de lo que pide
el mercado. Tambien es importante el control del proceso, muestreo se hacen de manera
automatizada. Tambien se tiene la etapa de salida o downs tream. A partir de aqui solo
necesitamos formular el producto. En farmacia utilizan reactores descartables para no tener
que estar esterilizando despues de cada lote. La diferencia entre un catalizador quimico y uno
biologico es que en el segundo yo requiero de las herramientas genomicas para saber si esta
reaccionando como yo espero.

BIOECONOMIA
• Economia basada en la biotecnologia que usa materias primas renovables, particularmente
biomasa y recursos geneticos para producir alimentos , productors y energia al menor costo.
• Esta economia debe tener beneficios economicos, ambientale y sociales.
• Beneficios: costos reducidos , mejor control de las propiedaddes del producto, nuevos
productos y oportunidades de mercado (desarrollo de nanosensores, nanobiotecnologia, ..),
mejor balanza comercial e independencia energetica, uso mas eficiente de la tierra: mayores
rendimientos, miniaturizacion y modularidad de las plantas de produccion. Segun el ministerio
del ambiente los principales cultivos que deforestan son el cacao, cafe y palta. Los estudios ya
 DENIS ES EL MEJOR
demostraron que la huella de carbono de la agricultura organica deja una huella de carbono
alta. Prevencion de la polucion, emisiones reducidas de gases y toxicos. Procesos de sintesis
quimica se estan cambiando por sintesis biologicas. Diversificacion y crecimiento de la
economia rural.
• Polucion y crecimiento economico con la bioeconomia. Menos contaminacion = mas
crecimiento economico = ecoeficiencia.
• Ejemplo: moleculas obtenidas a partir de petroleo. Comparado con biorefineria. Desde el punto
de vista termodinamico: el enfoque de biorefineria es termodinamicamente mas eficiente
porque en petroleo la energia de activacion es alta utilizando catalizadores y temperaturas muy
altas, en cambio los sistemas biologicos tienen enzimas que si las hacemos trabajar
adecuadamente, la ganancia energetica total es mejor. El reto es que estas enzimas deben
acostumbrarse a trabajar en otras condiciones. El costo sigue siendo bastante alto.
• La bioeconomia tiene su base en dos modelos de produccion: (1) agrorefinerias: sistemas
agroindustriales que integran actividades convenccionales y desvinculadas como la agrucutltura
, la ganaderia y procesamiento de los productos agroepacuarios dentro de una estructura
industrial, permitiendo un desarrollo conjunto, aumentano la rentabilidad agropecuaria al dar el
valor agregado requerido para incrementar las exportaciones. Basicamente es organizar bien los
sistemas agricolas. (2)biorefinerias: esquema industrial que tiene a la biomasa como materia
prima y mediante el uso de biocatalizadores en combinacion con procesos quimicos y
termoquimicos, produciria una diversidad de productos que remplazaran a los producidos a
partir de petroleo. Arpovechan azucares para producir metabolitos primarios y secundarios.
Agricultura de precision, labranza cero (dejar todo el rastrojo en lugar de removerlo). Esto no se
hace porque puede generar microclimas y pueden ser focos de insectos. Complementar
fertilizantes quimicos con biologicos (rhizobium, azotobacter).
FACTORIA CELULAR
• Empleo de ingenieria metabolica para generar un producto de interes particular.
SISTEMAS ENZIMATICOS
• Son moleculas que han evolucionado en funcion a condiciones especificas y controladas dentro de
la celula. Y como no necesariamente se van a replicar esas condiciones, hay una etapa en la que
vamos a adecuar esta enzima (evolucion dirigida) consiste en hacer un ensamblaje recombinativo.
Una de las limitantes es que se requiere un sistema robotizado dado que se evaluan miles de
clones. Las manipulaciones generalmente se hacen para mejorar termoestabilidad
incrementandose hasta 10-15°C. tambien se puede conseguir solubilidad en solventes no acuosos,
sobre todo para la produccion de biocombustibles.
 DENIS ES EL MEJOR

GENOMICA
• Estudia a los genomas de las especies respecto al tamaño, secuencia, ordenamiento, regulacion y
expresion de los genes.
• Ruta de la genomica: genomica estructural -> genomica funcional (transcriptomica-> proteomica->
metabolomica/flujomica) ¿para que se hace todo esto? Generalmente uno siempre empieza por
transcriptomica para conocer que genes estan actuando.
• Recordando principios en el metodo de Sanger. ¿cuales son las principales ventajas de la tecnica?
Es una tecnica simple. Su precision depende de que tanta procesividad tenga la polimerasa
(capacidad de ligasa de mantenerse ligada a la hebra molde, depende de las grapas, subunidad B).
con fragmentos mas largos de 5kb la probabilidad de que se complete la sintesis es cada vez menor.
La profesora empezo a analizar el histograma. En el caso de errores o solapamientos en la grafica,
que decision tomar? Esta es una de las principales limitaciones de las tecnicas. Es un limite de
precision. Esta es una de las razones por las que se busca secuenciar pequeñas regiones de 300
nucleotidos.
• Evolucion de los secuenciadores: tecnologia PacBio, arreglos de pequeños poros en la que se
detecta el tiempo que se demora en pasar. Esta tecnologia permite analizar secuencias mas
grandes de adn. tambien han salido secuenciadores de bolsillo , llamados los minion. La idea es que
sea un secuenciador de campo. Son igual o mas precisos que los illumina. Cuesta alrededor de
$3000. Puede secuenciar hasta 80 Mpb. Actualmente el que tienen mas capacidad es el Miseq de
Illumina.
• Procedimiento de secuenciamiento: toma de muestra, extraccion de ADN, pasar por bioanalizador
(mide calidad), fragmentarlo manual o ultrasonido o kits con trasnposasas, preparacion de librerias.
Esta tecnica ya no requiere uso de vectores, al molde de ADN se le incorpora un index y un
adaptador, esto permitira que se movilicen en el secuenciamiento. Este index presenta una
secuencia unica que luego permitira mapearla., ensamblaje y analisis.
• Para que secuenciamos? En el caso de las bacterias, la mitad de los proyectos tienen que ver con
aplicaciones medicas, microbioma humano, agricultura, ambiental.
• Presentacion de algunos ejemplos de secuenciamientos importantes en el laboratorio.
Secuenciamiento de papa , 3 especies de algodon,

GENOMICA FUNCIONAL
• Se toma de base la genomica estructural
• Transcriptoma: se comparan situaciones para ver que ocurre en grupo control y experimental
(expresion diferencial de genes) y algo muy importante en la transcriptomica es la regulacion global
de genes.
• Proteomica: puedo identificar proteinas glicosiladas , complejos de proteinas. Si uno tiene el
conocimiento de las proteinas, esto permite un mejor estudio de la estructura o funcion de la
proteina.
• Metabolomica: identificar metabolitos, que modulos del metabolismo estan activos.
• Flujoma: analisis cinetico del metabolismo.
• Bioinformatica: todos estos analisis requieren de una plataforma informatica para ordenar e
interpretar estos datos.
• Aporta tambien a la ing. Genica, evolucion dirigida, diseño de factorias celulares, plantas
recombinantes, identificacion mas precisas de especies mediante codigo de barras, taxonomia
molecular.
 DENIS ES EL MEJOR

TRANSCRIPTOMA
• Con el genoma tengo las secuencias estan presentes en una celula (composicion de genes,
codificantes, no codificantes, secuencias reguladoras). La importancia es que puedo utilizar los
genes como bloques de construccion para diseñar organismos recombinantes. Por homologias
puedo generar primeras aproximaciones de las funciones de ciertos genes. Entonces, a partir del
dato de secuencia encontre in-silico (herramientas bioinformaticas) tengo las posibles funciones.
• Transcriptomica analiza la informacion de secuencias de transcritos de una celula. Produccion de
RNA mensajero, RNA ribosomal abundante, microRNAs (regulacion postranscripcional), RNA de
longitud larga. En principio, tras la extraccion de los transcritos de una celula se observa que genes
son los que la celula esta utilizando mas abundante, tipos de reguladores, en que medida la celula
esta usando regulacion postranscripcional. EL transcriptoma es lo que se llama como una foto del
momento de una celula. Por ello, es muy importante cual es la condicion en la que nosotros
colocamos a la celula. La transcriptomica compara condiciones entre un grupo control y grupo de
trabajo.
• Una de las primeras tecnicas es el Northern Bloth, separando por electroforesis. Para ello uno tiene
que tener idea de que gen es el que esta buscando en la celula. Es una tecnica semicuantitativa,
dado que softwares de analisis de imagenes nos pueden proporcionar datos de intensidad de color.
Otra tecnica es la de Differential display, que compara dos poblaciones de transcritos. La primera
etapa pasan el RNA a DNA copia empleando cebadores poli T o hexamericos, transcriptasa reversa;
y a partir de eso se hace la amplificacion por PCR. Se hace el marcaje de la condicion A y B, y se
hace una corrida electroforetica en geles largos que permitan que los amplicones migren mas.
Cuando evaluo en el gel y veo secuencias presente en una condicion y ausente en otra, se puede
asumir que son respuesta de la condicion especial. Otra forma es mediante RT-PCR, el principio es
similar, comparas dos condiciones, en este caso dos sistemas de cultivos con expresion diferencial
de una enzima, para ello se paso a RNA copia y se hace amplificacion por PCR y se detectan las
diferencias. Las intensidades se podia identificar mediante un software de analisis. A partir de los
años 2000 aparecen las tecnicas de analisis masivo, porque antes siempre se dependia de poder
sintetizar los cebadores, es decir, conocer las secuencias, y solamente s epodian esocger
determinados genes. LA tecnica de los microarreglos permitira hacer un mapeo masivo de todos los
transcritos, la siguiente tecnica es la RNAseq. Estas tecnicas son utiles siempre y cuando el error
experimental sea minimo. Todos los resultados que vienen del secuenciamiento masivo debe ser
validado de todas maneras por RT-PCR. Los microarrays, su principal limitacion era el precio,
porque uno tenia que mandar a hacer los microarreglos y alli uno podia correr hasta cuatro
experimentos. Estos microarrelgos son laminas de vidrio con una plataforma central donde se van a
inmovilizar secuencias de un genoma. Para esta tecnica es necesario el conocimiento previo del
genoma y a partir de este se diseñan sondas. Normalmente de toda la longitud de un gen , uno
puede escoger tres sondass diferentes, de tsl manera que para cada gen se requiere de tres sondas.
Ademas se deben conocer las secuencias de los genes HouseKeeping, que permitiran normalizar la
fluorescencia. El principio es uno rescata los RNA de la celula, los paso a DNA copia, en ese proceso
se hace un marcaje por fluorescencia. Uno podia escoger marcar todos sus genes con un solo color,
o colores diferentes. Aqui se podra detectar si un gen esta sobreexpresado, su señal de
fluorescencia sera mayor. La sonda por complementariedad hibridara con alguna de las secuencias
del microarreglo y fluorescera. Mediante un software uno sabra las secuencias, posicion y la
intensidad. Mediante la posicion sabre que gen se esta expresando y con la intensidad que nivel de
expresion tiene. Hay genes que son neutros y simplemente se mantiene una expresion indiferente.
La tarea final es mediante bioinformatica, dado que tendremos una tabla con genes de alta , baja
fluorescencia. Uno puede hacer un corte estadistico en funcion del nivel de significancia, por ejm,
altos niveles de significancia alta permitira ser mas estricto. Luego se tiene que hacer una
normalizacion que permite limpiar aquellas respuestas que son falsas positivas, y el otro analisis es
la significancia biologica (Fold change) que nos da idea de cuantas veces mas se esta expresando un
 DENIS ES EL MEJOR
gen. Por ejm si un gen esta expresado 4 veces mas , estara en una significancia biologica entre 2 y -
2, dado que esta ern funcion de logaritmos. En el eje de significancia estadistica , los que esten mas
alejados y mas arriba son los que estadisticamente tienen mas diferencia estadistica. Se valida est
informacion tomando al azar aquellos genes mas representativos y se hace PCR de tiempo real. De
este tipo de estudio salen genes candidatos para una condicion. Mediante bioinformatica , uno
puede llevar estos datos a una grafica de ontologia, y el software nos votara los genes que estan
participando en determinada condicion metabolica. Otra forma de hacer un analisis global es
mediante un grafico de Ven, que muestra en la interseccion genes neutros que no tienen que ver
con la respuesta. En las intersecciones entre dos conjuntos es similar pero especificos por pares de
condiciones, y los mas interesantes son los que estan solos en cada conjunto. De toda esta
informacion, podremos conocer como se estan comportando genes que tienen que ver con cierta
condicion en una ruta determinada. Lo siguiente que debo hacer es probar en que medida esta
expresado este gen, entonces, el ultimo paso es ver que pasa si anulo o silencio este gen (nock out
o nock down). Estos son ya experimentos de hacer mutantes o silenciamientos. La ventaja de los
microarreglos es que cada gen esta representado por tres sondas, ya que son varias respuestas por
un mismo gen, siendo estadisticamente es adecuado, siendo la principal limitacion es el costo. La
siguiente tecnica que surgio es secuenciamiento RNAseq, estrictamente lo que se secuencia es el
ADNcopia. Se construye una libreria. Se utiliza bastante para splicings alternativos (en el proceso de
retirar intrones de RNA. En el proceso de cortar los intrones me genera un transcrito maduro
diferente, debido a posibles variaciones. Un ejemplo es el caso de las isoenzimas) , expresion de
genes, fusiones genicas. Mucha de la certeza de esta informacion esta relacionada con el empleo de
pequeños moldes y que tan bien se pueda hacer el ensamblaje. El ensamblaje se realiza empleando
moldes previos evaluando genomas de referencia. Si no se cuenta con esa data, se debe hacer un
ensamblaje de novo, utilizando un genoma de una especie que sea filogeneticamente muy cercana.
Entonces primero se hace ensamblaje, alineamiento y calculo de expresion. Entonces se pasa el
RNA a DNA copia, luego se utilizan kits de Illumina que emplean transposasas para hacer cortes,
convirtiendo nuestro transcrito en varios pedacitos. Mediante PCR se le coloca adaptadores a cada
pedacito y a cada adaptador se le colocara un index. Los adaptadores permitiran que estas
moleculas puedan inmovilizarse en la matriz de secuenciamiento y los indices son secuencias unicas
que no pertenecesn al gen pero permitiran determinar la posicion exacta del amplicon, es como el
etiquetado de cada secuencia. Se puede escoger hacer amplificaciones de ida y vuelta, de un
sentido, dependiendo del kit y recursos que tengamos. Para cada amplicon luego generaremos sus
perfiles de expresion. Dependiendo de la cantidad obtendremos una intensidad de fluorescencia.
Mediante analisis bioinformatico ordeno los amplicones mediante secuencia e index, habiendo
genes con mas cantidad de lectura, genes con casi nada de lecturas, y alli podremos detectar genes
que se estan sobreexpresando, en las diferentes condiciones. La ventaja del RNAseq es que es mas
barato y si hay duda, se puede replicar muchas veces en comparacion con microarray. Existen otras
tecnicas clasicas de analisis mas especifico, ya no masivo, como es la inmuno precipitacion de
cromatina, consiste en buscar en una poblacion de transcritos los complejos ADN-proteina. Estos
complejos de regulacion son momentaneos y esa union es reversible. Para poder estabilizar el
complejo y hacer que se mantenga pegada hasta detectarla, se hace un crosslink de ADN,
agregando un agente quimico que establece enlaces covalentes. Una ves que se hace el crosslink,
se somete el ADN a estres mecanico (ultrasonido), fragmentandose, para poder separar el complejo
de todo el resto de la molecula. Y luego mediante un anticuerpo especifico, detectare a la proteina.
Por supuesto primero se tiene que identificar una proteina candidata a regluador, se produce el
anticuerpo y luego se rescata de la poblacion de ADN. Luego se retira la proteina, se amplifica por
PCR, luego se secuencia y obtendremos el punto especifico a donde se pega esta proteina
reguladora. Esto se puede hacer en forma de microarrays tambien, empleando los pedacitos
amplificados como sonda, marcando por fluorescencia, observando en que otra parte del genoma
esta presente esta misma secuencia. De esta manera sabremos que genes estan regulados por esta
misma proteina, a esto se le llama chips de ADN de inmuno precipitacion.
 DENIS ES EL MEJOR

PROTEOMICA
• Disciplina que se encarga de separar y analizar todas las proteinas presentes en una celula. Que tipo
de infiromacion puedo sacar? Presencia o ausencia de determinadas proteinas, discernir si hay
proteinas glicosiladas, determinadas isoenzimas, si lo integramos con trancriptomica podemos
hacer estudios de la regulacion postranscripcional, podemos ver la formacion de complejos
proteicos podremos tener informacion sistematizada de las probables vias metabolicas implicadas.
• Tenemos varias maneras para separar proteinas, por ejemplo por electroforesis las separamos por
peso molecular, conformacion y carga por ejemplo electroforesis 1-D, con la cual podemos ensayar
western blot. Otra tecnica es electroforesis 2-D, se le da al gel un gradiente de pH permitiendo que
la proteina migre hasta que llegue al pH en el que llegue a su punto isoelectrico, para ello se
necesita un alto voltaje que se va ascendiendo paulatinamente; por masa tambien son separadas.
Actualmente se utiliza mas la electroforesis capilar, que es manualmente es mas sencilla. El capilar
determina el tipo de separacion. Otra técnica puede ser MALDITOF.
• Lo primero que debo determinar es que nos interesa analizar, la proteina cellar, la proteina
secretada. Si es que nos interesa la proteina intercelular, hay que ver que tipo de proteina nos
interesa capturar: una soluble en el citoplasma o una asociada a organelos. Lo mas facil es con
proteina citosolica. En el caso de proteinas de membrana se emplean detergentes. Lo primero que
se hace en general es romper la celula, someter el tejido a bajas temperaturas con nitrogeno
liquido, golpearlas y recien alli se da el paso de lisis quiimica o enzimatica. Un paso critico es
mantener la solubilidad de las proteinas. Para ello se emplean agentes reductores que romperan
los puentes disulfuro en la estructura terciaria. La idea es que la proteina este completamente
soluble si es que optamos por una electroforesis 2-D. si hay sales, los que migraran son las sales,
por ello es muy importante el desalado. Luego se emplea espectroscopia de masas para identificar
las proteinas por la relacion entre masa y carga. Tambien se necesitan bases de datos para
comparar los patrones obtenidos.
• La electroforesis 2-D, comparamos dos condiciones. Esto se puede hacer manual o mediante
software. Esto para ser confiable se requiere tener 3 o 4 replicas. Una vez identificados los puntos,
con un sacabocados, se saca un punto y se somete a digestion. Se puede hacer marcaje
convencional (plata) o fluorescente. Lo que se obtendra luego es un patron de masa carga. Este
patron se debera blastear. Los picos azules son aquellos que tienen mayor homologia en masa y
carga. De acuerdo al grado de similitud tendremos proteinas hipoteticas, putativa o homologa.
• Se pueden emplear arreglos de proteinas. Con informacion previa podemos inmobilizar
subunidades proteicas y enfrentarlo con una proteina marcada fluorescentemente de tal manera
que ocurra una interaccion, que puede ser capturado en un software. Tambien existe el marcaje
radiactivo que no es muy usado, se emplea una kinasa para fosforilar con una marca radiactiva.
Tambien hay ocasiones en las que la molecula que interacciona con la proteina es mas pequeña,
por lo que es mas complicado que nos de una buena señal, por eso se pueden hacer entonces
arreglos usando vehiculos como la BSA, aqui podemos hacer ensayos de inhibicion competitiva.
Ocurre siempre que en los estudios de genomica funcional nos conformamos con ver si los genes
estan activados o desactivados, siempre es necesario hacer una separacion al menos electroforetica
para verificar si hay una corrrespondencia entre los transcritos y la proteina sintetizada.

METABOLOMICA
• se extrae en funcion a las caracteristicas como solubilidad, volatilidad, carga. La tecnica mas usada
son las cromatografias de gases (moleculas volatiles), HPLC. Tambien se emplea electroforesis
capilar. Una vez separados, se procede a identificar. Esto se hacer mediante espectroscopia de
masas. El tiempo de vuelo nos dara una primera aproximaciona la estructura. Un equipo mas
comodo es por resonancia magnetica nuclear, la desventaja es que aqui hay que tratar las
 DENIS ES EL MEJOR
meustars con isotops, util mas en el sector farmaceutico. Otra tecnica basica es la espectroscopia
infrarojo.
• La idea de la metabolomica es capturar el metabolito en una determinada condicion celular.
Entonces si juntamos genomica, proteomica y metabolomica se tendran modelos insilico del
comportamiento celular.

NOCK DOWN (proceso de RNA transferencia)

El knock out no siempre es la tecnica mas adecuada porque cuando uno inserta un gen, muchas veces se
termina silenciando otros genes aunque no se haya interrumpido la secuencia. Por ello es mas
recomendado el nock down. Como hacer un silenciamiento? Por ejemplo , para silenciar reguladores de
celulasas, vamos a escoger del gen que nos interesa una porcion del tallo. Por pcr amplificamos una
pequeña porcion 100-200 pb. En este proceso se necesita transformar a la celula.

EVOLUCION DIRIGIDA
Simula rapidamente lo que ocurrio en la evolucion (cambios espontaneos, recombinaciones). Estas son
seleccionadas. En una primera etapa tecnologica lo que se hizo es hacer que estas mutaciones espontaneas
ocurran a una frecuencia de 10-9, 10-12. En la seleccion dirigida se aumenta de mutacion mediante cruces
dirigidos, mutaciones al azar. Esto ha permitido generar muchas de las variedades agricolas. En el caso de
la agricultura, uno puede generar variantes (genes imericos o parches) y ver el comportamiento de estas.
Esta tecnica nacio frente a la demanda de las empresas por enzimas que sean altamente resistentes a
condiciones industriales, como el hecho de buscar en la naturaleza puede tomar un tiempo, a partir de los
genes existentes generar variantes en el laboratorio. En una celula a partir de 20 aa puedo generar
multiples combinaciones dependiendo del tamaño. estas combinaciones se han ido seleccionando
mediante evolucion. A partir de estas secuencias que han coevolucionado para la evolucuon se puede
hacer una segunda ronda evolutiva.
Tenemos un gen y buscamos todos los genes que tengan la mismas secuencias. Se realiza reemsamblaje
recombinativo, mediante intercambio de regiones de estos genes obteniendo genes parchados llamados
genes quimericos. La tecnica es altamente dependiente de un robot que pueda hacer el tamizado de los
clones (son miles de variantes) esta es la limitante para masificar esta tecnicas. Como hacer para que al
polimerasa se confunda mas? Haciendo lo contrario de lo que se hace en un PCR normal. Otra forma es
mediante reensamblaje recombinativo.

DNA Shuffling

INGENIERIA METABOLICA
Aplicacion de todas las omicas. Importante porque si identifico que vias metabolicas me incrementan la
produccion de un producto. Por ejemplo ahora se producen con levaduras todo. Entonces ese es el
principal objetivo de la ingenieria metabolica. Por ejemplo emplear un M.O. que pueda sintetizar un
precursor de acido ascorbico (vit C). buscar cual de las enzimas son mas eficientes. Corinbacterium hace el
paso siguiente, que transforma este precursor a vit C. entonces el objetivo es probar difernetes organismos
para la produccion final y natural de determinadas sustancias que tienen fuente sintetica. La importancia
de estudiar las rutas metabolicas de distntos organismos es que yo puedo tener quizas por microbiologia
aplicada un organismo capas de producirme un colorante, pero quizas si yo alterase la ruta metabolica de
otro organismo, la produccion seria mayor y el gasto menor.

FACTORIAS CELULARES
No empleadas para liberarlas al ambiente. Se emplean solo en la industria. La idea de una factoria celular
es que: sea no patogenica, sana para el medio, muy versatil (con modulos enzimaticos diversos), que
genere multiples productos. La factoria tiene que estar caracterizada genomicamente, debe tener su
estudio de genomica funcional. Por el lado experimental, tiene que ser celulas facilmente transformables,
 DENIS ES EL MEJOR
que puedan expresar adecuadamente constructos, que tenga terminadores compatibles. Normalmente
una celula que esta muy manipulada, si por algun motivo saliera al medio , por su naturaleza misma es
menos competitiva.

Empleo de factorias para producir yogurt sin fermentacion lactica, plastico polilactico .
Una primera etapa es el desarrollo in vitro de la planta. Es necesario hacerles un perfil metabolico y
correlacionar estos metabolitos con las propiedades de las plantas. Con esto tendremos descubrimiento de
genes candidatos de sintesis que permiten entrar a la etapa de cultivo. Una primera alternativa es que
estos genes sean colocados en forma multicopia en los cultivos celulares. Los cultivos vegetales tienen
velocidades de crecimiento diferente al de los microorganismos. Si bien este proceso es posible hacerlo, es
bastante largo, entonces el precio del metabolito debe justificar el poder realizar todo este proceso. La
otra alternativa es buscar plantas de crecimiento mas rapido. La idea de hacer factorias celulares de
levaduras es hacer que estos sean mas accequibles. Por ejemplo hacer que plantas o levaduras produzcan
elementos utiles para la industria farmaceutica. En lugar de avocarnos a extraer sus principios activos
deberiamos centrarnos en estudiar su metabolomica.

CICLO DE LA BIOLOGIA SINTETICA

Todo esto va de la mano con el estudio de la biologia sintetica. En la sisntesis quimica aun se usan como
molde los cromosomas que estan presentes en la base de datos. El primer genoma sintetico fue
micobacterium micoides. Este genoma se sintetizo en pedacitos que se pegaron. Este pegado se hace via
levaduras. La idea es hacer oligonucleotidos de 100pb. Luego se pegan unos con otros para genera
pequeños casettes de 1kpb. Estos se introducen en la levadura. Finalmente dentro de la levadura se
ensambla todo el cromosoma. Se extrajo a una cepa de micobacterium su cromosoma y se inserto este
sintetico. Con esta tecnica se han logrado construir cromosomas de mayor tamaño. En sacaromyces se
partio sintecis de fragmentos de 70pb. Con pcr se construyeron bloques mas grandes de 750pb. Estos
fragmentos se colocan en una libreria. Una de las primeras factorias que se desarrollo es para la
produccion de Artemisinina. En el proceso se modificaron enzimas, algunas se mejoraron, otras fueron
bloqueadas, de tal forma que se logro formar esta molecula. Esto causo que el precio se reduciera hasta 10
veces. Tambien empleando levaduras se pueden sintetizar aceites esenciales empleados para perfumes.
Tambien se pueden producir combustibles como butanol, isoprenoides, polihidroxialcanoatos (produccion
plasticos), policetidos (antimicrobianos-anticancerigenos), lipidos (AG poliinsaturados-esteres de AG). Una
molecula fundamental a partir de la cual pueden surgir diferentes vias es la Acetil CoA.

Ver si la regulacion sera via sustrato, via medioambiental, via metabolito, via inductor heterologo. Otro
aspecto importante es la colocalizacion de las enzimas. Se puede hacer un scaffold asociado a la membrana
para identificar las enzimas asociadas a la via. Se puede utilizar un compartimento en la levadura para
juntar las enzimas o se pueden juntar las enzimas via linkers lo que genera una fusion de proteinas.
Otro aspecto importante es la optimizacion del sitio activo para mejorar la afinidad, tambien la
optimizacion para mejorar la afinidad al sustrato (constante de afinidad por el sustrato). Otra cosa
importante es que tenga una tasa de recambio bastante alta para evitar que se saturen los sitios activos.
Otra propiedad importante es que tenga estabilidad. Tambien que sea resistente a la inhibicion. Todo esto
se trabaja a partir de la secuencia codificante de la enzima. Para escoger las enzimas todavia se utilizan las
bases de datos. Otra tendencia de la biologia sintetica es que sus genomas sean minimos, se van
reduciendo los cromosomas para que queden estructuras minimas con el fin de evitar el gasto energetico
de la replicacion. Por ejemplo en Aspergillus se redujo el cromosoma 7 en un 24%. Este hongo produce
amilasa. Se duplico la produccion de amilasa. La profe esta apoyando en el diseño de una factoria celular
de levadura insertando genes por recombinacion in vivo. En los extremos de cada gen esta colocando
puntos de union secuencial entre estos genes de tal manera que al ingresar tome la estructura de interes.
 DENIS ES EL MEJOR
En los extremos estan colocando regiones homologas que le permitan ubicar el fragmento en el genoma.
Ademas hay mas cositas que no apunte.

Tambien se esta desarrollando biosensores, armando circuitos muy simples que generen respuestas
visibles utilizando una o dos enzimas. Normalmente tenemos la secuencia seña (ligando)l, modulos de
transduccion (receptores del ligando) y que activaran al modulo sensor y generara una respuesta. Entonces
tenemos un modulos transductor, uno de sensor y uno de respuesta. Para esto podemos utilizar algunas
enzimas optimizadas. Se puede colocar el modulo sensor en varias copias dentro e la celula. Se pueden
utilizar tambien reacciones que se hacen utilizando lizados celulares. A partir de toda esta informacion es
que se ensamblan los biosensores. La mayoria usa una señal fluorescente. Estos son empleados para
detectar presencia de cocaina en este caso esta seria el ligando. La ventaja de estos sensores es que uno
tiene la respuesta inmediata.

Otra tecnica que se esta utilizando bastante es la edicion genica. Este es un mecanismo natural. Introduce
cortes dirigidos en adn doble hebra para actiar mecanismos de reparacion. Consiste en el uso de nucleasas
rediseñadas para cotar , introducir o modificar secuencias en los genomas, obteniaendose insercioens,
deleciones o cambios en la secuencia de nucleotidos en forma dirigida. Herramientas usadas en la edicion
genica: Zinc Finger nucleasas, CRISPR/cas,,.. la diferencia entre ellos es la forma en como reconoce los
complejos, el tamaño de complejo que forma, los mas versatiles son CRISPR/cas. Porque la edicion
genomica puede convertirse en una tecnologia? El complejo accedera al genoma y hara un corte. Pueden
ocurrir dos cosas: que uno haya diseñado el ADN guia para que llegue al genoma y lo corte; o dependiendo
del organismo pueda ocurrir recombinacion homologa o no homologa. En el caso de que se peguen
pueden ocurrir adicion de algunos nucleotidos o represion de algunos, generandose un nockout. Si en el
entorno donde se produjo la rotura, puede que esta secuencia sea pegada junto con los extremos rotos
(knock in) que es la introduccion de un gen por recombinacion no homologa. Esto ocurre principalmente
en bacterias y hongos filamentosos. La otra forma es la recombinacion homologa con un molde que
contenga el gen de nuestro interes. Como funciona? En el caso del crispr/cas, las zonas blanco (donde se
cortara) tienen que estar presentes secuencias PAM que son secuencias de 3 nucleotidos que tendran al
menos dos guaninas. Estas deben estar adyacentes a la zona que nos interese intervenir. Nuestro RNA
debe reconocer por complementariedad 20nucleotidos del gen blanco y minimanete 12 nucleotidos
(secuencia semilla). En el sistema convencional, este RNA guia debe ser activado y recien cuando se
ensambla el ARN activado por la nucleasa, se ubica por complementariedad con la secuencia semilla.
Luego se transformara la celula con un vector que tenga la secuencia del rna guia. Una vez los vectores
dentro de la celula y expresados, se armara el complejo y este buscara dentro del genoma el sitio de corte.
Normalmente se escogen genes que nos den caracteristicas visibles o auxotrofia. En el caso de hongos
filamentosos se bloquea un gen de sintesis de pigmentos. O si se interviene un gen de sintesis de aa se
recuperan en medios minimos. Todo esto es como una mutacion sitio especifica.

EDICION GENICA SIN USO DE VECTORES, en terminos de regulacion el introducir vectores genera
controversia. Entonces ya no se usa la transformacion clasica , sino que se busca es introducir el complejo
RNAguia-enzima. Uno puede mandar a sintetizar su RNAguia y hacer sintesis del complejo. Se puede
utilizar una celula (E.coli) para producir el RNA y el CAS9 (si es que uno mismo lo quiere hacer) y luego
ensamblar el complejo. Este complejo se va a introducir via transformacion a la celula. Esto se esta
utilizando generalemente en celulas animales. En el caso de plantas y hongos se requiere todavia emplear
protoplastos para hacer la introduccion del complejo. Esto se hace para evitar que las plantas sean
consideradas como plantas transgenicas.

BIOLOGIA DE SISTEMAS
Proceso mediante el cual abarco la mayor parte de informacion, la proceso y simplifico. Es un enfoque
interdisciplinario (biologia, informatica , ing.sistemas). esto se emplea para la etapa de produccion.

CAPITULO 3
 DENIS ES EL MEJOR
Agricultura de precision. Permitira cantidad de agua en el suelo, concentracion de minerales, pesticidas.
Sabiendo tambien en q momento debo regar. El uso de fertilizantes asociado a la cantidad de nutrientes
disponibles. Tambien promueve buenas practicas agricolas. Uso de fijadores biologicos de nitrogeno.
Manejo integrado de plagas. Tambien se promueve el uso de plantas modificadas geneticamente.

CADENA AGROINDUSTRIAL
Produccion y productividad: Trabajando primero sobre la calidad genetica de la semilla, calidad sanitaria y
la multiplicacion de la semilla. Provision de nuevos fertilizantes y pesticidas de origen biologico. Obtencion
de nuevos productos y variedades.
Cosecha –postcosecha: debe asegurarse la conservacion del producto (infeccion por hongos productores
de micotoxinas), en el caso de alimentos procesados, mediante tecnologia enzimatica y que estos sistemas
de procesamiento no sean dañinos para el medio.
Distribucion y comercializacion

Nuestro pais tiene dos tipos de agricultura: en costa es de alta tecnologia, acceso al mercado,
principalmente de exportacion, productores con acceso al credito, sector mayoritario 80% son sistemas de
agricultura familiar, autoconsumo, agricultores que no tienen acceso al credito ni tecnologias modernas.
Por otro lado en el peru la tierra cultivable es 4 millones de ha. Por persona en los ultimos años esto
disminuyo a 0.09 ha por persona. Cual es la solucion? Que sigamos aprovechando las hectareas cultivables,
el problema es de donde sacar mas tierras. En el caso de los cafetaleros de la selva. Lo otro es utilizar la
misma tierra haciendo que el rendimiento se incremente en 20%. Por ello se justifica para los principales
cultivos las plantas geneticamente modificadas. Por otro lado tenemos algunas situaciones criticas en
muchos de los cultivos, por ejm. En las papas esta el gorgojo de los andes, la rancha, la verruga de los
andes, las heladas.

RUTAS PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO

Fitomejoramiento clasico (mutaciones), mejoramiento asistido por marcadores, TILLING y ECO-TILLING,
ingenieria genomica (seleccion genomica o RNA de interferencia (silenciamiento de genes)), tecnologia del
ADN recombinante, edicion genica. Fitomejoramiento consiste en el empleo de radiacion X o gamma para
generar mutaciones. Muchas de las variedades de cebada de la universidad usaron esta tecnologia. El uso
de marcadores moleculares para asociar caracteres de interes con secuencias en el genoma, sobre todo
cuando no se tienen datos muy precisos sobre el gen y su funcion o en el caso de que una caracteristica
dependa de la expresion de mas de un gen. El TIPPING era usado para inducir a mutacion a una poblacion,
pero luego la seleccion se hace mediante secuenciamiento, seleccion de variantes geneticas. ECOFINDING
prescinde de mutaciones y trabaja a partir de variedades naturales. Las plantas transgenicas pasaron por
diferentes generaciones (con resistencias , mayor crecimiento, rendimiento, tasa de fotosintesis; plantas
con mejor calidad nutritiva; plantas con usos farmoquimicos; plantas productoras de compuestos
quimicos; resistencia a factores climaticos). La principal produccion agricola es de soya, maiz, algodon y
canola. Multiples paises de sudamerica ya producen transgenicos, paises megadiversos tambien producen
transgenicos. Se redujo la emision de CO2. Se mejoro el status de vida de pequeños agricultores.
Paralelamente la edicion de genes a ganad terreno.

OBTENCION DE NUEVAS VARIEDADES

El hombre primero selecciono mutantes naturales, se hicieron cruces dirigidos, mutaciones inducidas,
cruces interespecificos, ingenieria genetica, edicion genica.
 DENIS ES EL MEJOR

CAPITULO 3: BIOTECNOLOGIA AGRICOLA

Papa desarrollada con resistencia a polilla. Con el surgimiento de la moratoria, se generaron multiples
trabas. En esta se hizo insercion del gen CrylA. Otro ejemplo es el de resistencia a virus de la yuca. Se le
introdujo proteina de resistencia y RNAs de resistencia portando el genoma del virus. Caso papa fortuna
resistente a la rancha. Se uso dos genes de resistencia con sus elementos reguladores nativos. Se
introdujeron los genes via transformacion mediada por Agrobacterium. Lo que hace resistente a la papa es
una resistencia localizada. Despues de la penetracion de Phytophthora Infestans va a generar una señal
que terminara en necrosis localizada. Luego esto se propaga en el resto de la planta. La variedad
convencional requeria hasta 22 aplicaciones, en cambio la transformada solo requeria 2.
Caso tomate resistente a Xanthomonas mediante gen Bs2 de la pimienta. Otro grupo de plantas que estan
desarrollandose bastante son aquellas en las que se esta buscando mejorar la calidad nutritiva. Uno de los
primeros cultivos desarrollados fue el tomate morado que logro acumular 7 veces mas contenido de
antocinania que el tomate en cultivo tradicional y 8 mas que en producido organicamente. El caso de la
piña del monte Rose, Desarrollado con fines comerciales. Se sabe que para este cultivo se trabajo
sobreexpresando el gen Psy (precursos de la sintesis de B caroteno). Se hizo el silenciamiento de dos
genes. Es una piña con alto contenido de antioxidantes. El caso de la manzana roja con alto contenido de
antocianina por itnroduccion del factor de transcripcion MYB10.
En la mayoria de los casos se usan los genes de Agrobacterium. Pero este no es eficiente en todas las
plantas. En monocotiledones no funciona. Para ello se emplea la biobalisitica. Se parte de un embrion
maduro, se le retira el pericarpio y se escogera aquellos de 0.5 mm. Se los deja en un medio de produccion
de tallos. En este medio se coloca una sustancia autropica que genere condiciones hiposmotica. Luego se
bombardea con pequeñas particulas de oro que penetraran al nucleo e integran en el cromosoma. Otra de
las herramientas que se puede utilizar es la evolucion dirigida. Esto es lo que ocurrio con las plantas
resistentes al glifosato. Estas son aquellas a las cuales se les ha incorporado este gen. Actualmente el
glifosato se usa como herbicida. Otro de los objetivos es generar resistencia a factores ambientales
(temperaturas extremas, suelos salinos, sequias...) por ello se busca encontrar genes de resistencia contra
estas condiciones. Para la respuesta a stress se tiene una primera etapa en la que actuan receptores de la
señal. Luego proteinas que envina la señal a la membrana. Estas proteinas activan una cascada de
proteinas que se dirigen al nucleo, activando un conjunto de genes. Por ello primero hay que hacer la
busqueda de todos los receptores implicados. En la expresion genica es fundamental buscar los factores de
transcripcion y finalmente evaluar el metabolismo. Ante el estres siempre hay respuestas de la planta. Por
ejemplo, la trehalosa es un protector contra muchos stresses ambientales. Es sintetizada en un proceso de
2 pasos en levaduras. Zygosaccharomyces rouxii es una de las levaduras mas altamente osmotolerante ,
especialemnte a la sal. Otra prueba que se a hecho en plantas fue la modificacion de plantas de algodon
para generar fibras semisinteticas. Sabemos que al momento de hacer las fibras de vestir se mezclan con
una cantidad de polyester, porque cuando son 100% algodon se deforman normalmente. Los poliester se
pueden hacer de polihidroxibutirato de pseudomonas, el gen que produce este poliester procede de una
bacteria. Tambien se busca genes para la sintesis de algodon ya teñido. Transgenesis para la mejora
nutricional. A esta planta se le apilaron 7 genes. Se queria generar b caroteno, vitamina A, fierro. Muchas
plantas tienen como precursos el GGPP. El arroz no tiene esto. La idea era colocar enzimas tomadas del
narciso, y se observo que el arroz producia phytoeno y B-caroteno. Luego se busco simplificar la via, se
remplazo estas enzimas por uno solo. Finalmente con solo 3 genes se producia la provitamina A.
Plantas como bioreactores. Tambien expresion de antigenos potenciales para vacunas en plantas. Las
plantas son consideradas buenos candidatos para la produccion de proteinas recombinantes. La cantidad
de proteinas que se han logrado obtener con ellas es bastante. Los microorganismos tienen problemas con
 DENIS ES EL MEJOR
la produccion de proteinas grandes. Otra de las cosas para lo que puede servir la biotecnologia es la
sintesis de semillas sinteticas. La micropropagacion de plantas es otra tecnica.

Cross breeding:
La fusion de protoplastos ha sido empleada en la generacion de variedades. Es particularmente util para
transferir caracteristicas genenticas de una especie a tora y deonde la recombinacion sexual no es posible.
En el proceso se pueden colocar marcadores de resitencias. Se pueden conseguir resitencia a
enfermedades mediante esta tecnica. Por ejemplo resistencia a tizon tardio o insectos.
Existe toda una rama de produccion de biocontroladores. Estos son organismos que estan capaces de
actuar en una o mas etapas del proceso de produccion de un patogeno por lo tanto lo detienen. Los
hongos son los que mas perdidas generan. Etapa de colonizacion e infeccion del tejido, propagacion en el
teijdo. Bacilus da resistencia a plagas, otro grupo son controladores de hongos, de virus y nematodos. En el
caso de hongos controladores se utilizan las esporas. Por ejemplo aplicacion del biocontrolador
Gliocladium catenulatum a las semillas al momento de la siembra, seguido por la inoculacion del patogeno
Pythium. Una de las pruebas para ver si hay control es la prueba del antagonismo colocando el patogeno
en la placa. MECANISMOS DE ACCION DE LOS BIOCONTROLADORES: se sabe que los hongos secretan
antibioticos, enzimas, pueden actuar por parasitismo en el patogeno, competencia por nutientes y sitios de
infeccion, interferencia con factores de patogenecidad, resistencia inducida en la planta hospedera. Todo
esto genera inhibicion del crecimiento del patogeno, destruccion de hifas y esporas y desarrollo reducido
de la enfermedad. Se debe tener en cuenta que el organismo que se libere al ambiente no debe tener
efecto adverso sobre los usuarios. RESPUESTAS DE LA PLANTA EN PRESENCIA DEL PATOGENO: produccion
de elicitadores, produccion de compuestos señalizadores, colonizacion de tejidos, produccion de
sustancias promotoras de crecimiento. Induccion de respuestas de defensa en la planta, estimulacion del
crecimiento de la planta. Desarrollo reducido del patogeno. Otros mecanismos de defensa: movilizacion
de iones, necrozar las celulas infectadas. La planta empezara a reforzar la estuctura de su pared, inducir
sintecis de metabolitos secundarios, proteinas de resistencia. Todo esto es una respuesta generalizada de
la planta. Muchas plantas pueden tener la primera respuesta pero siguen siendo susceptibles porque no
logran desarrollar la respuesta. BIOFERTILIZANTES: aquellas bacterias que fijan nitrogeno mediante
mecanismo de simbiosis de las plantas con nodulos en las raices, bacterias que fijan nitrogeno de forma
libre como azotobacter, simbiosis de raices y hongos (micorrizas), y un grupo de bacterias de vida libre en
la rizosfera de la planta (PGPRs), bacterias nitrificantes que convierten el nitrogeno poco asimilable en mas
asimilables. Rhizobium es apreciado por su capacidad de fijar nitrogeno, pero estos tienen preferencia por
algunas especies de plantas. El mecanismo mismo de nodular es muy complejo, lo cual hace que su
manipulacion genetica sea dificil por el numero de genes implicados. En el caso de micorrizas, tambien hay
especificidad. Los efectos mas inmediatos son que ellas solubilizan fosforo y estas bacterias induciran
sintesis de fitohormonas, sideroforos, (moleculas que permiten el transporte de hierro). Las formas mas
estudiadas son las PGPRs por algunas caracteristicas favorables que le confieren a la planta. Las PGPR
muchas veces inducen sintesis de acido indol acetico, lo que favorece. Ademas ayudan a que las plantas
reduzcan sus niveles de estres mediado por la sintesis de etileno. Un exceso de etileno lleva a marchitez.
En cualquier situacion de estres, la planta generara respuestas de estres. La presencia de PGPRs reduciran
esto, ademas de formar biopeliculas en la raiz de la planta, protegiendolas, actuando como bioadsobente
de diferentes iones. Tambien seran disponibles otros compuestos como acidos humicos, esto se traduce en
mejor crecimiento y por lo tanto, mayor rendimiento. si esto ocurriese sin presencia de PGPRs, la
acumulacion de etileno genera efectos. Las ventajas de los PGPRs es que no son especificas.

MANIPULACION GENICA DE ANIMALES

tecnicas de transplantes de embrion en animales, tecnicas de microinyeccion. Tecnicas de transgenesis.
Una de las tecnicas clasicas son las tecnicas de micromanipulacion de embriones. Manipulacion de morula
y en que momento diseccionar la blastula para generar organismos identicos. Esto empieza con la
superovulacion, transplante de nucleos, diseccion de cigotos, por lo tanto tener en una misma camada una
 DENIS ES EL MEJOR
mayor cantidad de animales con caracteristicas uniformes. Hay algunos animales en los cuales es
importante controlar el numero de hembras o machos. Una de las tecnicas clasicas es la transferencia de
nucleos. El ovocito fecundado, con una micropipeta se aspira el nucleo. Los ovocitos se les puede extraer
el adn, por PCR identificar un marcador cromosomico para identificar el Y. otra tecnica es la produccion de
quimeras, en donde uno en la etapa de desarrollo embrionario uno colocara celulas de diferente origen.
Por ejemplo se retiran celulas del blastocisto, se hace cultivo in vitro, se busca que la suspension sea
homogenea, estas se mezclan con celulas provenientes de otras lineas celulares. Finalmente se hace
inyeccion de blastocistos. La idea es hacer que se produzcan proteinas recombinantes en animales. Que se
hizo con dolly? Se retiro celulas del tejido mamario de la madre, se cultivaron, se retiro el nucleo. A la
oveja nodriza se le indujo a sobreovulacion y se les retiro el nucleo, se hizo transplante de nucleo, se
inserto en el utero de la nodriza, se cuido y nacio. Doly murio tempranamente, pero era porque sus
telomeros eran demasiado cortos. La otra forma es por transgenesis: produccion de albumina en pollos.
Cultivo de virus en huevo, retirando la cascara , manipulando y volviendo a sellar. Tambien se estan usando
a los pollos como factorias celulares mediante edicion genica. Tambien se pueden hacer animales
quimericos y transgenicos. en el segundo, se puede aspirar un poco de las celulas del blastodermo,
inyectarles el gen que nos intereasa y luego regrearlas al cuerpo. El resultado es un animal quimerico.
PECES TRANSGENICOS: mediante sobreproduccion de hormona de crecimiento, tambien se puede inducir
produccion de machos o hembras. Otros. El proceso tambien se hizo en cerdos, salmones. Produccion de
proteinas terapeuticas, por ejemplo produccion de la hormona de crecimiento. Animales como donadores
de organos. Entonces modificacion de animales por ovocitos, transgenesis dirigida o colocando las celulas
en las gonadas y luego se recuperan los gametos transgenicos.

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
Provee de insumos quimicos a diversas industrias. Va a teren como modelo de produccion a la biorefineria.
La biomasas lignocelulosica es candidata para obtener azucares que por conversion organica puedan dar
lugar a acidos organicos, etanol, metilenglicol. Los azucares pueden servir para generar un monton de
productos, entonces el reto es conseguir azucares a partir de estos residuos. La limitacion mas grande es
que para desestructurar la lignocelulosa se requieren de una alta cantidad y variedad de enzimas,
requiriendose de proceso fisicoquimico previo. En el proceso termoquimico se rompe la lignina que rompe
la celulosa, lignocelulosa y lignina. Los azucares saldran de la celulosa, pero requiero retirar la lignina. De
paso con el proceso podre generar una estructura amorfa de la celulosa. Esto puede pasar por un proceso
catalitico o por microorganismos. La idea es que de una biorefineria entra biomasa y sale mas de un
producto.
Actualmente tenemos residuos agricolas y mucho excedente de almidon. En el caso del almidon se hace
una sacarificacion enzimatica con amilasas. El problema es para el otro caso. Una vez tenga los azucares,
todo dependera de que factoria celular este usando. Entonces el diseño del proceso parte por conocer muy
bien como es el microorganismo desde el punto de vista genomico y toda esta data que es sacada de loas
omicas lo unificare en el bioreactor.
Un primer grupo de compuestos que se utilizan bastante para diferentes fines son los acidos organicos, el
mas producido es el acido citrico. Es producido por aspergilus niger. Luego el acido malico, acetico,
fumarico, succinico y gluconico. Una de las ventajas por las cuales aspergillus produce acido citrico es
porque su rendimiento es mayor, gran parte de su flujo de carbono va en via de sintesis del ciclo de krebs.
Ademas tiene transportadores de acido citrico pasivo que permiten recuperar del medio de cultivo este
acido.
El acido acetico se produce por Acetobacter aceti. Se puede producir en grado alimenticio (vinagre) o
industrial (etanol). El acido gluconico se produce con Aspergillus niger. El precursor es glucosa y glucosa
oxidasa. Este ciclo implica uso de catalasa para producir agua y oxigeno a partir del peroxido generado. El
acido lactico es producido por bacterias acido lacticas, este si se activa mediante una coenzima, se puede
polimerizar y generar un polimero. Los microplasticos pueden ser igual o mas dañinos que los plasticos. El
acido fumarico sirve para hacer recinas, ceras, para la industria del plastico. Uno de los mejores
productores es el genero Rhizopues arrhizus. Acido succinico, usado para produccion de latas y recinas.
 DENIS ES EL MEJOR
Otras de las moleculas son los tereftalatos de polipropileno. Mediante la extension de una via de levadura
(glicerol 3P) con una via de klebsiela (enzima) en una e. coli, se logra producir plastico.
Biocombustibles: metanol, biodiesel. Etanol de primera y segunda generacion. El de primera generacion
proviene de residuos amilaseos (caña, remolacha) que proveen sacarosa, que se puede pasar directamente
a fermentacion metabolica. Un segundo tipo son los amilaseos (cereales, tuberculos, raices) que por
hidrolisis enzimatica permite obtener fermentos. Desde el punto de vista de seguridad alimentaria tiene
problemas porque los alimentos no pueden ser usados como fuente de combustible, porque se estaria
compitiendo con las tierras para combustible. El etanol proveniente de segunda generacion viene de
residuos agroindustriales, el problema es el hacer accesible la celulosa (pretratamiento e hidrolisis). El
metanol se recuperal por destilacion. El rendimiento de etanol por lha-1 : se observo que la conversion de
residuos a etanol es bastante baja, pero en los que tengan lignocelulosa hay mayor rendimiento. estudios
demuestran que lo que mas rinde en etanol es la lignocelulosa. El pretratamiento quimico consiste en : alta
temperatura.

------------------------------------------------------CLASE PERDIDA 1--------------------------------------------------------------

EMPLEO DE BIOLOGIA SINTETICA PARA DESCUBRIMIENTO DE DROGAS RESISTENTES

Otra estrategia para resistencia es: combinacion de vias metabolicas luego se genera combinaciones de
enzimas entre las vias. Se genera un tamizado y se seleccionan los clones positivos.
No se pueden usar microorganismos como patentes, pero si se puede modificar estos y esto se puede
patentar. Aqui radica el poder de la biologia sintetica. Una opcion es simplificar el proceso de produccion,
otro es conocer los mecanismos de accion (dokking molecular) es como el paso previo al tamizado
molecular. La respuesta se observa por fluorescencia. Quorum sensing, es el incremento de un metabolito
en presencia de señales quimicas por el entorno. Cuando mas intrincada sea la estructura de la molecula,
la probabilidad de resistencia es menor.

BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL
Problemas: procesos de nitrificacion principalmente por la industria ganadera. Otro es el calentamiento
global, sabemos que los mayores productores de metano son el ganado vacuno. El control de la
metanogenesis para que microorganismos empleen mas el CO2 en el suelo. Tambien contaminacion por
diferentes xenobioticos. Presentacion de principales problemas ambientales por causa de la industria.
Tambien el peso de los productos recalcitrantes.
Etapas para minimizar la contaminacion: prevencion (no generar los contaminantes , reemplazar los
procesos quimicos convencionales por procesos biologicos en terminos de productos recalcitrantes o
toxicos, ademas, energeticamente es mas eficiente porque las condiciones de los procesos biologicos son
mas moderadas), tratamiento tercieario (descontaminacion de xenobioticos, se pueden usar organismos
nativos, modificados, comunidades. Dependiendo del volumen de contaminacion se pueden usar
diferentes estrategias, por ejemplo los biofiltros), capacidad de monitoreo en tiempo real (biomapeado, se
pueden usar micrrorganismos como indicadores de contaminacion, en biologia sintetica se estan
trabajando microrganismos que detectan niveles de metales pesados por fluorescencia o reaccion
cuolorimetrica, empleo de bioadsorventes) para procesos de mayor escala se hace uso de comunidades
microbianas naturales o diseñadas.
La mineria es una de las actividades mas fiscalizadas. En este caso se utilizan los sistemas tradicionales.
Actualmente el estado de la tecnologia no permite hacer un reemplazo completo de los procesos
biologicos, todavia no son lo suficientemente rapido para reeemplazar procesos quimicos. Lo que si se esta
haciendo es recuperacion de minerales en las primeras etapas. Se usan bastante las bacterias oxidantes y
reductoras para recuperar minerales. Recordando que existen bacterias quimiolitotrofas que hacen estos
procesos, que al oxidar el mineral liberan estos, paralelamente producen acidos en el medio. Este efecto
hace que los elementos sean solubles. Las mas usadas es tiobacillus. Recordemos que estas bacterias van a
tener una energia de manteniimiento alta. Sus periodos de proliferacion son de 15 dias. Son bacterias que
interaccionaran con un material a travecs de una matriz de exopolisacaridos que permitira que la bacteria
 DENIS ES EL MEJOR
se fije a una superficie y a partir de ello inicie su metabolismos. Entonces, lo que ocurre en minas, luego de
cavar y tratar, se acumula el mineral de baja ley y es sometido a la accion de estas bacterias. Se riega con
bacterias y se recuperan los metales en solucion acida. Uno de loss principales retos es conseguir un
proceso de biolixiviacion mas eficiente. Las plantas de biomineria ya son tecnologias desarrolladas. El
principal problema es la mineria informal.
Tratamiento de efluentes. Fases de tratamiento ( primario, secundario, terciario). En el tratamiento
secundario se usan comunidades nativas, se buscan reducir la DBO. Se emplean fangos activados, lagunas
de oxidacion, sistemas aireados, digestores anerobios. En el tratamiento terciario se busca disminuir la
DQO. Siempre se puede encontrar un microorganismo que pueda actuar sobre un contaminante quimico,
si no es posible, se busca la manera de usar un proceso quimico. Tambien se hace eliminacion de virus. El
filtro de goteo es tambien conocido como filtros percoladores. La altura del contenedor va de la mano con
el tiempo en que tardaran los microorganismos para tratar. Otro proceso es de fango activado, son pozas
rectangulares largas en donde estan los microorganismos. El termino de residencia se maneja en terminos
de la longitud de la foza. En este sistema se pueden colocar helices para acelerar el proceso. Esto va a estar
conectado a un decantador.
Existe otro proceso de digestion anaerobica. Estas estan en las heces de ganado, se utiliza guano de vaca o de pollo.
La idea es aprovechar esta diversidad presente en estas escretas. Las excretas pasan por licuefaccion, formando
compuestos organicos solubles y insolubles (organicos, inorganicos, agua). Del compuesto organico soluble se
pueden usar bacterias formadores de acidos que forman acidos organicos simples. Luego bacterias metanogenicas
forman biogas. Tambien se puede usar un digestor de mezcla completa (cuando hay 3 – 10% de solidos). Para solidos
de 6 a 11% se emplea un digestor de flujo a piston. Estos son sistemas que pueden operar a volumenes muy grandes
o reactores en serie.
Biodegradacion de xenobioticos: son compuestos sinteticos resistentes a la degradacion. Bacterias del genero
Pseudomonas pueden degradar hidrocarburos debido a la presencia de plasmidos degradativos (TOL, CAM, etc).
Microorganismos como Burkholderia y basidiomicetos pueden degradar xenobioticos. Estas capacidades
degradativas de los microorganismos son extracromosomales. Para resistencia a antibioticos esto es un problema..
los basidiomicetos siempre estan presentes en el ambiente solo que en poca cantidad. Burkgholderia esta presente
en muchos sistemas , pero esstos pueden ser oportunistas. Descomposicion por microorganismos: biorremediacion,
bioaumentancion, bioestimulacion, compostaje. Muchas de las bacterias producen sustancias surfactantes que
permiten que se genere una emulsion en la biorremediacion de hidrocarburos. En caso de derrames de mar se lleva
poblacion aumentada. La bioestimulacion es lo que s hace en fangos activados.
La biorremediacion busca la mineralizacion de los contminantes. Para eso se deben buscar microorganismos de
diversos origenes. Tambien se buscan diferentes sustratos que permiten estudiar estos microorganismos. Los mas
comunes son las pseudomonas, rodococcus, micobacterium. Muchos de estos generos pueden generarr un riesgo
desde el punto de vista de salud. Hay una tendencia del empleo de microorganimos eficientes, lo que puede causar
el empleo de microorganismos potencialemnte toxicos como aquellos que pueden generar esporas. Sobretodo en
los anaerobicos. No es cuestion de emocionarse y liberarlos si es que no se ha pasado por pruebas de
caracterizacion. Muchos de estos tienen la capcidad de oxidar compuesstos recalcitrantes. Existe dos tipos: in situ,
ex situ. Ex situ = biopilas, filtros de goteo, compostaje. El problema critico es el espacio, el tiempo del tratamiento.
Las celulas pueden actuar realizando lixiviacion, la otra forma es usarlas como resinas de absorcion, otra es que las
celulas puedan usar estos contaminantes como fuente de energia lo que causa un metabolismo oxdativo y
mineralizacion del compuesto y la otra es utilizando especificamente enzimas. Las enzimas mas usadas son las
oxidasas. Uno de los grupos de enzimas mas buscadas son las monoxigenasas, dioxigenasas. Las monoxigenasas
oxidan la molecula, reacomodando los enlaces y posterior hidrolisis. Basicamente preparan el sustrato para la accion
de otra oxidasa. Se pasa a una forma mas hidrolizante , eque es el catecol. Las dioxigenasas lo tratan.
La profe comenzo a explicar la parte de tramatiento desde el nivel de estructura quimica. Comenzo a dar varios
ejemplos de degradacion. Empleo de factorias para desalquilar atrazina o desclorinar / desaminar para generar acido
cianurico.
Un tio hizo la mezcla de plasmido CAM (degrada campor), NAFT (naftalina), otros.