 DEFINICIONES

-MICROSCOPIO
-PODER DE RESOLUCIÓN
-LÍMITE DE RESOLUCIÓN
 Los microscopios son instrumentos de óptica que
nos permiten ver objetos pequeños o detalles
estructurales imposibles de distinguir a simple
vista porque están por debajo del límite de
resolución del ojo humano.
 El límite de resolución del ojo humano es alrededor de 100
a 200 µm y esto significa que el ojo humano puede
distinguir objetos cuyo tamaño no sea inferior a 100 o 200
µm. En la mayoría de los casos la observación
microscópica se realiza sobre células muertas que han
sido procesadas para poder eliminar el agua que
contienen, pudiendo así preservar su estructura lo mejor
posible. En este modo se obtiene una estructura lo
suficientemente delgada para que la luz o los electrones
la atraviesen.
 Es la capacidad del instrumento para
dar imágenes distintas de dos puntos
situados muy cerca uno del otro en el
objeto
 Es inversamente proporcional a la
longitud de onda y directamente
proporcional a la apertura numérica del
objetivo
 Es la distancia mínima que debe existir
entre dos puntos para que puedan ser
discriminados como tales.

 0,5 λ (longitud de onda

N senα (apertura numérica)
 Los microscopios
Historia del microscopio óptico

• Los primeros microscopios datan de

1610. Fueron inventados por Galileo
Galilei.
• Algunos científicos de la época, como
Malpighi o Hooke, los utilizaron.

Microscopio de Hooke
(1665)
1655 Hooke utilizó un
microscopio
compuesto para
describir unas
pequeñas celdillas
en los cortes de
corcho a las que
denominó "células".
Los microscopios
Historia del microscopio óptico

• A mediados del siglo XVI, el

holandés Anton van
Leeuwenhoek fabricó
microscopios con lentes esféricas.
Con ellos realizó numerosas
observaciones.
• Algunos de aquellos
microscopios superaban los 200
aumentos.

Microscopio de
Leeuwenhoek
1674 Leeuwenhoek informó sobre
su descubrimiento de protozoos.
Nueve años más tarde observó
por primera vez bacterias
 Los microscopios
Historia del microscopio óptico

• Poco a poco, los microscopios

fueron sufriendo mejoras que
permitieron hacer nuevos
descubrimientos en el campo de la
biología celular.

Microscopio del
siglo XIX
Los microscopios
Historia del microscopio óptico

• Los microscopios ópticos

modernos permiten aumentar la
imagen más de mil veces

Microscopio
actual
1882 Koch utilizó colorantes de anilina para teñir
microorganismos e identificó las bacterias que causan
la tuberculosis y el cólera.

1908 Köhler desarrolla el microscopio de fluorescencia

1930 Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de
contraste interferencial.

1931 Ruska y Knoll construyen el primer microscopio

electrónico
1932 Zernicke inventó el microscopio de contraste de
fases. Se observan por primera vez células vivas no
teñidas en detalle.
1934 Von Ardenne construye el primer microscopio
electrónico de barrido
 Aparato simple que forma una imagen
aumentada. (app. 540 veces)
  Poseen dos lentes que producen una
imagen ampliada, vertical e invertida
al objeto
Microscopio óptico, fotónico o
corriente
• Es de campo claro ya que la luz que llega
perpendicular a la preparación, la atraviesa y
penetra el sistema óptico, permitiendo un
campo bien iluminado.
El microscopio óptico tiene un
límite resolución de cerca de
200 nm (0.2 µm). Las células
observadas bajo el
microscopio óptico pueden
estar vivas o fijadas y teñidas.
 PIE O BASE : Sirve como base del
microscopio. Tiene el peso suficiente
para dar estabilidad al aparato.
Suele ser una plataforma rectangular
 COLUMNA O BRAZO: Llamada también
asa . Es una pieza en forma de C unida
a la base por su parte inferior mediante
una bisagra. Sostiene el tubo en su
porción superior y por el extremo inferior
se adapta al pie.
 TUBO: Soporta la porción óptica del
microscopio. Es un cilindro hueco de
longitud variable, cuyo interior está
pintado de negro mate y posee un
diafragma para impedir la formación de
reflejos y facilitar la observación.
 El tubo puede ser doble y alejar dos
fuentes oculares (microscopio binocular)
 En los modelos de microscopios grandes
destinados a la microfotografía, hay un
tercer tubo accesorio, generalmente
más largo y vertical que sirve para
conectar una cámara fotográfica sin
necesidad de lente ocular.
 PLATINA O PLETINA: Es el soporte horizontal
donde se coloca la muestra. Presenta en
el centro un orificio circular por donde pasa
el rayo de luz producido por la fuente
luminosa y proveniente del condensador.
Generalmente es de forma cuadrada y
posee un sistema de fijación e
inmovilización del portaobjetos compuesto
por pinzas o una pieza articulada
 VERNIER O NONIUS: Consiste en dos
pequeñas piezas graduadas en
milímetros cuya finalidad es la de
obtener coordenadas aproximadas que
sirvan de referencia para localizar una
estructura determinada en la
preparación.
 REVOLVER: Considerado un accesorio
del tubo. Permite el intercambio rápido
de objetivos mediante un movimiento
de rotación. Está constituido por una
semiesfera que posee una serie de
anillos en los cuales van atornillados los
objetivos.
Esta pieza gira alrededor de un eje que
está colocado en la parte inferior del
tubo
 TONILLOS
Los tornillos de enfoque permiten regular la
distancia entre la muestra y los
objetivos, con el fin de enfocar la
preparación, obteniendo una imagen
nítida. Hay un tornillo macrométrico de
enfoque grueso y un micrométrico de
enfoque fino.
 Como es esperable, en microscopía
óptica la parte más importante, la de
más relevancia es la parte óptica del
microscopio pues es la encargada de
reproducir y aumentar las imágenes
mediante el conjunto de lentes que lo
componen y consta de algunas partes
importantes.
 Los componentes ópticos están
colocados en una base estable que
permite el intercambio rápido y un
alineamiento preciso.
 El sistema óptico está constituido por
juegos de lentes
 Representan el componente óptico más
importante del microscopio.
 Constituyen un sistema óptico formado
por una o varias lentes, las cuales deben
estar centradas y los ejes ópticos de
cada una deben coincidir exactamente
para formar el eje óptico del sistema. Sus
lentes están hechas a partir de cristales (
espatos, fluorita, entre otros) con un alto
grado de calidad y funcionamiento
 Los objetivos son piezas formadas por
sistemas de lentes convergentes,
corregidas para las aberraciones
cromática y esférica que son los grandes
retos de la microscopía óptica.
 En todos los dispositivos ópticos, la calidad de
la imagen depende sobre todo de la calidad
de la óptica.
 Las lentes trabajan con la refracción, y las
diferentes λ de la luz tienen también una
refracción diferente. Este fenómeno lleva a la
aberración cromática y a la distorsión de la
imagen ya que los diferentes colores de la luz
inciden en el foco a diferentes distancias de la
lente.
 Una imagen con aberración cromática
muestra bandas de arco iris en el margen del
objeto, lo que va en detrimento de la
resolución de los detalles
 La aberración cromática se debe a que la luz visible
está compuesta por muchas radiaciones, las cuales
sufren una desviación desigual debido a que la lente
no puede enfocar todos los colores en un
determinado punto. Por este motivo, la distancia
focal será diferente para los distintos colores. Se
forman así imágenes a diferentes distancias de la
lente, una por cada color incidente. Para corregir
esto, se ponen dos lentes diferentes adosadas para
que el conjunto tenga la misma distancia focal para
dos colores. Este sistema de lentes se llama
acromático y se emplea vidrio flint (silicato de
potasio y cromo) y vidrio crown (silicato de potasio y
calcio).
 Newton , llego incluso a asegurar que era
imposible corregir la aberración cromática.
 Después se constató que un doblete (dos
lentes de materiales ópticos diferentes)
podía concentrar dos colores en el mismo
nivel. Este tipo de objetivo se conoce como
acromático. El desarrollo de éste condujo
al desarrollo del prisma acromático, que
focaliza tres λ al mismo tiempo ( roja, verde
y azul)
 La aberración esférica se produce porque
los rayos que atraviesan la lente cerca de
sus extremos convergen en un punto más
cercano a la lente respecto a los que
cruzan por el centro. En este modo se
forman una serie de focos del mismo
objeto sobre el eje principal, logrando así
una imagen borrosa. Esta aberración se
puede corregir en distintos modos, por
ejemplo poniendo un diafragma contra la
lente, permitiendo solo el paso a los rayos
centrales.
 CLASIFICACIÓN
Tomando en cuenta el grado de
correccion de las aberraciones hay dos
categorías de objetivos para el
microscopio, los objetivos acromáticos y
los apocromáticos. En cada categoría
hay dos grupos: los secos y los de
inmersión.
 Presentan corrección cromática para la
luz azul y roja. Corrección de esfericidad
para el verde. Son ideales para
microfotografía blanco y negro.
 Se asume que un objetivo es
acromático cuando no posee ninguna
denominación.
 Elabarados a partir de cristales de
fluorita. Corrigen para el azul, rojo y en
cierto grado para el verde. La
correccion de esfericidad es para los
dos colores, el verde y el azul.
Diseñados para la microfotografía en
colores.
 Poseen el más alto nivel de corrección de
aberraciones y por ello, son más costosos.
Presentan corrección cromática para
cuatro colores ( azul oscuro, azul , rojo y
verde), corrección de esfericidad para dos
o tres colores . Son los mejores objetivos
para microfotografía y video a color.
Debido a su alto grado de corrección estos
objetivos poseen mayores aperturas
numéricas que los acromáticos y las
fluoritas. Esto puede ser un inconveniente
puesto que el campo de observación se
presenta un poco curvo.
 Los tres tipos de objetivos proyectan
imágenes con cierta distorsion que se
manifiesta como curvaturas y al ser
corregidos para este defecto se
denomina plan-acromáticos, plan-
fluoritas o plan- apocromáticos
 Colores Código de color de
inmersión
Medio de inmersión

Negro
Aceite

Naranja Glicerol
Blanco Agua
Rojo Especial o multiuso

Código de color de
Aumento
aumento

Negro 1x, 2.5x

Marrón 2x, 2.5x
Rojo 4x, 5x
Amarillo 10x
Verde 16x, 20x
Azul turquesa
25x, 32x

Azul celeste 40x, 50x

Azul cobalto 60x, 63x
Blanco, crema 100x, 250x, 200x
 El ocular es la lente que recoge la
imagen dada por el objetivo, a partir del
cual se genera una imagen aumentada
 Igual que en el objetivo está recubierto
por un cilindro
 Formado por un sistema de lentes
› - lente inferior de campo
-Lente superior que actua como lupa
 El condensador tipo Abbe está formado
por un sistema de lentes convergentes
que están situadas en un soporte
metálico
 El diafragma, se encuentra por debajo
del condensador. Gradúa la cantidad
de rayos luminosos que llegan al objeto
 La iluminación es una variable crítica
que hay que considerar al poner en
funcionamiento el microscopio. Con
frecuencia el uso incorrecto de la
iluminación, aún en equipos sofisticados,
conduce a la obtención de imágenes
defectuosas. La muestra debe ser
iluminado mediante una fuente de luz
artificial, la cual puede producir artificios
en la imagen que se observa.
 En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un
método de iluminación para optimizar la
observación microscópica y la microfotografía, que
permite aprovechar al máximo las capacidades de
las lentes (objetivos) iluminando la muestra en
estudio con un campo de luz uniforme cuyo
diámetro sea igual al del área de captura del
objetivo.
 Los microscopios modernos están diseñados para
aplicar la iluminación Köhler y los requerimientos son:
• Condensador que sube y baja para enfocar el cono
de luz.
• Bombilla con lente colectora.
• Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a
nivel de la lámpara y un diafragma de apertura,
colocado debajo del condensador.
 El microscopio de campo oscuro, es un tipo
de microscopio óptico que cuenta de un
condensador especial que dirige los rayos
luminosos en modo que pueda iluminar la
muestra oblicuamente. El límite de
resolución no es mayor que un MO de
campo claro, el contraste logrado puede
mejorar la visualización de pequeñas
estructuras, por lo que resulta muy útil para
observar bacterias, o ciertos detalles de
células eucariotas.
 Sobre todo se utiliza para conocer las
funciones de las células de la sangre.
 Para que el efecto de campo oscuro se
logre , la apertura numérica del
condensador, debe ser mayor que la
del objetivo.
 Lamicroscopia de contraste de fases
es una técnica óptica que explota los
cambios en el índice de refracción
para producir imágenes de alto
contraste de especímenes
transparentes
 El principio es semejante al de campo oscuro;
se ilumina la muestra con un cono hueco de luz
pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en
forma de anillo que disminuye la intensidad de la
luz y al mismo tiempo provoca un retraso o
desfase en la longitud de onda de la luz. Este
método induce variaciones sutiles en el índice
de refracción (determinado por el espesor) de
los especímenes translúcidos permitiendo
visualizar una riqueza de detalles muy finos en la
estructura, los cuales pasarían desapercibidos
con una iluminación de campo claro
 Se usa
principalmente
para aumentar el
contraste entre las
partes claras y
oscuras de las
células sin colorear.
Es ideal para
espécimenes
delgados, o células Phase contrast image of cultured
epithelial cells using a 20X
aisladas objective
 Los heterogéneos componentes de una
célula absorben la luz de diferente manera y
causan pequeñas variaciones de fase en las
radiaciones luminosas, es decir, las retrasan
ligeramente al disminuir la velocidad a la cual
viajan y el retraso varía según el tipo de
estructura. En las células y tejidos no
coloreados, el escaso contraste se mejora y
acentúa al transformar las diferencias de fase
(invisibles al ojo humano) en diferencias de
intensidad luminosa las cuales sí son
detectables. Este tipo de microscopio también
se denomina de Fases o Diferencia de Fases
 Para convertir un microscopio convencional en uno de
contraste de fases se sustituye el condensador y el
objetivo por los de contraste de fases, los cuales
contienen un filtro en anillo y una placa de fases
respectivamente Los objetivos de contraste de fases se
identifican por sus letras verdes y la indicación del
tamaño del anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3 o PhC, PhL, PhP)

 Se usa para
Observación de células y tejidos vivos.
En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo
fisiología, parasitología, farmacología (procesos celulares,
identificación y cuantificación de microorganismos y
parásitos en fluidos y tejidos, efecto de medicamentos y otras
sustancias en las células y sus procesos de motilidad, ciclosis,
digestión, entre otros).
Estudio de alimentos y medicinas.
Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras
sintéticas, plásticos, pigmentos, emulsiones y suspensiones
minerales).
Estudios geológicos (minerales).
Diagrama para el microscopio de contraste de fases. K: filtro anular,
L: vista transversal del filtro anular, M: condensador, O-O’: objetivo,
P – P’: ocular, Q: diafragma del ocular. La placa de fases está
colocada entre las lentes del objetivo y funciona como otro filtro
que crea la difracción de la luz. a y b: configuración de los filtros
para producir el contraste negativo o positivo respectivamente.
Modificado de Richards O W. (1954). Phase Microscopy 1950-1954
(99).
 Es un microscopio de campo claro al cual se le
adicionan filtros que modifican la luz. También se
denomina microscopio petrográfico o metalúrgico
por su uso inicial en el estudio de minerales, sin
embargo su aplicación se ha extendido al campo
de la biología, medicina, química y muchas otras
disciplinas. Esta técnica microscópica puede
emplear tanto la luz transmitida como la luz
incidente (trans-iluminación y epi-iluminación
respectivamente).
 La luz proveniente de una fuente estándar de
iluminación vibra y se propaga en todas las
direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador las
ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un
mismo plano. El polarizador es un dispositivo que solo
deja pasar la luz que vibra en un plano determinado
denominado eje de polarización
 El contraste de la imagen se observa
gracias a la interacción de la luz
polarizada con los elementos
birrefringentes del espécimen que
producen las dos ondas refractadas,
cada una de ellas polarizada en planos
perpendiculares. Una vez que las ondas
de luz salen del espécimen lo hacen de
manera desfasada pero son
recombinadas al pasar por otro filtro o
filtro analizador.
 La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia
que fue observado inicialmente por Sir George
Stokes en el año 1852, para luego ser explicada
físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (
Es la propiedad que tienen ciertos elementos
químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de
emitir luz visible cuando sobre ellos incide una
radiación intensa; en otras palabras, absorben una
luz de una longitud de onda determinada (por
ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y
luego emiten otra luz de una mayor longitud de
onda (de un determinado color, verde, rojo,
amarillo) . Es un fenómeno de luminiscencia de vida
corta, emitida simultáneamente con la excitación
 Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se
observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada
longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas
fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra
luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de
onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de
Fluorescencia y fluorocromos (108).
Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes
conceptos:
 Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en
investigación para crear contraste en zonas determinadas de
los especímenes.
 Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que
le imparte la propiedad de fluorescencia.
 Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene
su espectro de absorción y de emisión específico que depende de
la composición y estructura de la molécula fluorescente.

Mycobacterium tuberculosis Anticuerpos marcados con partículas

fluorescentes que se han acoplado a los
antígenos víricos específicos (adenovirus)
 Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y 380
nm) menor que la luz blanca (380 a 750 nm). Esta
luz excita ciertas sustancias que emiten
radiaciones (mayor a 380 nm) que las hace
visibles.
 Algunos materiales no requieren colorantes pues
tienen fluorescencia propia y otros deben ser
teñidos con colorante fluorescente, es estimulado
por un haz de luz, emitiendo parte de la energía
absorbida como rayos luminosos.
 Es un microscopio en el que se usa la luz ultravioleta, que
es una radiación cuya longitud de onda es de
aproximadamente 200 nm y en consecuencia permite un
mayor poder de resolución que la luz visible.

La luz ultravioleta es invisible para el ojo humano, no
puede ser captada por la retina y además es muy nociva;
es por ello que la imagen no se observa directamente,
por el contrario debe visualizarse mediante fluorescencia,
fotografía o un sensor digital. Todos los elementos ópticos
del microscopio, incluyendo las láminas porta y cubre-
objetos están hechos de cuarzo o fluorita; no pueden ser
de vidrio puesto que este material no transmite la luz
ultravioleta
 La estructura del microscopio es básicamente igual a la
del microscopio de fluorescencia, con fuente de luz,
filtros, objetivos y espejos especiales; estos últimos son
aluminizados. La fuente luminosa corresponde a lámparas
de arco de mercurio o xenón. En términos generales es un
microscopio costoso. Las imágenes obtenidas son
semejantes a las del microscopio de fluorescencia, las
estructuras marcadas aparecen brillantes contrastando
con un fondo negro.

 Se emplea en
 ciencia forense para el análisis de ADN, drogas y estudios
de evidencias.
 Estudios biológicos.
Se usa para estudiar la estructura de los materiales
biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser
que es muy convergente y, en consecuencia produce un
punto de barrido muy poco profundo. Se utiliza un sistema de
espejos para mover el rayo láser a través de la muestra,
iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de
cada punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se
guardan en un ordenador. Luego se puede llevar la imagen
a un monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja
de que se pueden tomar imágenes de la muestra en cortes
muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen
mediante un programa para dar una definición máxima a la
imagen. Es posible también crear imágenes múltiples a
diferentes profundidades dentro del espécimen y realizar
reconstrucciones tridimensionales
 El desarrollo de este microscopio es uno
de los principales logros de la física
aplicada en el siglo XX y ha
revolucionado nuestro conocimiento de
la estructura biológica. Se basó en el
descubrimiento de que un campo
electromagnético actúa sobre un haz
de electrones de manera análoga a la
acción de una lente de cristal sobre un
haz fotones
 El paso de los electrones a través de este
microscopio de transmisión está dirigido de forma
análoga al paso de los rayos de luz a través de un
microscopio óptico. Un haz de electrones se
proyecta desde el cañón electrónico y se hace
pasar por unas serie de lentes electromagnéticas. La
lente condensadora colima el haz de electrones en
la muestra, mediante una serie de lentes
amplificadoras, se produce una imagen ampliada.
La imagen se hace visible cuando interfiere con una
pantalla fluorescente. En este microscopio se
pueden analizar solo muestras muy delgadas (de un
grosor de 10 nm o menos), ya que el poder de
penetración de los electrones en la materia es débil.
 El microscopio electrónico de
transmisión(Scansion Electron Microscope) se
compone de un haz de electrones generado
por un cañón de electrones (cátodo) situado
en la parte superior de la columna y su haz
viene atraído hacia el ánodo, condensado
por las lentes colimadoras y se focaliza sobre la
muestra a través de lentes de objetivo. El haz
de electrones golpea la muestra, produciendo
así unos electrones secundarios. Estos
electrones, producidos, vienen recogidos por
un detector y convertidos en señales eléctricas
y amplificadas. Las muestras que se suelen
utilizar no tienen un grosos superior a 50 nm.
 Dos técnicas muy importantes, utilizadas
en el microscopio electrónico de
transmisión son el sombreado metálico y
la criofractura, que se utilizan sobre todo
en muestras biológicas.
El microscopio electrónico de
transmisión (MET) tiene un limite de
resolución de cerca de 2 nm. Un MET
permite observar profundidades
después de haber sido fijadas y
teñidas con iones de metales
pesados o mediante criofractura.
Los electrones son dispersados
cuando pasan a través de una fina
sección del espécimen, y luego
detectados y proyectados hacia
una imagen sobre una pantalla
fluorescente.
 Para el sombreado metálico la muestra, desecada,
se expone a una corriente dirigida por un metal
pesado (platino, paladio, oro) produciendo así una
imagen que revela su estructura tridimensional del
objeto.
 En la criofractura la muestra biológica se congela
con nitrógeno líquido (-196ºC), luego se fractura
quedando expuestas varias superficies externas e
internas de la muestra. La superficie fracturada se
sombrea con un metal pesado. Al final la muestra
sombreada se destruye por tratamiento químico y la
réplica es examinada. Estas dos técnicas han
permitido estudiar la estructura de la membrana y
de la pared celular.
virus Ébola
 La amplificación de la imagen viene determinada por las
señales eléctricas al irradiar la superficie de la muestra
con un haz muy estrecho de electrones. Esta irradiación
hace que la muestra desprenda electrones de baja
energía que pueden ser recogidos sobre una placa
cargada positivamente (ánodo) generando de este
modo una señal eléctrica que es proporcional al número
de electrones que inciden en el ánodo y la señal eléctrica
viene utilizada para formar una imagen. Mediante el uso
de un generador de barrido se hace que el haz de
electrones atraviese la muestra siguiendo un rastreo de
barrido. La profundidad del foco varía desde varios
milímetros y su gama de amplificación efectiva desde
unos 20 X a más de 20 000 X. Esto nos da una imagen
tridimensional y con muchos detalles de organismos muy
pequeños.
El microscopio electrónico de
barrido (MEB) tiene un limite de
2nm. El MEB permite observar la
superficies de las muestras,
después de haber sido fijadas y
teñidas con iones de metales
pesados. Con esta técnica los
electrones son reflectados sobre la
superficie del espécimen.
Imagen obtenida mediante
microscopio electrónico de barrido, en
la que se muestran bacterias
Mycobacterium tuberculosis. (Foto:
Stewart Cole/EPFL)