UNIVERSIDAD NACIONALSAN ANTONIO ABAD DEL

CUSCO
Escuela Profesional de BIOLOGIA

LA CROMATINA

DOCENTE: Blgo.M. Sc. Jorge Acurio Saavedra

Trabajo monografico presentado por::
ALVAREZ DIAZ, Benji Gregori
EGUILETA CAMALA, Jhon
QUISPE CABRERA, Roy
QUISPE QUISPE, Willian
VIVANCO OLIVERA, Rudi

Cusco – Perú
2019
 Lista de contenido
Resumen 5
Historia de la cromatina 6
LA CROMATINA 9
El nucleosoma 9
La fibra de cromatina 11
1.2.1Dinámica de la cromatina 12
1.2.1.1 Autoasociación de la cromatina 14
1.2.2 Modelos estructurales 15
1.2.2.1 Modelo de solenoide 17
1.2.2.2 Modelo de superbead 18
1.2.2.3 Modelos helicoidales de doble origen 18
1.2.3 Modelo de solenoide interdigitado compacto 19
1.2.3.1Electroforesis de cromatina 22
1.2.3.3 Modelo de solenoid 22
1.3.1.1Histonas 24
1.4. ¿Cómo se encuentra la cromatina en las células? 24
1.5. Sitio de hipersensibilidad de DNAsa 25
1.6. Clases de cromatina. 28
1.7. La cromatina durante el ciclo celular 46
1.8. La secuencia influye en el estado funcional de la
cromatina 49
1.9. Modificaciones epigenéticas 51
1.10. Relación entre secuencia, estructura y función de
la cromatina: territorios cromosómicos 63
1.11. La Estructura de la Cromatina 66
1.12. Los complejos remodeladores de cromatina 69
 INTRODUCCIÓN

El DNA en la cromatina eucariótica está compactado en el núcleo a

través de diferentes niveles estructurales. Primero el DNA se enrolla
formando dos vueltas alrededor de un núcleo de proteínas que consiste en 8
moléculas de histonas, para formar una unidad llamada partícula núcleo. El
nucleosoma se completa cuando la partícula núcleo incorpora la histona H1 y
el DNA de unión. El siguiente nivel de estructura esta formado por un
empaquetamiento de los nucleosomas en una cadena en forma de súper hélice
llamada fibra de 30 nm. En este nivel, la histona H1, juega un papel
importante. El sistema mediante el cual la fibra de 30 nm se empaqueta hasta
llegar al nivel máximo de compactación, el cromosoma, es aún poco
conocido.

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 Resumen
La Biología Celular e Histología Médica y Bioquímica son materias básicas
que se encuentran en el currículo del estudiante del primer año de medicina. Cada
materia aborda aspectos distintos sobre el material genético y sobre el organelo que
lo contiene; en Bioquímica se revisan los aspectos metabólicos del ácido
desoxirribonucleico (DNA) y en Biología Celular e
Histología Médica se estudia al núcleo desde el punto de vista orfológico y
tintorial.
Aunque es claro que el material genético está contenido dentro del núcleo,
para muchos estudiantes esta asociación parece no ser tan obvia, y con el correr del
tiempo al médico general se le olvida.
Por ello, desde la trinchera de las Ciencias Básicas, consideramos importante
establecer la clara asociación entre el núcleo (como se describe en Histología) y la
duplicación del material genético (como se revisa en Bioquímica). Se agregó además
el concepto de “micronúcleo”, que es la evidencia morfológica de fallos durante la
duplicación (o la segregación) del material genético durante la división celular, lo
que está implicado en procesos de malignización celular. Consideramos pues, que al
leer este escrito, los estudiantes podrán analizar al mismo tiempo estos componentes
tisulares con “ojo histológico-bioquímico”, integrar lo aprendido en ambas
asignaturas y establecer relación con los procesos patológicos, mientras al médico
general le permitirá “regresar por las sendas ya visitadas”.

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 Historia de la cromatina
Las células eucariotas son una entidad bastantes transparentes a la luz,
por ello los microscopistas pioneros que iniciaban los estudios citológicos de
la organización estructural y funcional de la célula eucariota utilizaron
diferentes tipos de colorantes para teñir las distintas estructuras celulares. El
Aparato de Golgi, Retículo endoplasmático, el núcleo, nucleolos,
cromosomas, neurofibrillas, etc... fueron orgánulos y estructuras de la célula
que fueron descubiertos por diferentes científicos utilizando distintos
métodos de tinción:
La cromatina fue descubierta y nombrada por un médico alemán
Walther Flemming (1843 – 1905) como una estructura celular que se teñía
fuertemente con colorantes basófilos, tintes básicos derivados de la anilina.
W. Flemming describió además la aglomeración (condensación) de la
cromatina para formar unos delicados hilos en el núcleo celular, los
cromosomas (del griego cromo y soma, literalmente cuerpos coloreados) tal
como fueron nombrados más tarde por el anatomista germano Wilhelm von
Waldeyer-Hartz (1836-1921). El científico belga Edouard Van Beneden
(1846-1910) observó los cromosomas también independientemente. Sucesos
de descubrimientos coincidentes de este tipo ocurren muchas veces en la
investigación científica, donde dos o más autores descubren un hecho,
fenómeno, proponen un concepto o una explicación teórica de manera
independiente (e.g. el descubrimiento por Charles Darwin y Alfred Russell
Wallace de la la Selección Natural).
W. Flemming acuño también el termino mitosis (del griego μιτοῦν,
tejer, y -sis acción , literalmente se puede decir acción de tejer los hilos- mito,
μίτος, hilo- cromosómicos,) al investigar el proceso de división celular, el
movimiento y distribución de los cromosomas a los núcleos de las células
hijas. También por primera vez propuso en base a su observación
experimental que todos los núcleos celulares proviene de otro núcleo
predecesor, idea que resumió en la frase omnis nucleo e nucleo después de
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que Wirchow acuñara el aforismo omnis cellula e cellula. W. Flemming es
considerado por ello el científico fundador de la citogenética: el estudio de la
relación que los cromosomas tienen en la herencia. Desde entonces un largo camino
de desarrollos conceptuales y de técnicas experimentales (genéticas, bioquímicas,
biofísicas, de microscopia) ha permitido establecer el conocimiento actual de la
estructura y función de la cromatina que W. Flemming descubrió.

En la misma época en que Mendel experimentaba en su jardín con plantas de

guisante, los citólogos hacían observaciones en el laboratorio acerca de la estructura
y el comportamiento de las células. En 1879, el biólogo alemán Walther Flemming
descubrió que utilizando determinados colorantes podía teñir un material en
el núcleo celular que no se conocía hasta el momento; lo denominó cromatina y
comenzó a estudiarlo detenidamente...

Se dio cuenta de que la cromatina sufría modificaciones a lo largo de la vida

de una célula y especialmente en el proceso de división celular. Descubrió que antes
de la división celular la cromatina se aglutinaba en una especie de bastones dobles,
que en el momento de la división se separaban y cada uno se incorporaba a una
célula de las dos que se formaban. Estos bastones de cromatina que se duplicaban
antes de dividirse la célula fueron llamados "cromosomas" por esa misma época.

En 1885, el embriólogo belga Eduard van Beneden descubrió que los óvulos
y espermatozoides tienen sólo la mitad de cromosomas que las células ordinarias de
un organismo. Cuando se unen un óvulo y un espermatozoide, el óvulo fertilizado (el
cigoto) posee ya la serie completa de cromosomas (la mitad aportada por la madre
y la mitad por el padre). Y a partir del cigoto, el juego completo de cromosomas se
transmite al resto de células que forman el organismo mediante las sucesivas
duplicaciones y reparto a las células hijas en las divisiones celulares.

Hoy en día se usa una terminología especial para describir esto: se dice que el
número de cromosomas de las células somáticas es de 2n. Durante
la mitosis (división celular), el número de cromosomas se mantiene. Una célula con
2n cromosomas duplica su material genético (de 2n a 4n cromosomas) antes de

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dividirse para formar dos células con 2n cromosomas cada una. Asimismo,
cada una de las células hijas recibe una copia de cada cromosoma de la célula
madre.

En la meiosis (el proceso de división a través del cual las células

germinales dan lugar a gametos), una célula germinal con 2n cromosomas
forma cuatro células con n cromosomas. En primer lugar, la célula duplica su
número de cromosomas (de 2n a 4n) y, a continuación, se somete a dos
divisiones. En la primera división meiótica, los cromosomas homólogos
duplicados se alinean, uno junto al otro, y un cromosoma de cada par
homólogo pasa a cada una de las dos células hijas resultantes. En la segunda
división meiótica, las cromátidas hermanas de cada cromosoma se separan,
siendo el resultado 4 células con una dotación de n cromosomas cada una.
Hoy en día llamamos a las células con 2n cromosomas células diploides. Las
células con n cromosomas (los gametos y las células de los organismos
menos desarrollados) se denominan haploides. El comportamiento de los
cromosomas es el mismo comportamiento que predijo Mendel para sus
"unidades de herencia". Esto condujo a la idea de que los cromosomas y las
unidades de herencia eran una misma cosa.

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 LA CROMATINA
La cromatina es el conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas que
se encuentra en el núcleo de las células eucariotas y que constituye el cromosoma
eucariótico. Las unidades básicas de la cromatina son los nucleosomas. Éstos se
encuentran formados por aproximadamente 146 pares de bases de longitud (el
número depende del organismo), asociados a un complejo específico de 8 histonas
nucleosómicas (octámero de histonas). Cada partícula tiene una forma de disco, con
un diámetro de 11 nm y contiene dos copias de cada una de las 4 histonas H3, H4,
H2A y H2B. Este octámero forma un núcleo proteico alrededor del que se enrolla la
hélice de ADN (da aproximadamente 1,8 vueltas). Entre cada una de las asociaciones
de ARN e histonas existe un ADN libre llamado ADN "espaciador", de longitud
variable entre 0 y 80 pares de nucleótidos que garantiza flexibilidad a la fibra de
cromatina. Este tipo de organización, permite un primer paso de compactación del
material genético, y da lugar a una estructura parecida a un "collar de cuentas".
Posteriormente, un segundo nivel de organización de orden superior lo
constituye la "fibra de 30nm" compuestas por grupos de nucleosomas empaquetados
uno sobre otros adoptando disposiciones regulares gracias a la acción de la histona
H1.Finalmente continua el incremento del empaquetamiento del ADN hasta obtener
los cromosomas que bservamos en la metafase, el cual es el máximo nivel de
condensación del ADN.
El nucleosoma

Los resultados obtenidos a partir de la utilización de técnicas como la

digestión con nucleasa, la centrifugación analítica y la microscopía electrónica han
demostrado que la subunidad fundamental de la cromatina consiste en una estructura
con una precisa estequiometría de histonas y DNA, llamada nucleosoma (Wolffe,
1998). El nucleosoma es el primer nivel de compactación de la cromatina y consiste
en el enrollamiento del DNA alrededor de un cuerpo central formado por 8
moléculas de histona. Este octámero está formado por un tetrámero de histonas H3-

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H4 flanqueado por dos dímeros de H2A-H2B. Las histonas son pequeñas
proteínas básicas con una región central altamente estructurada (denominada
dominio de plegamiento de histona) y las colas N y C terminales que no
adoptan una estructura secundaria definida. Las histonas se distribuyen en el
octámero como una superhélice espiral de proteínas que forma una rampa
sobre la que se coloca el DNA (Arents et al., 1991; Arents y Moudrianakis,
1993).
Cada octámero tiene aproximadamente 1.7 vueltas de DNA alrededor
suyo y cada nucleosoma es conectado al siguiente por un DNA de unión, la
longitud del cual varía dependiendo de la especie o incluso del tipo de célula.
Diferentes nombres han sido utilizados para diferentes tipos de estructura
nucleosomal en función de la longitud del DNA unido a éste. El octámero
de histonas con 146 pb de DNA enrollado a su alrededor tiene el nombre
de partícula núcleo. La misma estructura con una molécula de histona H1 (H5
en aves) unida al DNA en el punto donde éste entra y sale de la partícula
núcleo (aproximadamente 170 pb de DNA) es conocido como el
cromatosoma. La estructura completa, incluyendo el DNA de unión
(aproximadamente 35 pb), la partícula núcleo y la histona H1/H5, forman el
nucleosoma sensu stricto (ver figura 1.1.1A). La formación de la fibra
nucleosomal compacta el DNA 7 veces, y produce una fibra de cromatina de
10 nm de diámetro correspondiente a lo observado por microscopía
electrónica cuando las muestras están preparadas a baja fuerza iónica.

A B
1
0
 Figura 1.1.1 Estructura de la partícula núcleo, cromatosoma y nucleosoma
(Sumner, 2003) (A). Estructura del nucleosoma a una resolución de 2.8 Å (Rhodes,
1997) (B).

La estructura del nucleosoma ha sido determinada a alta resolución, gracias a

estudios realizados mediante cristalografía de rayos X (Luger et al., 1997). La parte
central de las moléculas de histona forman el núcleo del nucleosoma, mientras que
las colas N y C terminales se extienden hacia fuera (ver figura 1.1.1B) (Rhodes,
1997). La unión entre el DNA y las histonas es de naturaleza electroestática entre los
grupos cargados positivamente de las histonas y las cargas negativas de los fosfatos
del DNA. De esta manera, al aumentar la fuerza iónica del medio podemos provocar
la disociación de las histonas respecto el DNA (Burton et al., 1978).
La fibra de cromatina

Mucha información a cerca de la organización de orden superior de la cadena

de nucleosomas se ha conseguido gracias a la visualización por microscopía
electrónica de fragmentos de cromatina preparados bajo diferentes condiciones
(Thoma et al., 1979). Estas observaciones mostraron que a muy baja fuerza iónica
(0.2 mM EDTA, 1 mM Trietanolamina-HCl) la cromatina aparecía como una cadena
de nucleosomas en forma de zig-zag (ver también Woodcoock et al., 1993; Leuba et
al., 1994). Cuando se incrementaba la fuerza iónica hacia niveles más fisiológicos
(aproximadamente 100 mM) el zig-zag de nucleosomas se condensaba formando una
fibra irregular de 30 nm de diámetro. Esta fibra de 30 nm ha sido objeto de muchos
estudios puesto que sus dimensiones y apariencia general son muy similares a las

1
1
fibras observadas en cromatina obtenida a partir de núcleos interfásicos
(Thoma et al., 1979).
1.2.1 Dinámica de la cromatina
Es conocido que la cromatina participa activamente en un gran
número de procesos celulares (e.g. transcripción y replicación), sin embargo,
la función principal que se le atribuye es la del plegamiento del DNA.
Los primeros estudios sobre la importancia de las histonas de unión en
la estructura de la fibra de 30 nm, revelaron que éstas tenían un papel
esencial. Thoma y Koller (1981), vieron que la ausencia de solamente el 10%
de las histonas H1/H5 impedía el plegamiento de la cromatina en la estructura
condensada de 30 nm. Sin embargo, experimentos más recientes con
Tetrahynema, demostraron que este organismo podía crecer normalmente con
la ausencia total de las histonas de unión (Dasso et al., 1994; Wolffe et al.,
1997). A pesar de esta observación, se pudo apreciar que el tamaño del núcleo
se incrementaba dos veces. Este incremento en el tamaño sugiere una menor
compactación de la cromatina debido a la ausencia de las histonas de unión.
Por tanto, parece ser que las fibras de cromatina formadas sin la presencia de
histonas de unión no presentan la misma estructura que las fibras de
cromatina nativas. Este hecho viene confirmado por estudios realizados en
nuestro laboratorio (Bartolomé, 1994), en los cuales fibras de cromatina sin
histonas H1 tienen un comportamiento diferencial en geles de agarosa no
desnaturalizados en presencia de 1.7 mM de Mg2+, respecto a las fibras
nativas. Otro elemento clave estructural para la fibra de cromatina son las
colas N y C terminales de las histonas. Experimentos realizados mediante
digestiones enzimáticas han demostrado que la integridad de dichas colas es
absolutamente esencial para la formación de la fibra de 30 nm (Fletcher y
Hansen, 1996; Widom, 1998).
El proceso de compactación de la cromatina es dependiente de la
concentración y de la naturaleza de los iones presentes en el medio. Así, se ha
observado que la concentración de iones monovalentes necesarios para
provocar el plegamiento de la cromatina es mayor que la de iones divalentes
(Thoma et al., 1979; Ausió et al., 1984; Widom, 1989; Hansen, 2002). Este
1
2
efecto forma parte de un fenómeno más amplio que implica que cuanto mayor es la
valencia del ion, mayor es su capacidad estructurante, siendo menor la concentración
necesaria para plegar la cromatina (Koch et al., 1988). Utilizando estas
observaciones y la teoría de los polielectrolitos de Manning (1978), Clark y Kimura
(1990) realizaron un estudio que les permitió concluir que el plegamiento de la
cromatina es un proceso de naturaleza electroestática. En este mismo sentido,
Subirana (1992) postuló que el plegamiento de la cromatina podía ser producto de la
neutralización de las cargas del DNA. Así, al aumentar la fuerza iónica, la fibra de
cromatina se plegaría buscando la estructura con un mínimo de energía.
Sin embargo, los fenómenos de plegamiento-desplegamiento en la cromatina
in vivo debidos a una variación en la fuerza iónica, deben de ser diferentes respecto a
lo observado in vitro, puesto que las condiciones iónicas del núcleo celular son
suficientemente elevadas como para que la cromatina se encuentre empaquetada en
forma de fibra de 30 nm (Alberts et al., 2002). En la célula, muchos de los
fenómenos locales de condensación-descondensación se producen gracias a la unión
de factores de transcripción u otras proteínas en secuencias específicas iniciando la
desestructuración de una zona concreta del genoma (ver por ejemplo Adams y
Workman, 1995; Tsukiyama et al., 1995). Estas proteínas, incluso pueden modificar
químicamente a las histonas mediante procesos de acetilación (Marsmorstein y Roth,
2001), metilación (Zhang y Rheinberg, 2001), fosforilación (Wolffe y Hayes, 1999),
ubiquitinización y ribosilación, ayudando así a la desestabilización de la fibra de 30
nm.
La fuerza iónica también juega un papel fundamental en la estructura de la
cromatina cuando se encuentra en su nivel más elevado de compactación. Diversos
autores han trabajado con cromosomas metafásicos, sometiéndolos a diferentes
cambios de concentración iónica (Maniotis et al., 1997; Bojanowski y Ingber, 1998;
Poirier et al., 2002). En estos experimentos se apreció como los cromosomas se
condensaban y descondensaban de forma reversible, confirmando que las
interacciones electroestáticas en la cromatina son esenciales en el mantenimiento de
la estructura del cromosoma metafásico. En el interior de la célula eucariota existe
una gran cantidad de iones (tabla 1.2.1) que con toda probabilidad tienen un papel
crucial en estas interacciones electroestáticas, especialmente los iones monovalentes
1
3
(Na+ y K+) y divalentes (Mg2+ y Ca2+). Strick et al. (2001) investigaron la
distribución tridimensional de estos iones en la célula durante la interfase y la
mitosis celular. Estos estudios realizados por microscopía iónica de barrido
han mostrado que los cationes Mg2+ y Ca2+ son específicamente requeridos
por la célula para la condensación de la cromatina en cromosomas mitóticos.

Tabla 1.

Composición iónica intracelular

Componente Concentración (mM)

Na+ 5-15a/b
K+ 140a/b
Mg2+ en núcleo interfásico 2-4c Mg2+ en
cromosoma metafásico (1) 12-22c
Ca2+ en núcleo interfásico 4-6c Ca2+ en
cromosoma metafásico (2) 20-32c
Cl- 4-15a/b
CO3H- 10b
Fosfato 11b

ATP 5-10b/c

Se indican sólo las concentraciones de los principales iones

intracelulares.

1.2.1.1 Autoasociación de la cromatina

A diferencia de la enorme importancia de las histonas para conseguir

1
4
 un plegamiento correcto de la fibra de cromatina, la continuidad del DNA entre los
diferentes nucleosomas no parece ser tan importante. Ruiz-Carrillo et al. (1980)
observaron que la digestión de la cromatina con nucleasa micrococal no afectaba a la
estructura de la fibra. Este resultado indica que las interacciones histona-histona e
histona-DNA son suficientes para mantener la estructura compacta de la cromatina.
Evidencias a favor de la autoasociación de la cromatina han sido encontradas por
diferentes grupos (Jorcano et al., 1980; Pérez-Grau et al.,1982). Más recientes son los
trabajos de Bartolomé et al. (1994) en los cuales, mediante técnicas electroforéticas y
de microscopía electrónica en condiciones estructurantes, se demostró que
fragmentos de cromatina de 3-4 nucleosomas podían autoasociarse formando
estructuras muy similares a las fibras nativas de cromatina.
Por otro lado, experimentos con microscopía de luz polarizada y con
criomicroscopía electrónica han mostrado pruebas a favor del apilamiento de
nucleosomas en columnas fuertemente empaquetadas formando hexámeros, en
presencia de poliaminas y NaCl 100 mM (Leforestier et al., 1999). También han sido
observadas otras estructuras autoorganizadas en forma bicapas, bajo condiciones
similares a las fisiológicas (Leforestier et al., 2001). Presumiblemente estos
resultados están directamente relacionados con otros trabajos previos procedentes de
diferentes laboratorios que muestran que partículas núcleo aisladas tienen una fuerte
tendencia para interactuar a través de sus caras formando arcos y hélices compactas
(Finch et al., 1977; Dubochet y Noll, 1978; Uberbacher y Bunich, 1985).
El apilamiento de partículas núcleo en estas estructuras podría ser debido a
las interacciones electroestáticas entre las histonas del octámero. De hecho, los
estudios por cristalografía de rayos X del nucleosoma (Luger et al., 1997) han
mostrado que las colas extendidas amino terminales de las histonas podrían
interaccionar entre sí entre nucleosomas adyacentes. A pesar de que las figuras
autoasociadas observadas no se parecen a las fibras de cromatina nativas, algunos
autores han sugerido que las interacciones cara-cara entre nucleosomas podrían ser la
fuerza que llevara a la formación de estructuras de orden superior en la cromatina
(ver por ejemplo Leforestier et al., 2001).

1.2.2 Modelos estructurales

1
5
 A diferencia de la fibra de cromatina no condensada, las imágenes de
microscopía electrónica obtenidas de la cromatina plegada no permiten ver la
colocación de los nucleosomas individuales, lo que hace muy difícil el
estudio de su estructura (Widom, 1989; Woodcock y Horowitz, 1995; van

Holde y Zlatanova, 1995, 1996). Este hecho ha propiciado la búsqueda de

pruebas indirectas para determinar la colocación de los nucleosomas en la
fibra de cromatina. A lo largo del tiempo, se han acumulado una gran
cantidad de resultados experimentales que en muchos casos han conducido a
interpretaciones contradictorias. El resultado ha sido la aparición de varios
modelos estructurales.

1
6
1.2.2.1 Modelo de solenoide

Finch y Klug (1976), usando técnicas de microscopía electrónica de

transmisión propusieron un modelo para la estructura de la fibra de 30 nm en la cual
la cadena de mononucleosomas es compactada por enrollamiento en una estructura
simple de solenoide. En este modelo habrían aproximadamente 6 nucleosomas por
vuelta de hélice y un paso de rosca de 11 nm (equivalente al diámetro de un
1
7
nucleosoma) (ver figura 1.2.1A). Este paso de rosca se estableció gracias a la
observación en microscopía electrónica de estrías transversales separadas por
11 nm. Posteriormente, en estudios de difracción de rayos X de fibras de
cromatina parcialmente orientadas (Widom y Klug, 1985) se encontraron una
mancha meridional correspondiente a un espaciado de 11 nm que sugería la
colocación radial de los nucleosomas con su eje de simetría perpendicular al
eje de la fibra e inclinados entre 20 y 30º. Otros autores, a partir de estudios
de dispersión de neutrones (Suau et al., 1979) y de dicroísmo eléctrico
(Yabuki et al., 1982; McGhee et al., 1983) han dado soporte al modelo
solenoidal. En el modelo de solenoide, para construir la hélice sencilla de
nucleosomas, hace falta que el DNA de unión entre nucleosomas se pliegue.
1.2.2.2 Modelo de superbead

En este modelo, los autores propusieron un plegamiento de la

cromatina en el cual se formaban agrupaciones discontinuas de nucleosomas
llamados superbolas (superbeads). Este modelo se planteó a partir de la
observación en microscopio electrónico de partículas esféricas con 12
nucleosomas por partícula y el mismo diámetro que la fibra de 30 nm en
muestras de cromatina digeridas con nucleasa micrococal (Kiryanov et al.,
1976; Franke et al., 1976).

1.2.2.3 Modelos helicoidales de doble origen

Son modelos en los cuales se propone que la fibra de cromatina se
pliega helicoidalmente a partir del zigzag de nucleosomas observado a baja
fuerza iónica.
Woodcock et al. (1984), basándose en este tipo de modelo,
propusieron que el zigzag de nucleosomas se condensaría helicoidalmente
formando una doble hélice en las que el DNA de unión quedaría paralelo al
eje de la fibra. Cada vuelta de la hélice estaría formado por 18 nucleosomas,
la fibra tendría 30 nm de diámetro y un agujero central de 8 nm (ver figura
1.2.1B). Este modelo, llamado de cinta helicoidal, es más compacto que otros
modelos, ya que presenta 11.6 nucleosomas por cada 11 nm en vez de los 6
nucleosomas por 11 nm del modelo solenoide. Diversos autores han aportado
1
8
datos a favor de este tipo de modelo (ver revisión crítica realizada por Woodcock y
Dimitrov, 2001).

Figura 1.2.1 Modelo solenoidal de la cromatina (A). (Figura adaptada de

Widom y Klug, 1985). Modelo de la cinta helicoidal (B). (Figura adaptada de
Woodcock et al., 1984).

Otra variante de los modelos helicoidales es el propuesto por Willams et al.

(1986) a partir de observaciones en las cuales el diámetro de las fibras plegadas
aumentaba al aumentar la longitud del DNA de unión (Williams y Langmore, 1991).
En este modelo el zigzag de nucleosomas se empaquetaría sobre su propio eje
formando una doble hélice con un paso de rosca de 26 nm y con un número de
nucleosomas por vuelta que dependería de la longitud del DNA de unión (Smith et
al., 1990). Los nucleosomas están conectados por el DNA de unión, que atravesaría
la fibra por el interior, de forma rectilínea con una trayectoria perpendicular respecto
al eje de la fibra.

1.2.3 Modelo de solenoide interdigitado compacto

Nuestro grupo de investigación también ha sugerido un tipo de modelo para
el plegamiento de la cromatina en fibras de 30 nm. Los resultados que han permitido
sugerir este modelo se han obtenido a partir de estudios de electroforesis no
desnaturalizante en geles de agarosa y de microscopía electrónica (Bartolomé et al.,
1
9
1995; Daban y Bermúdez, 1998).

1.2.3.1 Electroforesis de cromatina en geles no desnaturalizantes de

agarosa en presencia de MgCl2 1.7 mM

Este tipo de electroforesis se ha utilizado por nuestro grupo para el

estudio de la estructura de la cromatina. Concretamente se ha podido
constatar que al analizar fragmentos de cromatina de eritrocitos de pollo de
un tamaño de 6-50 nucleosomas se produce una banda bien definida. Esta
banda tiene prácticamente la misma movilidad independientemente del peso
molecular del fragmento. Este comportamiento no se observa en geles con
fuerzas iónicas más bajas. Cuando se analizaba la movilidad de los
fragmentos de entre 3-6 nucleosomas, se podían ver dos tipos de
comportamiento electroforético. Los fragmentos de 3-6 nucleosomas daban
una banda amplia y de movilidad electroforética creciente al disminuir el peso
molecular, pero también se producía la típica banda de los fragmentos de
cromatina de tamaño molecular más grande (a partir de ahora referida como
banda retardada).
Cuando se analizó el contenido en histonas de estos fragmentos de 3-6
nucleosomas, se vio que los fragmentos que daban lugar a la banda retardada
tenían un contenido típico en histonas de unión (H1-H5), mientras que los
fragmentos que daban lugar a las otras bandas de movilidad superior tenían
un bajo contenido de este tipo de histonas (Bartolomé et al., 1995) (ver figura
1.2.2).

Figura 1.2.2
Electroforesis de agarosa al
0.5% (p/v) en tampón Tris 90
mM, Borato 90 mM con Mg2+
1.7 mM. La muestra cargada
es una distribución de
fragmentos de cromatina de 1

2
0
a 11 nucleosomas (Cro) que se separaron en fracciones utilizando un aparato Prep
Cell 491 de Bio-Rad Laboratories. Los pesos moleculares de los marcadores
señalados están indicados en kb (figura extraída de Martin, 1999).

1.2.3.2 Análisis de las fibras de cromatina por microscopía electrónica

La cromatina extraída de la banda retrasada del gel de agarosa en presencia de

MgCl2 1.7 mM, entrecruzada con gluteraldehído y platinada en rotación en un ángulo
de 7º, cuando era observada por microscopía electrónica, daba lugar a estructuras
circulares con una mayor acumulación de platino en la periferia que en el centro
(Bartolomé et al., 1995). Estas estructuras circulares tienen un diámetro constante
(aproximadamente de unos 33 nm) para fragmentos de cromatina entre 10 y 36
nucleosomas. La altura de estas estructuras (medida cuando la platinación era
unidireccional) aumentaba al aumentar el número de nucleosomas.
Por tanto, estos resultados indican que se trata de estructuras cilíndricas que
se colocan verticalmente sobre la rejilla del microscopio. En las imágenes obtenidas,
también se observan otros elementos estructurales:
1) Una periferia helicoidal.

2) Un anillo de 11 nm de grosor con una serie de barras radiales

(aproximadamente seis) que podrían corresponder a nuclesomas.
3) Un agujero central de 7-12 nm.
En estudios de desnaturalización parcial (Bermúdez et al., 1998) se consiguió
generar lazos de DNA con longitudes correspondientes a 1, 2 o 3 nucleosomas
consecutivos desnaturalizados que salían radialmente de las fibras, hecho que
demuestra una distribución radial de los nucleosomas. Otro punto que apoya la
distribución radial de los nucleosomas es la observación de que los puntos de entrada
y salida del DNA de los lazos correspondientes a dos nucleosomas consecutivos
desnaturalizados están relativamente cercanos. Esta observación sugiere que los
nucleosomas consecutivos no están en posiciones opuestas respecto el eje de la fibra.
Por lo que se refiere a los fragmentos de cromatina entre 3-6 nucleosomas que
presentan dos tipos diferentes de comportamiento electroforético, se ha visto que los
que generan la banda retardada (es decir, los que tienen un contenido normal de
histonas de unión) también forman estas típicas estructuras circulares compactas. Por

2
1
el contrario, la banda rápida no forma estas estructuras. Esto demuestra que
los nucleosomas poseen las propiedades necesarias para formar estructuras
plegadas tan estables que no requieren de la continuidad del DNA. Todas
estas características estructurales son consistentes con el modelo solenoidal
pero las alturas medidas de las fibras indican un grado de compactación
mayor.

1.2.3.3 Modelo de solenoide propuesto por nuestro grupo

El conjunto de todos estos resultados ha permitido sugerir una familia

de modelos estructurales para el plegamiento de las fibras de cromatina de
eritrocito de pollo en presencia de MgCl2 1.7 mM.
Este tipo de modelos solenoidales empiezan con la formación de una
hélice primaria, formada por un número de nucleosomas por vuelta no entero
e igual o inferior a seis nuleosomas. La sucesiva formación de hélices
primarias provoca la interdigitación de los diferentes pisos, formando hélices
secundarias, las cuales están estabilizadas gracias a los contactos laterales
entre las caras de los nucleosomas. El sentido del giro de las hélices
secundarias es el mismo que en las hélices primarias. La tendencia de los
nucleosomas a interaccionar lateralmente formando arcos y hélices ya ha sido
descrita por otros laboratorios.El hecho que las hélices primarias se intercalen
entre si formando hélices secundarias, provoca una mayor compactación de la
fibra respecto a otros modelos solenoidales típicos. Concretamente, el modelo
de solenoide estándar
produce una reducción de la
longitud del DNA de 40
veces, mientras que en
nuestro modelo, la reducción
es de 90 veces

Figura 1.2.3 Modelo

de solenoide interdigitado
compacto (C) comparado
2
2
 con el modelo del solenoide normal (E). En ambos esquemas se representa la
distribución de 35 nucleosomas con 4.74 nucleosomas por vuelta en el solenoide
interdigitado y 5 en el solenoide normal. También se muestra la visión zenital (B y
D) de las estructuras C y E. A muestra la primera vuelta completa de la hélice
primaria y parte de la segunda vuelta. (Figura de Daban y Bermúdez, 1998).
Figura 1.2.4 Familia de
modelos del solenoide interdigitado
compacto. (A) Fibra de 2.8
nucleosomas por vuelta, 2.35 nm de
paso de rosca y con una orientación
de sus nuclesomas con respecto al
eje de 20º. En (B), (C) y (D) el
número de nuclesomas por vuelta es
de 3.76, 4.76 y 5.77, l paso de rosca
de 3.08, 3.84 y 4.73 nm, y la
orientación de 29, 40 y 52º
respectivamente.

Los diferentes modelos del solenoide interdigitado compacto se diferencian entre si

por el número de nucleosomas en cada vuelta de hélice primaria (ver figura 1.2.4). En
todos los casos el diámetro externo de las fibras es de 36 nm. En estos modelos se
desconoce la trayectoria del DNA de unión, pero en el caso de eritrocito de pollo (60-
64pb) se podría situar en el espacio dejado por el agujero central, sin ningún tipo de
impedimento estérico. Esta familia de modelos es válida tanto para hélices dextrógiras
como levógiras. De hecho, al observar las fibras por microscopía electrónica, se ha
visto que ambos tipos de hélices coexisten (Daban y Bermúdez, 1998).

2
3
Figura. La cromatina es una estructura compleja con varios niveles de organización. En la
imagen se describe la compactacion desde la doble hélice hasta el cromosoma metafasico.

1.3.1.1 Histonas

Además de las consideraciones básicas sobre las histonas en la

cromatina presentadas anteriormente, hay otros aspectos que cabe destacar.
El papel de fosforilación de la histona de unión H1 en el cromosoma
mitótico, está todavía poco claro. Tradicionalmente se ha creído que la
función de esta modificación post-traduccional per se, ha sido la de dirigir la
condensación cromosómica. Sin embargo, los resultados más recientes van
contra esta posibilidad (ver por ejemplo, Guo et al., 1995). Algunos estudios
han sugerido que la fosforilación de la histona H1 podría provocar la
activación de la fosforilación de la histona H3, la cual si tiene un claro papel a
2
4
 favor de la condensación mitótica. También cabría la posibilidad de que la propia
fosforilación provocara la separación de la histona H1 con la cromatina,
favoreciendo de este modo el acceso de otros factores de condensación (Hirano,
2000).
La histona H3 es fosforilada en la serina-10 durante la mitosis. Esta
modificación está estrechamente unida temporal y espacialmente a la condensación
cromosómica. Se han planteado dos posibles alternativas para explicar el papel de la
fosforilación de la histona H3 en la condensación de los cromosomas mitóticos. En la
primera alternativa, la histona H3 fosforilada actuaría como un receptor directo,
reclutando factores de condensación. En la segunda posibilidad (al igual que uno de
los dos posibles modelos para la histona H1) la fosforilación reduciría la afinidad de
la histona H3 por el DNA, permitiendo la unión de factores de condensación a la
cromatina (Hirano, 2000).
1.4. ¿Cómo se encuentra la cromatina en las células?
Las unidades básicas de la cromatina son los nucleosomas. Estos se
encuentran formados por aproximadamente 146 pares de bases de longitud (el
número depende del organismo), asociados a un complejo específico de ocho
histonas nucleosómicas (octámero de histonas). Cada partícula tiene una forma de
disco, con un diámetro de 11 nm y contiene dos copias de cada una de las cuatro
histonas H3, H4, H2A y H2B. Este octámero forma un núcleo proteico, alrededor del
cual se enrolla la hélice de ADN (de aproximadamente 1,8 vueltas). Entre cada una
de las asociaciones de ADN e histonas existe un ADN libre llamado ADN
espaciador, de longitud variable entre 0 y 80 pares de nucleótidos que garantiza
flexibilidad a la fibra de cromatina. Este tipo de organización, permite un primer
paso de compactación del material genético, y da lugar a una estructura parecida a un
"collar de perlas".

2
5
 Diferentes niveles de condensación de ADN. (1) Hebra simple de
ADN. (2) Hebra de cromatina (ADN con nucleosomas, conformados
por histonas, "cuenta de collar"). (3) Cromatina durante
la interfase con centrómero. (4) Cromatina condensada durante
la profase (dos copias de ADN están presentes). (5) Cromosoma durante
la metafase.

1.5. Sitio de hipersensibilidad de DNAsa

Un sitio hipersensible a DNasa es una pequeña región de

la cromatina sensible a la acción de la enzima DNasa I. En estas regiones
concretas del genoma, la cromatina pierde su estructura condensada y expone
el DNA, es decir, son zonas accesibles de la cromatina, por lo tanto aumenta
la sensibilidad del DNA a ser degradado por enzimas como la DNasa I. Estas
zonas de cromatina accesible están relacionadas con la actividad
transcripcional, y se ha visto que para la remodelación que sufre la cromatina
se necesitan proteínas que unen DNA, como son los factores de transcripción.

De este modo, desde el descubrimiento de los DHS hace 30 años, se

han utilizado estos como marcadores del DNA regulador, lo que ha sido la
base del descubrimiento de todas las clases de elementos cis-reguladores, que
incluyen: promotores, potenciadores, aislantes, silenciadores y regiones de
control del locus.1

1.5.1. Analisis masivo.

El proyecto ENCODE se propuso realizar una cartografía completa de

2
6
los DHS en el genoma humano y así poder catalogar el DNA regulador humano.

Los DHS marcan regiones transcripcionalmente activas del genoma. Esta

actividad transcripcional tiene una marcada selectividad celular. Por eso, se usaron
en este estudio 125 tipos celulares humanos distintos para poder abarcar todas las
regiones activas. De este modo, mediante la técnica de secuenciación masiva se
obtuvieron los perfiles de DHS de cada tipo celular. Mediante el análisis de los datos
se identificaron casi 2,9 millones de DHS distintos. El 34% eran específicos de un
tipo celular, y solo una pequeña minoría (3.692) se detectó en todos los tipos
celulares. También se pudo comprobar que tan solo el 5% de los DHS se encontraban
en regiones TSS (del inglés, Transcriptional Start Sites) y el 95% restante
representaban DHS distales, repartidos de manera uniforme entre regiones intrónicas
e intergénicas. Estos datos nos dan una idea de la gran complejidad reguladora de la
expresión génica en el genoma humano y la cantidad de elementos que controlan esta
regulación.

1.5.2. Herramienta para el DNA regulador

El estudio de los perfiles de DHS, combinado con otras técnicas, permite

realizar estudios sobre el aspecto del DNA regulador humano.

Factores de transcripción: Mediante la técnica de ChIP-Seq se determinaron

los sitios de unión al DNA de un cierto grupo de factores de transcripción, lo que se
comparó con los perfiles de DHS. Los resultados confirmaron una alta correlación, lo
que nos indica que la unión coordinada de ciertos factores está implicada en la
remodelación y accesibilidad de la cromatina.
Metilación del DNA: Se ha vinculado estrechamente la metilación en
citosinas en islas CpG con el silenciamiento génico. Esta metilación provoca un
reordenamiento en la cromatina, condensándola e inactivándola
transcripcionalmente. Se ha visto que las islas CpG metiladas en el interior de los
DHS impiden la asociación de los factores de transcripción con el DNA, inhibiendo
su accesibilidad. Se ha demostrado que cuando hay poca cantidad del factor de
transcripción las secuencias de DNA a las que se une sufren metilación pasiva,
produciéndose una regulación negativa de la expresión.
Marca promotora de la cromatina: La modificación postraduccional de
2
7
 metilación de la histona H3 (H3K4me3) está relacionada con la activación
transcripcional. Esta modificación se localiza en los nucleosomas adyacentes
al sitio de inicio de la transcripción, relajando la estructura de la cromatina.
Por este motivo, esta modificación histónica se usa como marcador de
promotores, utilizándose para catalogar estos elementos en el genoma
humano.
Interacciones promotor/potenciador: Algunos elementos cis-
reguladores distales, como son los potenciadores, se encargan de modular la
actividad de los promotores. Por este motivo, los cis-reguladores distales
están activamente sincronizados con su promotor en aquellas líneas celulares
en las que está activa la expresión del gen que controlan. Usando los perfiles
de DHS se buscaron correlaciones entre los DHS para identificar estas
interacciones promotor/potenciador. Así se llegó a un mapa de potenciadores
candidatos que controlan la expresión de genes específicos.
Los datos obtenidos se validaron con la técnica 5C (chromosome
conformation capture carbon copy). Esta técnica se basa en la asociación
física que existe entre el promotor y los potenciadores, determinando aquellas
regiones de la cromatina que entran en contacto en las interacciones
promotor/potenciador. Se comprobó que la mayoría de los promotores
estaban relacionados con más de un potenciador, lo que indica la existencia
de una compleja red de regulación para la inmensa mayoría de los genes.
Sorprendentemente, también se halló que aproximadamente la mitad de los
elementos potenciadores se encontraban asociados a más de un promotor.
Este descubrimiento, muestra que el sistema cis-regulador humano es mucho
más complejo de lo que se pensó en un principio.
El número de elementos cis-reguladores distales conectados a un
promotor proporciona una medida cuantitativa de la complejidad reguladora
de un gen. De esta manera, se determinó que los genes humanos con mayores
interacciones con DHS distales, y por lo tanto con una regulación más
compleja, correspondía a aquellos genes relacionados con funciones del
sistema inmune. Esto nos indica que las señales ambientales procesadas por
el sistema inmune y su alta complejidad celular están codificadas
2
8
directamente en la arquitectura cis-reguladora de sus genes constituyentes.

1.6. Clases de cromatina.

La cromatina se puede encontrar en dos formas: EUCROMATINA Y

HETEROCROMATINA

HETEROCROMATINA, es una forma inactiva condensada localizada

sobre todo en la periferia del núcleo, que se tiñe fuertemente con las coloraciones. En
1928, Emil Heitz, basándose en observaciones histológicas, definió la
heterocromatina (HC) como los segmentos cromosómicos que aparecían muy
condensados y oscuros en el núcleo en interfase. De hecho, la cromatina está
formada de una maraña de fibras cuyo diámetro no solo varía durante el ciclo celular
sino que también depende de la región del cromosoma observada.
LA EUCROMATINA es una forma de la cromatina ligeramente compactada
con una gran concentración de genes, forma activa, está formada por una fibra de un
diámetro que corresponde al del nucleosoma, que es un segmento de ADN
bicatenario enrollado alrededor de homodímeros de las histonas H2A, H2B, H3, y
H4. En la eucromatina inactiva, esta fibra se enrolla sobre sí misma gracias a las
histonas H1 para formar el solenoide. La interacción con otras proteínas no histonas
2
9
 (topoisomerasa II, proteínas de andamiaje, lamininas, …) provoca mayores
grados de organización. En cuanto a la heterocromatina, la fibra que la
constituye se encuentra más condensada y a menudo aparece formada por
agregados. Su formación require numerosas proteínas adicionales, que
incluyen las proteínas HP1 (Heterochromatin Protein 1 o proteína de la
heterocromatina1).

La heterocromatina puede ser de dos tipos diferentes, la riqueza en

ADN satélite determina tanto la naturaleza permanente o reversible de la
heterocromatina, como su polimorfismo y propiedades de tinción.

Constitutiva, idéntica para todas las células del organismo y que

carece de información genética, incluye a los telómeros y centrómeros del
cromosoma que no expresan su ADN. La heterocromatina constitutiva
contiene un tipo particular de ADN denominado ADN satélite, formado por
gran número de secuencias cortas repetidas en tándem. Los tipos principales
de este ADN son el ADN satélite alfa, y los ADN satélite I, II y III. Estas
secuencias de ADN satélite son capaces de plegarse sobre sí mismas y
pueden tener un papel importante en la formación de la estructura altamente
compacta de la heterocromatina constitutiva. La heterocromatina constitutiva
es estable y conserva sus propiedades heterocromáticas durante todas las
etapas del desarrollo y en todos los tejidos. La heterocromatina constitutiva es
altamente polimórfica, probablemente debido a la inestabilidad del ADN
satélite. Este polimorfismos puede afectar, no solamente a su tamaño sino
también a la localización de la heterocromatina, y aparentemente no tiene un
efecto fenotípico. La heterocromatina constitutiva se encuentra fuertemente
teñida en la técnica de bandas C, lo que es el resultado de una
renaturalización muy rápida del ADN satélite tras la desnaturalización.
Facultativa, diferente en los distintos tipos celulares, contiene
información sobre todos aquellos genes que no se expresan o que pueden
expresarse en algún momento. Incluye al ADN satélite y al corpúsculo de
Barr. La heterocromatina facultativa se caracteriza por la presencia de
secuencias repetidas tipo LINE. Estas secuencias, dispersas a lo largo del

3
0
genoma, podrían promover la propagación de una estructura de cromatina
condensada. La heterocromatina facultativa es reversible, su estado heterocromático
depende de la etapa del desarrollo y del tipo celular. Dos ejemplos de este tipo de
heterocromatina son el cromosoma X inactivo (cuerpo de Barr) de las células
somáticas femeninas y la vesícula sexual inactiva en la etapa del paquiteno de las
meiosis masculinas. La heterocromatina facultativa no es particularmente rica en
ADN satélite, y por ello, no es polimórfica. La heterocromatina facultativa no se
encuentra nunca teñida en la técnica de bandas C.
Se ha visto que en la formación de heterocromatina frecuentemente participa
el fenómeno de ARN interferente. Por ejemplo, en Schizosaccharomyces pombe, la
heterocromatina se forma en el centrómero, telómeros y en el loci mating-type.3 La
formación de la heterocromatina en el centrómero depende del mecanismo de ARN
interferente (ARNi). ARN doble cadena complementarios son producidos de
secuencias repetidas localizadas en el centrómero, que inducen ARNi y
seguidamente metilación de la lisina 9 histona 3 y enlazamiento de Swi6 (proteína
estructural de la heterocromatina, la cual es homóloga a HP1 en mamíferos).4
Propiedades de la heterocromatina
A pesar de las diferencias descritas anteriormente, la heterocromatina
constitutiva y la heterocromatina facultativa tienen propiedades muy similares.
1. La heterocromatina está condensada. Este es, de hecho, lo que define la
heterocromatina, y por ello es aplicable tanto a la heterocromatina constitutiva como
a la facultativa. Esta elevada condensación la hace fuertemente cromofílica e
inaccesible a la DNAsa I y, en general, a otras enzimas de restricción.
2. El ADN de la heterocromatina se replica más tarde.
La incorporación de varios análogos de nucleótidos muestra que el ADN de
ambos tipos de heterocromatina se replica tarde. Esto es el resultado, por un lado, de
su elevado grado de condensación, que evita que la maquinaria replicativa acceda
fácilmente al ADN y, por otro lado, de su localización en un dominio nuclear
periférico pobre en elementos activos.
3. El ADN de la heterocromatina se encuentra metilado.
El ADN de la heterocromatina constitutiva se encuentra altamente metilado
en las citosinas. Por ello, un anticuerpo anti-5-metil citosina marca fuertemente todas
3
1
 las regiones de este tipo de heterocromatina.
Por lo que se refiere a la heterocromatina facultativa, la metilación de
su ADN es menor, aunque los análisis mediante enzimas de restricción
sensibles a metilación revelan una importante metilación de los islotes CpG,
específicamente localizados en las regiones que controlan la expresión de los
genes.
4. En la heterocromatina las histonas se encuentran hipoacetiladas.
Las histonas pueden sufrir una serie de modificaciones post-traduccionales en
sus extremos N-terminales que pueden afectar a la propia actividad genética
de la cromatina.
La hipoacetilación de las colas N-terminales de las histonas,
principalmente en las lisinas, están asociadas con la cromatina inactiva. Por el
contrario, las histonas hiperacetiladas son características de la cromatina
activa.
La acetilación/desacetilación de histonas es un mecanismo
absolutamente esencial para el control de la expresión génica. Existen
numerosos factores de transcripción que presentan una actividad
acetiltransferasa de histonas (HAT, Histone Acetyl Transferase) o
desacetilasa de histonas (HDAc o Histone De-Acetylase).
5. Las histonas de la heterocromatina se encuentran metiladas en la
lisina 9. La metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3-K9) parece que está
muy relacionada con el proceso de heterocromatinización del genoma, tanto
en la formación de heterocromatina constitutiva como facultativa.
6. La heterocromatina es transcripcionalmente inactiva.
A diferencia de lo que ocurre en Drosophila, la heterocromatina
constitutiva humana no contiene genes y la incorporación de uridina tritiada
en los cultivos celulares no producen ningún tipo de marcaje a este nivel.
La heterocromatina facultativa es relativamente pobre en genes, y
estos generalmente no se transcriben en el estado de heterocromatina.
7. La heterocromatina no participa en la recombinación genética.

3
2
 De modo general se acepta que la heterocromatina constitutiva no participa
en la recombinación genética. La no existencia de un emparejamiento preliminar de
las regiones heterocromatínicas homólogas se podría deber al polimorfismo
característico de estas regiones que lo dificultarían, aunque no lo harían imposible.
La heterocromatina constitutiva también actúa reprimiendo la recombinación en las
regiones de eucromatina adyacentes.•Por lo que respecta a la heterocromatina

facultativa, tampoco participa en la recombinación meiótica cuando se encuentra en

su forma inactiva.
1.7. Inactivación del cromosoma femenino o lyonizacion

Historia y primeras evidencias: El fenómeno epigenético llamado

inactivación del cromosoma X ha intrigado a los científicos durante décadas. En la
inmensa mayoría de los genes se expresan los dos alelos. Sin embargo, esto no es
posible en los cromosomas sexuales, ya que el número de cromosomas X e Y difiere
entre los dos sexos. M. Barr y E. Bertram observaron por primera vez en el núcleo un
corpúsculo condensado distinto del nucleolo y se dieron cuenta de que las gatas
normales poseen un único corpúsculo condensado mientras que los gatos no

3
3
 muestran ninguno. Estos investigadores se refirieron a este corpúsculo como
cromatina sexual y desde entonces se ha denominado corpúsculo de Barr. En
1999, Mary Lyon sugirió que este corpúsculo de Barr representaba un
cromosoma X inactivo el cual se enrolla en las hembras de manera compacta,
tomando la estructura conocida como heterocromatina, una forma condensada
y por tanto visible de la cromatina. Investigaciones recientes al microscopio
revelan que los extremos del corpúsculo de Barr están en estrecha
proximidad, formando un anillo. Varias evidencias apoyan la hipótesis de
Lyon. Primero, los varones XXY poseen un corpúsculo de Barr mientras que
las mujeres X0 no presentan ninguno. Segundo, las personas con un número
anormal de cromosomas X tienen un corpúsculo de Barr menos que
cromosomas X poseen por célula: las mujeres XXX presentan 2 corpúsculos
de Barr y las XXXX presentan tres.

Inactivación del cromosoma X

Pues resulta que el nivel de actividad de los genes que produce un

solo cromosoma X es la "dosis" normal para un ser humano. Los hombres
tienen esta dosis porque ¡solo tienen un cromosoma X! Las mujeres tienen la
misma dosis por una razón diferente: apagan uno de sus dos cromosomas X
en un proceso llamado inactivación del cromosoma X.

En la inactivación del cromosoma X, un cromosoma X se compacta,

(o como le gustaba decir a mi profesor de biología, "se hace bolita") para
formar una estructura pequeña y densa llamada cuerpo de Barr. La mayoría
de los genes en el cuerpo de Barr están inactivos, lo que significa que no se
transcriben.

Una mujer tiene dos cromosomas X, uno de cada padre. ¿Cuál va a

inactivar? La inactivación del cromosoma X es un proceso aleatorio que pasa
por separado en células individuales durante el desarrollo embrionario. Es
decir, una célula podría apagar el cromosoma X paterno, en cambio, su
vecina podría apagar el cromosoma X materno. Todas las células

3
4
descendientes de cada una de estas células originales mantendrá el mismo patrón de
inactivación del cromosoma X.

Nota interesante: si fueras un canguro ¡lo que acabo de decir no sería cierto!
En los canguros y otros marsupiales, siempre es el cromosoma X paterno el que
experimenta la inactivación del cromosoma X^22start superscript, 2, end superscript.

Ejemplo de inactivación del cromosoma X: gato calicó o carey

Un ejemplo clásico de la inactivación del cromosoma X puede verse en los

gatos. Si una gata es heterocigota para los alelos negro y naranja del gen del color del
pelo encontrado en el cromosoma X, inactivará cada uno de sus dos cromosomas X
(y así, cada uno de los dos alelos del gen del color del pelo) de forma aleatoria en
diferentes células durante el desarrollo.

El resultado es un patrón de pelaje carey, hecho de partes alternantes de pelo

negro y naranja. Las partes negras vienen de grupos de células en las cuales el
cromosoma X con el alelo negro está activo, mientras que las partes naranjas vienen
de células en las cuales el cromosoma X con el alelo naranja está activo.

3
5
 Imagen de un gato carey, que ilustra los procesos de inactivación del
cromosoma X responsables de las diferentes manchas de color en su pelaje.

Aunque raramente es tan fácil de ver como en el caso de los gatos

carey, las mujeres también son "mosaicos" para cualquiera de los genes que
están presentes en diferentes alelos en sus dos cromosomas X.

Aneuploidías de cromosomas sexuales

Cuando un organismo tiene una copia extra o faltante de un

cromosoma, se dice que es aneuploide. Las aneuploidías que involucran
autosomas (cromosomas no sexuales), especialmente de cromosomas
grandes, usualmente son tan dañinas para el desarrollo que un embrión
aneuploide no puede sobrevivir hasta el nacimiento.

Las aneuploidías de los cromosomas X, sin embargo, tienden a ser

mucho menos dañinas, a pesar del hecho de que el cromosoma X es grande.
Esto es más que nada gracias a la inactivación del cromosoma X. Aunque el
propósito del sistema de inactivación del cromosoma X es apagar el segundo
cromosoma X de una hembra XX, también puede hacer un buen trabajo al
apagar más cromosomas X si están presentes.

Ejemplos de aneuploidías del cromosoma X incluyen:

 Síndrome de triple X, en el cual una mujer tiene un genotipo XXX, que ocurre en
cerca de 111 de cada 100010001000 mujeres recién nacidas. Las mujeres con un
genotipo XXX tienen características sexuales femeninas y son fértiles (capaces de
tener hijos). En algunos casos, el síndrome de triple X puede asociarse con
dificultades del aprendizaje, desarrollo tardío de las habilidades motoras en los bebés
y problemas de tono muscular.
 Síndrome de Klinefelter, en el cual los hombres tienen un cromosoma X extra, lo
que lleva a un genotipo XXY (en casos aún más raros, el síndrome de Klinefelter
puede involucrar varios cromosomas X adicionales, lo que lleva a genotipos XXXY
o XXXXY). Los hombres afectados pueden ser infértiles o desarrollar menos
3
6
densidad muscular y pelo facial que los otros hombres. Se piensa que el síndrome de
Klinefelter afecta a 111 de cada 500500500 a 100010001000 hombres recién
nacidos.

Al igual que las mujeres, los varones XXY con síndrome de Klinefelter
convertirán un cromosoma X en un cuerpo de Barr dentro de cada célula. Las
mujeres con síndrome de triple X (y los varones Klinefelter con más de dos
cromosomas X) neutralizan sus X extras mediante la formación de cuerpos de Barr
adicionales. Por ejemplo, habría dos cuerpos de Barr en una célula de una mujer
XXX o un varón XXXY.

Diagrama que muestra los cromosomas sexuales y la formación de cuerpos de

Barr en seres humanos con diferentes genotipos del cromosoma sexual.

Mujer XX: un X activo, un cuerpo de Barr. Varón XY: un X activo, un Y,

ningún cuerpo de Barr. XXY (síndrome de Klinefelter): un X activo, un Y, un cuerpo
de Barr. Mujer XXX (síndrome triple X): un X activo, dos cuerpos de Barr.
3
7
 En el síndrome de Turner, a una mujer le falta un cromosoma X o
una parte de él (lo que la deja solo con un cromosoma X funcional). Las
personas con este trastorno se desarrollan como mujeres, pero a menudo
tienen estatura baja y pueden exhibir síntomas como infertilidad y
dificultades de aprendizaje. Se piensa que el síndrome de Turner ocurre en
cerca de 111 de cada 222500500500nacimientos de mujeres. Tiene efectos
relativamente leves porque los humanos normalmente solo tienen un
cromosoma X activo en las células de su cuerpo de todas formas.

Demostración de la hipótesis de Lyon

La prueba directa de la hipótesis de Lyon se produjo cuando, en

mujeres normales, los citólogos identificaron el corpúsculo de Barr como el
cromosoma X. Las pruebas genéticas también apoyan la hipótesis de Lyon:
las hembras heterocigóticas para un locus del cromosoma X muestran un
patrón peculiar de expresión fenotípica. Se sabe ahora que en los seres
humanos el cromosoma X es inactivado en cada célula alrededor del
decimosegundo día de vida fetal y además el azar determina qué cromosoma
X se inactiva en cada célula. A partir de este momento, el mismo cromosoma
X permanece como un corpúsculo de Barr para futuras generaciones
celulares. En lugar de ser hembras típicamente heterocigotas, son hemicigotas
en cada célula para uno u otro de los alelos del cromosoma X.

La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PD) es una enzima

controlada por un locus del cromosoma X que presenta dos formas alélicas.
Ambas son funcionales pero difieren solamente en un aminoácido, de forma
que pueden separarse por electroforesis. Puesto que el suero sanguíneo es un
conglomerado de proteínas de muchas células, el suero de un heterocigoto
presenta tanto la forma A como la forma B, mientras que cada célula presenta
solamente una u otra banda. Esto indica que en cada célula sólo se encuentra
activo uno de los dos cromosomas X.

Otro aspecto del sistema G-6-PD proporciona una prueba adicional de

3
8
la hipótesis de Lyon. Si una célula tiene ambos alelos funcionando, deberían estar
presentes tanto la proteína A como la B. Puesto que la enzima G-6-PD funcional es
un dímero (está formada por dos subunidades proteicas), el 50% de las enzimas
deberían ser heterodímeros (AB). Estos formarían una tercera banda intermedia entre
las formas A (dímero AA) y B (dímero BB). La ausencia de heterodímeros en la
sangre de los heterocigotos es una prueba adicional de que no están activos ambos
alelos de la enzima G-6-PD en una misma célula.

La hipótesis de Lyon se ha demostrado con muchos loci ligados al X, pero los

ejemplos más notables son aquellos que se refieren al color del pelaje en algunos 3
mamíferos. Por ejemplo, el patrón calicó de los gatos se debe a la inactivación del
cromosoma X. Los gatos calicó son normalmente hembras heterocigóticas para los
alelos amarillo y negro de un locus ligado al X. Estas hembras muestran áreas de los
dos colores, indicando de esta manera que en un cierto estadio del desarrollo uno de
los dos cromosomas X se inactivó y que todas las células descendientes de esa línea
conservaron inactivo el mismo cromosoma X. Esto da lugar a manchas de color en el
pelaje en lugar del patrón microscópico de color que se esperaría si en cada nueva
célula que se produce se inactivase uno de los cromosomas X al azar.

Compensación de la dosis génica:

El cromosoma X tiene unos 1000 genes que no están presentes en el pequeño

cromosoma Y. Las hembras tienen el doble de copias de estos genes ligados al X y
expresarían el doble de los transcritos de estos genes si no existiera un mecanismo
para corregir este desequilibrio. Sin embargo, no tener un cromosoma Y no es un
problema para las hembras ya que los pocos genes que hay en este cromosoma sólo
son necesarios para el desarrollo de los machos.

Este desajuste se corrige mediante un proceso llamado compensación de

dosis, que hace que, a pesar de esta diferencia, las células femeninas y masculinas
tengan cantidades equivalentes de las proteínas codificadas por genes del cromosoma
X. La compensación de dosis supera diferencias de sexo en la relación esperada de la
dosis de genes autosómicos con la dosis de genes del cromosoma X. Las relaciones

3
9
 de dosis son importantes ya que los productos de los genes ligados a X deben
interactuar con los productos de los genes autosómicos en las diferentes vías
metabólicas y del desarrollo, y las cantidades de producto para genes
sensibles a dosis fundamentales están bajo regulación estrecha.

La región XIC:

El proceso de inactivación del cromosoma X es complejo; en el inicio

de la inactivación y en el mantenimiento de la misma participan mecanismos
moleculares 4 precisos. Dentro de este proceso juega un papel fundamental el
centro de inactivación de X (XIC), ya que es el punto donde comienza.

Además existen dos tipos de inactivación del cromosoma X: al azar o

por imprinting. Aunque ambas formas utilicen los mismos ARNs y enzimas
silenciadoras, se diferencian en tiempo de aparición y mecanismo de acción.

El centro de inactivación de X (XIC) controla el inicio y la

propagación de la inactivación de X. La presencia de XIC es esencial para la
inactivación de X: un cromosoma X que lleva XIC puede experimentar
inactivación, pero no uno que carece del mismo. XIC también es importante
para “contar” cromosomas. En individuos raros con un número anormal de
cromosomas X (45,X; 47,XXX; 47,XXY), todos los cromosomas X excepto
uno sufrirán el proceso de inactivación. Por otra parte, en individuos
triploides podemos encontrar uno o dos cromosomas X activos, mientras que
en el caso de los tetraploides permanecen activos dos. Existe un mecanismo
de conteo que asegura que un cromosoma X permanezca activo por cada dos
grupos de autosomas. La función de XIC depende de XIST (X inactive-
specific transcripts, o transcritos específicos del X inactivo), un gen que
especifica un RNA funcional no codificante. Sin embargo, aunque XIST es
esencial para iniciar la inactivación del cromosoma X, no se requiere de su
presencia para conservar el estado de inactivación.

El gen XIST

4
0
 XIST, transcrito especifico para la inactivación del Cromosoma X, fue
descubierto debido a su expresión específica en Cromosomas X inactivos femeninos.

Este ARN tiene cuatro propiedades únicas:

a.- El gen XIST no codifica una proteína, sino una molécula de ARN
funcional. De ahí, esto es un ARN de no codificación.

b.- XIST es expresado en células que contienen al menos dos Cromosomas X

y normalmente no es expresado en células masculinas. Se observa mayor expresión
cuanto mayor es el numero de cromosomas X.

c.- XIST ARN permanece exclusivamente en el núcleo y es capaz "de cubrir"

el cromosoma a partir del cual fue producido.

d.- Paradójicamente, XIST es expresado a partir de un Cromosoma X que va

a ser inactivado.

El gen XIST fue descubierto después de que el centro de inactivación de X

fue mapeado en el ser humano (llamado Xist en roedores). XIST muestra expresión
monoalélica y se manifiesta únicamente en el cromosoma X inactivo. Su transcrito
primario experimenta empalme y poliadenilación para generar un RNA no
codificante maduro de 17 kb. Al parecer es la principal señal para diseminar el estado
de inactividad transcripcional a lo largo del cromosoma X del que se sintetiza.

4
1
 Aunque en etapas muy tempranas del desarrollo ambos cromosomas
X son activos, la inactivación del X se inicia conforme las células comienzan
a diferenciarse de los linajes totipotente y pluripotente, lo que ocurre en la
etapa tardía de blástula en ratones y con mucha probabilidad también suceda
así en humanos. En cada célula que da lugar al feto femenino se elige para la
inactivación uno de los dos cromosomas X parentales, pero la decisión para
inactivar el cromosoma X de herencia paterna (XP ) o el X materno (Xm)
suele ser aleatoria y por consiguiente varía de célula a célula.

El RNA Xist permanece localizado en el X inactivo, uniéndose y

cubriendo este cromosoma. Esto desencadena el reclutamiento de un
complejo proteico que induce la metilación de los residuos lisina-27 y lisina-9
de la histona H3, generando la condensación de la cromatina y la conversión
de la mayoría del X inactivo en heterocromatina. En algunos estudios
recientes se ha observado que la inactivación del cromosoma X requiere la
formación de moléculas bicatenarias de RNA entre Xist y su hebra
complementaria. Estos RNA bicatenarios de Xist se someten a procesamiento
e intervienen en la inactivación del cromosoma X.

Otro gen extraordinario, TSIX (llamado TsiX en roedores) tiene una

unidad de transcripción que se superpone en la totalidad del gen XIST, pero
en la cadena antisentido. Este gen complementario se expresa en células
madre embrionarias no diferenciadas y en embriones tempranos, y se ha
propuesto que controla la expresión de XIST al inicio de la inactivación de X.

Dos tipos de inactivación

La.- Inactivacion del cromosoma X con imprinting: el cromosoma X

de origen paterno se inactiva de forma preferencial en las células de la
placenta de los mamíferos eutherian y en las células de mamíferos
marsupiales.

XIST y TSIX son ambos importantes para este tipo de inactivacion en

raton (un eutherian), pero los marsupiales no tiene un gene homologo al
4
2
XIST. ¿Cómo puede producirse este tipo de inactivacion sin la presencia del gen
XIST?

Un posible mecanismo implicaría el presilenciamiento del cromosoma X de

origen paterno en la línea germinal masculina mediante la inactivación de los dos
cromosomas X en meiosis; de esta forma el estado inactivo del Cromosoma X podría
transmitirse a la próxima generación.

De un punto de vista evolutivo, tal forma de herencia de XCI heredado

permitir´´ia alcanzar fácil y económicamente la compensación de la dosis en
embriones femeninos, porque sólo las hembras heredan un Cromosoma X de sus
padres.

b.- Inactivacion del cromosoma X al azar

Ocurre tempranamente en el embrión de hembra, en el que los dos

cromosomas X, de origen materno o paterno , tienen la misma posibilidad de ser
inactivados.

Cada célula femenina tiene la tarea difícil de distinguir entre dos

Cromosomas X dentro del mismo núcleo, y designar un Cromosoma X como activo
y el otro como X inactivo. Este proceso complejo es logrado por separado en cada
célula, en gran parte por XIST Y TSIX.

Parece que cada célula cuenta, en primer lugar, su número de Cromosomas X,

entonces al azar escoge un X para permanecer activo, y, finalmente, silencia el futuro
X inactivo.

Mantenimiento de la inactivación

Una vez que una célula progenitora en el embrión temprano se comprometió

a inactivar el cromosoma XP o el Xm, el patrón de inactivación muestra herencia
clonal: todos los descendientes de la célula dentro del linaje celular resultante llevan
el mismo patrón de inactivación de X que la célula progenitora. Esto significa que
todos los mamíferos hembra son mosaicos y comprenden mezclas de líneas celulares
4
3
 en las que se inactiva el X paterno y líneas celulares en las que se inactiva el
X heredado de la madre.

Un heterocigoto femenino para una enfermedad ligada a X

(dominante o recesiva) es un mosaico. Cada célula expresa el alelo normal o
el anormal, pero no ambos. Cuando el fenotipo depende de un producto
circulante, como la hemofilia, hay un efecto promedio entre las células
normales y anormales. Las mujeres portadoras tienen un fenotipo intermedio
y no suelen manifestar sintomatología clínica, pero son anormales desde el
punto de vista bioquímico. Cuando el fenotipo es una propiedad localizada en
células individuales, como es el caso de la displasia ectodérmica
hipohidrótica (carencia de glándulas sudoríparas y presencia de dientes y pelo
anormales), las mujeres portadoras muestran placas de tejido normal y
anormal. En ocasiones se observan heterocigotos que manifiestan
enfermedades recesivas ligadas al X. Estas mujeres pueden estar afectadas de
un modo muy grave debido a que, por desgracia, casi todas las células de
algunos tejidos críticos hayan inactivado el X normal.

El origen de muchos tumores a partir de una sola célula se ha

demostrado mediante el análisis de la inactivación del cromosoma X. Un
miembro del par de cromosomas X se inactiva en las células femeninas y
pasa al estado de heterocromatina. La inactivación del cromosoma X ocurre
al azar durante el desarrollo embrionario, por lo que uno de los cromosomas
X es inactivado en algunas células mientras que en otras se inactiva el otro
cromosoma X. Por tanto, si una hembra es heterocigota para un gen del
cromosoma X, se expresarán alelos distintos en células distintas. Los tejidos
sanos se componen de una mezcla de células con cromosomas X inactivos
diferentes, por lo que en los tejidos normales de las hembras heterocigotas se
detecta la expresión de ambos alelos. Por el contrario, en los tejidos
tumorales se suele expresar sólo un alelo de un gen heterocigoto portado por
el cromosoma X. Esto implica que todas las células que constituyen ese
tumor derivan de una única célula original, en la que se fijó el patrón de
inactivación del cromosoma X antes de que el tumor se desarrollara. Los
4
4
diferentes tumores pueden estar formados por células con el X paterno o con el
materno inactivo.

Sin embargo, también se sabe que varios loci están activos en el cromosoma
X inactivado. Aunque algunos de estos loci están en la región pseudoautosómica del
brazo corto del cromosoma X, el resto de los seis o más genes que se sabe que están
activos se encuentran en otros lugares del cromosoma X de los mamíferos,
incluyendo al menos dos en el brazo largo (la región pseudoautosómica está en el
brazo corto). En este grupo de genes no parece ser importante la diferencia de dosis
génica entre ambos sexos, hecho por el cual no es necesario el mecanismo de
compensación.

Por otra parte, cabe destacar que la inactivación del X se invierte únicamente
en la línea germinal, donde el segundo cromosoma X se reactiva en la ovogénesis.
Así los dos cromosomas X pueden ser heredados por la siguiente generación.

Corpúsculo de Barr

Los Corpúsculos o cuerpos de Barr, también llamados cromatina sexual X,

son una masa heterocromática, plana y convexa, con un tamaño de 0,7x1,2 micras,
que se encuentran en el núcleo de las células somáticas de las hembras de algunos
animales. Se forman por la condensación de la cromatina sexual de uno de
los cromosomas X, que se inactiva debido al proceso llamado lionización en
animales donde el sexo se determina con la presencia o ausencia del cromosoma Y.

Fueron descubiertos por el canadiense Murray Barr y Ewart George Bertram

en 1949, quienes demostraron que es posible determinar genéticamente el sexo de un
individuo dependiendo de que exista o no esta masa de cromatina en la superficie
interna de la membrana nuclear (cromatina sexual).1

El estudio de la cromatina sexual, en especial de células de la mucosa oral,

nos permite identificar la presencia del cromosoma X en recién nacidos con genitales
externos no definidos para obtener el diagnóstico de sexo en un individuo
con Desórdenes del desarrollo sexual.
4
5
 Mecanismo de formación

De acuerdo con la hipótesis de Lyon (propuesta por Mary Lyon en

1966), uno de los dos cromosomas X en cada célula somática femenina es
genéticamente inactivo. El corpúsculo de Barr representa el cromosoma X
inactivo. Determinó 4 principios para la cromatina sexual:

1. la cromatina sexual es genéticamente inactiva,

2. la inactivación ocurre al azar,
3. la inactivación puede ser en el cromosoma paterno o materno.
4. la inactivación ocurre en el día 16 del periodo embrionario.

El número de masas de Barr se determina por la fórmula B = X –

(P/2), donde P simboliza la ploidía de la célula. Así pues, el número de
cuerpos de Barr que se observan en una célula somática normal femenina
humana será B = X – (1). Una célula humana femenina normal tiene un único
Cuerpo de Barr por célula.

La inactivación del cromosoma X de los mamíferos se inicia desde

una zona cerca al centrómero.2 Esta zona contiene doce genes, de los cuales
siete codifican para proteínas, cinco para RNAs que no serán traducidos (sólo
se conocen el papel de dos de ellos en la inactivación del cromosoma). Esta
zona parece ser también indispensable en la toma de decisión, es decir,
asegura que la inactivación del cromosoma sólo ocurre cuando existen dos o
más cromosomas X en la célula. Se piensa que el mecanismo de elección se
basa en la acción antagonista de los dos ARNs que no serán traducidos que se
encuentran codificados en la zona cercana al centrómero.

Para lograr la condensación del cromosoma se requieren modificación

de histonas (H3 metilaciones),3 ubiquitinaciones de histonas H2A, así como
modificaciones directas del ADN, mediadas por las metilaciones de las zonas
CpG.4 Todas estas modificaciones ayudan a la inactivación de la expresión de
los genes del cromosoma X, de forma que se consigue su condensación y
compactación hasta lograr el Cuerpo de Barr.
4
6
 Estructura de los cromosomas X en la cromatina

Estudios Dip-C, basados en los estudios de la conformación de los

cromosomas afirman que el cromosoma X inactivo tiende a exhibir con
conformación compacta, mientras que el cromosoma X activo suele presentarse de
forma expandida.

En relación a la compartimentación de los cromosomas en la estructura de la

cromatia, el cromosoma X activo se presenta tanto en regiones
de eucromatina como heterocromatina (como ocurre de forma natural en el
cromosoma X de los machos) mientras que la compartimentación del cromosoma X
inactivo es más homogénea5. Además, estos estudios muetran la formación de
múltiples superloops en el cromosoma X inactive.

1.7. La cromatina durante el ciclo celular

En las células somáticas que tienen núcleo, la molécula de ADN está presente
en una forma peculiar llamada originalmente cromatina. Por la estructura de la doble
hélice del ADN, sabemos que la distancia entre nucleótidos es de 0,34 nm; si el
genoma humano haploide tiene 3x109 pares de bases, la longitud total del genoma en
forma de doble hélice lineal sería algo superior a 1 metro, y además cada núcleo
contiene dos copias del genoma. Todo este material debe entrar en el núcleo de una
célula eucariota, cuyo diámetro medio es de 5 m. Esto significa que el ADN ha de
adoptar un alto grado de empaquetamiento para poder alojarse dentro del núcleo.
Este empaquetamiento se lleva a cabo mediante la unión de la doble hélice con
varios tipos de proteínas para dar lugar a una estructura que es, precisamente, la
cromatina.
Las células eucariotas, al proliferar, siguen una serie de etapas en las que se
llevan a cabo los procesos necesarios para dar lugar a dos células hijas: duplicar los
componentes celulares, segregarlos espacialmente y dividir la célula de modo que las
dos células resultantes lleven todos los ingredientes necesarios para su correcto
funcionamiento. Estas etapas deben completarse en orden, de un modo altamente

4
7
 regulado, y constituyen lo que se llama ciclo celular. En cada ciclo celular se
distinguen por tanto varias fases: la interfase (etapa en la que la célula duplica
su contenido), la mitosis (etapa en la que los componentes se separan a polos
opuestos de la célula) y citoquinesis (separación física de las dos células
hijas). Probablemente sea la cromatina el componente celular en el que es
más importante la duplicación y segregación correctas, ya que esto va a
asegurar que la información genética se transmita sin alteraciones. Por tanto,
es importante saber cómo se comporta la cromatina en las distintas etapas del
ciclo celular.

Durante la interfase, que es la etapa más larga del ciclo, la cromatina

está sujeta a un grado de empaquetamiento de unas 2000 veces, es decir, lo
que en su estado natural ocuparía un tamaño de 2000 m se reduce a un
tamaño de 1 m. Esto se consigue por la unión de la doble hebra de ADN con
unas proteínas básicas llamadas histonas, cuyos grupos positivos
interaccionan con los grupos negativos del esqueleto fosfato del ADN. Hay 5
tipos principales de histonas, llamadas H1, H2A, H2B, H3 y H4, que se
asocian entre sí para formar un octámero: dos moléculas de H3 junto con dos
moléculas de H4 forman un tetrámero, y dos dímeros H2A/H2B forman otro
tetrámero; ambos tetrámeros se asocian para formar un núcleo proteico
4
8
(octámero) alrededor del cual se enrolla la molécula de ADN. En concreto, 146 pares
de bases de ADN dan 1,65 vueltas alrededor del octámero, y sobre este complejo se
une la histona H1. Esta estructura, de unos 10 nm de diámetro, es lo que se conoce
con el nombre de nucleosoma, y es la unidad básica de organización de la cromatina.
Los nucleosomas están unidos entre sí por el filamento de ADN que se va
enrrollando a su alrededor, como bolas en una cuerda, y esto da lugar a la fibra de
cromatina de 10 nm. En esta estructura, unos 200 pares de bases ocupan 10 nm, lo
que significa un grado de empaquetamiento de unas 6 veces respecto al tamaño lineal
que ocuparía un fragmento de ADN de esa longitud (200 X 0,34 nm = 64 nm).
En condiciones fisiológicas, la fibra de 10 nm sufre un segundo grado de
enrollamiento sobre sí misma para dar lugar a una estructura en forma de solenoide,
con 6 nucleosomas por vuelta. Esta configuración constituye la fibra de 30 nm, en la
que el grado de empaquetamiento del ADN es de unas 40 veces. La fibra de 30 nm
sufre diferentes grados de empaquetamiento durante interfase y, especialmente, en la
mitosis, en la que la cromatina alcanza su empaquetamiento máximo (unas 10.000
veces) y da lugar a las estructuras visibles que llamamos cromosomas.
Estos tipos de alto grado de enrollamiento se consiguen porque la fibra de 30
nm forma asas que se unen por su base a una estructura proteica que sirve como
andamio. El andamio ("scaffold" en inglés) está constituido por proteínas no
histonas, de las que las principales son la Sc1 (idéntica a la topoisomerasa II) y la
Sc2 ó SMC2, que pertenece a una familia de proteínas llamada SMC (Structural
Maintenance of Chromosomes, en inglés). Estas proteínas cumplen también un papel
importante en el mantenimiento de la condensación de la cromatina (de ahí que
también se les llame condensinas). Las asas de la fibra de 30 nm se unen al andamio
mediante unas secuencias ricas en Adeninas y Timinas llamadas SAR (Scaffold
Attachment Region en inglés), que tienen gran afinidad por las proteínas del
andamio.
La estructura que resulta de este enrollamiento da lugar a una fibra de unos
300 nm de grosor, en la que el grado total de empaquetamiento del ADN es de unas
2.000 veces. Las SAR son regiones importantes, dispersas por el genoma, que
flanquean genes y a menudo se asocian con los orígenes de replicación que veremos
más adelante, por lo que se piensa que pueden jugar un papel importante en la
4
9
 función y estructura de la cromatina. Finalmente, el empaquetamiento
máximo de la cromatina durante la mitosis se consigue al espiralizarse la
fibra de 300 nm para dar lugar a una estructura de 600 nm de grosor (una
cromátide) en la que el ADN alcanza ya un grado de empaquetamiento de
10.000 veces.

1.8. La secuencia influye en el estado funcional de la cromatina

Como ya se ha dicho, el grado de empaquetamiento no es uniforme a

lo largo de todo el genoma. De hecho, en el núcleo en interfase siempre se
distinguió una cromatina denominada eucromatina, poco condensada, y otra
llamada heterocromatina, con un mayor grado de condensación. Hoy
sabemos que estas categorías morfológicas tienen un correlato funcional, ya
que la eucromatina es transcripcionalmente más activa mientras que los genes
incluidos en heterocromatina tienen un bajo nivel de expresión. La
heterocromatina, a su vez, puede ser de dos tipos: constitutiva, que nunca se
transcribe y se localiza en los centrómeros y en la constricción secundaria de
algunos cromosomas; ó facultativa, que en el fondo es un tipo de
eucromatina que se heterocromatiniza en situaciones concretas, como es el
caso del cromosoma X inactivo en las mujeres. Además de estas dos grandes
categorías de cromatina, es importante comprender que dentro de las regiones
eucromáticas la cromatina tampoco es totalmente homogénea, como queda
reflejado, por ejemplo, en su distinta repuesta a varias tinciones. Este
comportamiento es precisamente la base del patrón de bandas característico
de cada cromosoma y que permite la creación del cariotipo convencional.
Como veremos en un capítulo posterior, la tinción con un colorante llamado
Giemsa produce unas bandas oscuras (bandas G) separadas por bandas claras
(bandas R). La tinción con otra sustancia llamada Quinacrina (que se une
específicamente a regiones ricas en adeninas y timinas) produce un patrón de
bandas similar a las bandas G, mientras que la tinción con Cromomicina-A
(que se une preferentemente a regiones ricas en guaninas y citosinas) genera
un patrón similar a las bandas R. Por tanto, las
peculiaridades morfológicas de la cromatina son debidas, al menos en

5
0
parte, a diferencias en la secuencia de nucleótidos del genoma; el modelo del
andamio (scaffold) que vimos en el punto anterior permite explicar esta relación, ya
que las bandas G representan regiones con un mayor grado de empaquetamiento del
ADN, lo que implica una mayor densidad de las regiones de unión al andamio
(llamadas SAR). Como las SAR son relativamente ricas en adenina y timina, esto
explica que estas regiones genómicas se tiñan más intensamente por Quinacrina y
Giemsa, mientras las bandas R, más ricas en guanina y citosina, tienen un menor
grado de empaquetamiento, menor densidad de SAR y se tiñen débilmente por estos
colorantes. Por tanto, las distintas bandas del cariotipo reflejan no sólo diferencias en
la condensación de la cromatina, sino también diferencias en su composición: ya
hemos visto que el genoma humano tiene un contenido medio en G+C del 41%, pero
que esto no se distribuye de manera uniforme por todo el genoma.
A su vez, las diferencias en condensación y en composición de las distintas
regiones de cromatina se correlacionan con otra variable importante: la riqueza en
genes y su actividad transcripcional. Por ejemplo, se estima que un 80% de los
genes se localizan en bandas R (las más ricas en nucleótidos G+C), que son las
menos condensadas. También se ha observado que, en general, las bandas R son de
replicación temprana, mientras que las bandas G son de replicación más tardía. La
replicación del ADN en eucariotas comienza en muchos orígenes de replicación
durante la fase S del ciclo celular, pero no todos los orígenes de replicación
comienzan a funcionar a la vez: hay unos orígenes que siempre comienzan al
principio de la fase S (replicación temprana) y otros que van comenzando a
funcionar más tarde (replicación tardía). Asimismo, se sabe que los genes
constitutivos (housekeeping en inglés), que son los que se expresan en todos los
tejidos, se replican temprano; por el contrario, los genes que están en regiones
heterocromáticas (el cromosoma X inactivo, por ejemplo) son de replicación más
tardía. Parece —por tanto— que regiones con alta densidad de genes, ricas en C+G y
descondensadas se replican antes que regiones silenciadas ó con baja densidad de
genes.
Otro aspecto que diferencia los distintos tipos de bandas es la acetilación de
las histonas. Como se verá a continuación, se ha podido comprobar que la
acetilación de las histonas que forman los nucleosomas lleva a la formación de una
5
1
 cromatina más abierta, que permite mejor el acceso de factores de
transcripción y la expresión de los genes contenidos en esas regiones. Esto se
debe a que las colas amino-terminales de las histonas interaccionan con más
fuerza entre sí y con el ADN cuando los grupos épsilon-amino de las lisinas
están en su forma des-acetilada; la acetilación relaja esas interacciones y
descondensa parcialmente la fibra de 30 nm y la unión del ADN con los
nucleososmas. Curiosamente, se ha comprobado que las histonas de las
bandas G están menos acetiladas que las histonas de las bandas R. Esto
ayudaría también a explicar la menor condensación de la cromatina en las
bandas R, y nos proporciona un mecanismo para entender por qué las
bandas R se replican antes y son más activas transcripcionalmente: por
un lado, no necesitan descondensarse para que se lleve a cabo la replicación,
y por otro constituyen unos dominios en los que el ADN es más accesible a
los factores de transcripción.
En resumen, es importante darse cuenta de que los mecanismos
básicos de regulación de la expresión génica están sometidos a un nivel
superior de regulación, dependiente de la situación de un gen dentro del
genoma y del estado funcional de la cromatina en que se encuentra, que a su
vez está influido por el tipo de secuencias que la componen.

1.9. Modificaciones epigenéticas y su importancia en la regulación

del estado funcional de la cromatina

Es muy importante comprender que los aspectos estructurales y

funcionales se integran en un modelo "dinámico", según el cual una región de
cromatina estará en un estado más o menos favorable a la expresión génica
dependiendo del tipo de secuencias que la forman y también de las
modificaciones epigenéticas a ese nivel. Por modificaciones epigenéticas se
entienden todos aquellos cambios que sufre la cromatina pero que no afectan
a la secuencia de nucleótidos: por eso no son modificaciones "genéticas", sino
que están "por encima" (que es lo que significa epi en griego). En los últimos
años se ha comprobado experimentalmente la gran importancia que tienen los
mecanismos que regulan la actividad de la cromatina mediante cambios
5
2
epigenéticos. Para entender esto, es importante recordar que la actividad
transcripcional basal en eucariotas es esencialmente restrictiva, en el sentido de que
los promotores están en estado inactivo hasta que se ponen en marcha por la acción
de los elementos llamados ―activadores y el ensamblaje del complejo basal de
transcripción. Para que estos factores proteicos se unan a sus dianas en el ADN es
necesario que la cromatina de esa región esté relativamente descondensada, para
exponer más fácilmente la doble hélice y permitir el acceso de factores proteicos. De
hecho, los genes que son transcripcionalmente activos se asocian habitualmente con
sitios hipersensibles a DNAsa I, regiones cortas (unos pocos cientos de pares de
bases) formadas por ADN que no está asociado a nucleosomas, precisamente porque
se encuentra unido a factores de transcripción.
Los nucleosomas son, por tanto, un elemento fundamental para mantener este
estado basal restrictivo, al impedir el acceso de la maquinaria transcripcional a los
promotores. La represión transcripcional mediada por nucleosomas se debe tanto a
las interacciones directas del octámero de histonas con el ADN, como a las
interacciones que se originan entre nucleosomas vecinos para dar lugar a la fibra de
cromatina. Como hemos visto más arriba, las colas N-terminales de las histonas de
los nucleosomas quedan libres hacia fuera, y son las regiones más susceptibles de ser
modificadas químicamente para variar su carga y alterar las interacciones, tanto entre
histonas y ADN como entre nucleosomas vecinos. Por tanto, si conseguimos relajar
alguna de estas interacciones conseguiremos favorecer la transcripción de los genes
que están incluidos en esas regiones. Esta relajación se puede conseguir gracias a que
las colas N-terminales de las histonas tienen una serie de aminoácidos (lisinas y
serinas, principalmente) que pueden sufrir modificaciones covalentes del tipo
acetilación, metilación ó fosforilación, y que van a ser cruciales en la regulación de
estos fenómenos. A su vez, estos cambios se coordinan con
otras modificaciones epigenéticas que sufre la propia cadena de ADN en
forma de metilación de algunos nucleótidos concretos, y en su conjunto ambos
procesos constituyen un importante mecanismo de regulación de la actividad
transcripcional. A continuación veremos por separado las modificaciones
epigenéticas que sufre la cromatina, por una parte, y el ADN por otra.
A. Modificación de la cromatina. Para superar la represión basal debida a la
5
3
 presencia de nucleosomas y facilitar la expresión de un gen, los activadores
de la transcripción pueden potenciar la actividad transcripcional alterando, en
primer lugar, la propia estructura de la cromatina: aunque el activador no se
una directamente al promotor de un gen, puede reclutar distintas actividades
modificadoras de la cromatina cuya acción sea conferir a esa región un
estado que facilite la transcripción. Estas actividades pueden ser de varios
tipos:
remodelamiento
nucleosomal: son capaces de mover los nucleosomas de su posición para
dejar expuesta una región promotora y permitir la expresión génica. Este tipo
de actividad está mediada por complejos multiproteicos con actividad
ATPasa, de los cuales el primero en ser aislado fue el complejo SWI/SNF
(primero se identificó en levaduras, después en humanos). Este complejo
desestabiliza el nucleosoma al romper los contactos del ADN con el
octámero, que queda libre para moverse y asociarse con una región vecina de
la molécula de ADN. Todos los remodeladotes de nucleosomas pertenecen a
la familia SNF2 de ATPasas, y pueden dividirse en 7 subgrupos dependiendo
de los dominios proteicos que contienen.
acetilación de histonas: el factor Gcn5
de levadura fue el primer activador transcripcional con actividad acetilasa de
histonas descubierto, en 1996. Posteriormente se vio que otros co-activadores
de la transcripción de mamíferos también poseían actividad acetil-transferasa,
factores tales como p300, CBP (CREB-BP) y P/CAF, de ahí que hoy en
conozcan en conjunto con el nombre de HAT (Histone AcetylTransferase).
Éstos actúan como factores de transcripción integradores de diversas vías de
transducción de señales implicadas en el control del ciclo celular y de los
procesos de diferenciación, reparación y apoptosis. Otros activadores
transcripcionales con actividad HAT son el factor de transcripción TAFII250
(que forma parte del complejo TFIID), SRC-1 y ACTR (coactivadores de
receptores nucleares). Al igual que la acetilación de las histonas conduce a la
activación transcripcional, la des-acetilación de las histonas crea una
estructura cromatínica más condensada que favorece el silenciamiento de la
5
4
transcripción de los genes incluidos en la esa región genómica. En este sentido, se ha
comprobado que los factores HDAC1 y HDAC2 (Histone De-Acetylase), cuya
función es des-acetilar las histonas, están presentes en el complejo Sin3-NcoR, un
co-represor transcripcional que regula la expresión de genes importantes en el ciclo
celular y en el desarrollo embrionario. En conjunto, acetilasas y des-acetilasas actúan
sobre los mismos aminoácidos de las colas amino-terminales de las histonas H3 y
H4, especialmente las lisinas 9, 14, 18 y 23 de la histona H3 y las lisinas 5, 8, 12 y
16 de la histona H4. En la figura 2.4 ya se ha visto el posible mecanismo por el que
la des-acetilación de las histonas favorece la compactación de nucleosomas vecinos e
impide la transcripción en esa región. De hecho, se ha comprobado que la des-
acetilación de la lisina 16 en la histona H4 provoca la condensación de la fibra de
10 nm, mientras que la acetilación de este residuo impide la formación de la fibra de
30 nm y permite la interacción con co-activadores de la transcripción.
fosforilación de la histona
H3 en la serina 10 y la metilación de las lisinas 4, 9, 27, 36 y 79 en la histona H3
y de la lisina 20 de la histona H4, metilación catalizada por unos complejos
proteicos que tienen actividad metil-transferasa. Se ha comprobado que estas
modificaciones actúan en coordinación con la acetilación, estableciendo lo que ahora
se conoce como el "Código de Histonas". Según este código, una región se
comportará como eucromatina ó como heterocromatina dependiendo de las
modificaciones epigenéticas de las histonas que conforman los nucleosomas de la
región; las regiones limítrofes, en las que se da una transición de un tipo de
cromatina al otro, muestran características propias de ambos tipos de cromatina, y
son capaces de unir complejos proteicos llamados aisladores (en inglés "insulator"),
que forman una especie de barrera física e impiden que un tipo de cromatina se
extienda más allá del límite de la región e invada la región vecina. De modo general,
el código de histonas establece que una región de eucromatina se caracteriza por
tener la lisina 4 de la histona H3 metilada (con uno, dos o tres grupos metilo), y las
lisinas 9 y 14 de la misma histona acetiladas. Se ha comprobado que esta
configuración tiene la propiedad de unirse a un dominio proteico llamado
"bromodominio", que está presente en muchos activadores de la transcripción. Una
región con estas características puede heterocromatinizarse si sufre una cascada de
5
5
 alteraciones: la pérdida de la metilación de la lisina 4, la desacetilación
progresiva de las lisinas 9 y 14, y finalmente la metilación de la lisina 9
constituyen una marca de heterocromatina, a la que se unen proteínas que
contienen un dominio de silenciamiento llamado "cromodominio" que
recluta factores de silenciamiento como la proteína HP1 (proteína de
heterocromatina-1). Estas interacciones están influidas también por la
fosforilación de la serina 10 de la histona H3; por ejemplo, dicha
fosforilación –generada por la quinasa Aurora B— inhibe la unión de HP1
con la lisina 9 metilada durante la mitosis.
Estudios recientes han aportado nuevos datos sobre las
modificaciones que sufren las histonas. En lo que se refiere a las
metilaciones, diversos estudios de inmunoprecipitación de cromatina han
podido determinar la posición de dichas modificaciones a lo largo de todo el
genoma. Esto ha permitido comparar el estado de la cromatina que rodea al
promotor frente al de otras regiones génicas. Además, combinando estos
datos con los niveles de expresión de cada gen, se ha podido definir mejor el
código de metilaciones de histonas que caracteriza los promotores de genes
activos y de genes silenciados. Esta información se resume en la siguiente
figura, que muestra un gen activo típico (la flecha hacia la derecha indica
transcripción activa a partir de ese punto). Las líneas de colores indican la
intensidad de unión de anticuerpos frente a ARN polimerasa II (verde), tri-
metilación de la lisina 4 de la histona H3 (azul), acetilación de las lisinas 9 y
14 de la histona H3 (marrón) y tri-metilación de la lisina 36 de la histona H3
(naranja). Puede verse que ésta última se encuentra sobre todo en los
nucleosomas que
incluyen el cuerpo y el final del gen, mientras que las otras
modificaciones son más intensas en los nucleosomas correspondientes al sitio
de inicio de la transcripción.

Los genes no activos, en cambio, están caracterizados por la ausencia

5
6
de estas modificaciones y la presencia de metilación de la lisina 9 de la histona H3
(H3K9me1) y la tri-metilación de la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) en la
zona del inicio de la transcripción, y la tri-metilación de la lisina 79 de la histona H3
(H3K79me3) a lo largo de todo el cuerpo del gen.
B. La metilación del ADN juega un papel fundamental en el mantenimiento
del silenciamiento transcripcional. El ADN de vertebrados se metila en el carbono 5
de las citosinas que están en el dinucleótido CpG (la "p" indica el grupo fosfato que
Curiosamente, la abundancia
de este dinucleótido en el genoma de vertebrados es sólo un 25% de lo esperado, es
decir, el porcentaje normalizado de este dinucleótido es de 0,25. En efecto, si el
contenido en C+G del genoma es del 41%, la probabilidad esperada de encontrar un
dinucleótido CpG es (0,205 x 0,205) = 0,042 (o sea, 4,2%); en cambio, la frecuencia
observada de este dinucleótido está en torno al 1% en el genoma humano, de ahí que
el porcentaje normalizado sea 1/4 = 0,25. Además, los dinucleótidos CpG no están
distribuidos homogéneamente a lo largo del genoma, sino que son más abundantes
en los genes, tanto en los exones como, sobre todo, alrededor del inicio de la
transcripción. Pues bien, los dinucleótidos CpG que tienen metilada la citosina
son los que están distribuidos a lo largo de la secuencia de genes. Por el
contrario, los dinucleótidos CpG que no están metilados que tienden a
concentrarse en regiones que se denominan islas CpG. Aunque estas islas se han
definido tradicionalmente como las regiones de un tamaño igual o superior a 500 pb,
con un contenido total de G+C superior a 50% y con un cociente de dinucleótidos
CpG observados frente a esperados superior a 0,6, hoy en día se pueden definir por
su porcentaje normalizado de CpG. De hecho, el análisis de todos los promotores del
genoma humano identifica dos tipos de genes: los que tienen un promotor con un
porcentaje normalizado de CpG en torno al 0,61 y los que tienen un promotor con un
porcentaje normalizado de CpG en torno al 0,23. Los primeros constituyen un 70%
de todos los promotores, y corresponden a los genes constitutivos ó ―domésticos‖
("housekeeping" en inglés). Por el contrario, los promotores con bajo porcentaje
normalizado de CpG constituyen un 30% del total de los promotores, y corresponden
a los genes que se expresan en tejidos específicos. Los promotores que contienen una
isla CpG están habitualmente hipometilados en la línea germinal, lo cual les protege
5
7
 La metilación del ADN está catalizada por unas metil-transferasas específicas de las
citosinas que forman parte de dinucleótidos CpG, y se conocen básicamente dos tipos
de estas metil-transferasas de ADN. Las DNMT3A y DNMT3B son responsables
de la metilación de novo, es decir, la metilación de dinucleótidos CpG que no
estaban previamente metilados. En cambio, la DNMT1 (ADN-metil-transferasa-1) es
responsable de mantener la metilación durante la replicación. En efecto, dado que en
la doble cadena de ADN un dinucleótido CpG tiene realmente dos citosinas
metilables (ya que existe un CpG en cada una de las cadenas de la doble hélice), un
sitio totalmente metilado tendrá realmente dos citosinas metiladas. Tras la
replicación del ADN, ambas dobles hélices conservarán una cadena con el CpG
metilado (la proveniente de la molécula original), mientras que la cadena de nueva
síntesis estará sin metilar. Esto genera dinucleótidos CpG hemi-metilados, es decir,
metilados en una de las citosinas pero no en la otra; la DNMT1 tiene la función de
re-metilar precisamente estos dinucleótidos para restablecer el estado inicial de
metilación completa que tenía la molécula original.
Numerosos estudios han mostrado el significado biológico de la metilación del ADN:
1) es un importante mecanismo epigenético de silenciamiento génico a nivel
transcripcional, y permite mantener el silenciamiento de ciertos genes durante los
procesos de diferenciación celular; 2) la metilación es un mecanismo de defensa
frente a elementos móviles del genoma, cuyos promotores están habitualmente
silenciados por metilación; y 3) la metilación es un mecanismo estabilizador de la
cromatina, especialmente de la heterocromatina pericentromérica, ya que la des-
metilación de este tipo de cromatina conduce a la aparición de reordenamientos
cromosómicos severos.
Los mecanismos moleculares por los que la metilación conduce al silenciamiento
transcripcional pueden ser múltiples:

algunos factores de transcripción generales como Sp1, CREB, E2F ó NF-kB se unen
a dominios que contienen CpG, y esta unión disminuye cuando estos dominios
están metilados. Sin embargo, éste mecanismo no se puede aplicar de modo general a
todos los genes.
5
8
metilado. Existen varias proteínas de unión a los dinucleótidos CpG metilados,
denominadas genéricamente MeCP ("Methyl-Cytosine binding Protein") ó MDB
("Methyl Binding Domain"), que forman parte de complejos con actividad represora
de la transcripción. Por ejemplo, MeCP-2 es una proteína que contiene un dominio
de unión a dinucleótidos CpG metilados, así como otro dominio por el que se une a
un represor transcripcional llamado Sin3. Curiosamente, Sin3 reprime la
transcripción a través de su unión con HDAC2 (que, como ya hemos visto, des-
acetila las lisinas de la histona H3). De esta manera, la represión transcripcional
debida a la metilación de los dinucleótidos CpG se produce gracias a la asociación
entre metilación del ADN y acetilación de la cromatina, ya que el dominio de
represión transcripcional de MeCP-2 es capaz de reclutar el complejo Sin3-NCoR-
HDAC2 y así iniciar un foco de cromatina hipoacetilada en una región específica del
genoma. Esto explica que las regiones en las que el ADN está metilado sean capaces
de silenciar genes cercanos (aunque éstos no tengan sus dinucleótidos CpG
metilados), al englobarlos en una región genómica silenciada por des-acetilación.
De todas formas, uno de los hallazgos novedosos del proyecto ENCODE
(mencionado en el capítulo 1) ha sido que la relación entre metilación y unión de
factores de transcripción es, a menudo, contraria a lo que se intuía. La visión clásica
es que lo primero es la metilación del ADN, y esto impide (o permite) la unión de
factores de transcripción y así regula la expresión de un gen. Ahora, en cambio,
sabemos que en muchos casos es al revés: la unión de factores de transcripción
impide la metilación de esa región de ADN. Dado que se trata de procesos
reversibles, en un equilibrio dinámico, esto permite una regulación muy fina de la
expresión génica.
Como ya se ha mencionado, una propiedad muy importante del
silenciamiento por metilación es que es reversible: se ha comprobado que los
promotores que han sido silenciados por metilación pueden reactivarse si se des-
metila esa región. Un mecanismo posible para explicar esta reactivación es la pérdida
de la metilación durante la replicación: esto sucedería si ciertos factores de
transcripción ó activadores nucleares consiguieran unirse a sus promotores
5
9
 inmediatamente después de la replicación y antes de que actúe la DNMT1 de
mantenimiento en los sitios hemi-metilados. Una vez que se estabiliza el
complejo basal de transcripción sobre esa región, éste atraería algunos
componentes con actividad HAT, que a su vez actuarían manteniendo la
cromatina abierta y permitiendo la transcripción. Esto, además, impediría la
acción de la DNMT1 y terminaría por eliminar la metilación en esa región
tras varios ciclos de replicación. Este mecanismo se conoce como des-
metilación pasiva. Otro mecanismo alternativo para explicar la re-expresión
de genes silenciados por metilación, sobre todo en células diferenciadas que
ya no se replican, es la desmetilación activa, aunque todavía no se ha aislado
de modo concluyente ninguna des-metilasa de ADN. Estudios recientes han
demostrado que una proteína llamada TET1 tiene actividad 5-metilcitosina
(5mC)-hidroxilasa, convirtiendo las 5mC en 5-hidroxi-mC en células de
mamíferos. Estas 5-hidroxi-mC son después desaminadas a 5-hidroxi-mU por
unas desaminasas llamadas AID o APOBEC, y los 5-hidroxi-mU son
convertidos en citosinas por el sistema de reparación BER (que se estudiará
en detalle en el Tema 3) a través de una ADN-glicosilasa llamada TDG.
En el año 2009 se descubrió que algunas células humanas llevan un nuevo tipo de
metilación del ADN (previamente descrito sólo en plantas), que no afecta a las
citosinas de dinucleótidos CpG sino a las citosinas de los trinucleótidos CHG ó
CHH (siendo ―H‖ cualquier nucleótido excepto G). En humanos, esta modalidad de
metilación sólo se da en células pluripotenciales, llegando a constituir un 25% de
todas las citosinas metiladas en células madre embrionarias. Al contrario que la
metilación de CpGs, esta metilación ―no-CpG‖ es más intensa en el cuerpo de los
genes y su relación con la expresión génica no es directa. Se piensa que este nuevo
tipo de metilación juega un papel importante en el mantenimiento del estado
pluripotencial, ya que desaparece durante la diferenciación celular.
En resumen, la metilación del ADN constituye un importantísimo
mecanismo epigenético de regulación de la expresión génica, debido a su
interacción con los mecanismos que modifican la estructura de la cromatina.
El mantenimiento de los patrones de metilación explica también que las
modificaciones epigenéticas sean heredadas establemente tras la replicación
6
0
del ADN. Además, como ya se ha mencionado, la metilación tiene importantes
implicaciones biológicas, y por tanto la alteración de los procesos normales de
metilación de la cromatina puede perturbar procesos fisiológicos importantes. En
primer lugar, por ser un mecanismo fundamental en el silenciamiento de retrovirus
endógenos, transposones y ADN satélite, las alteraciones en la metilación de estos
elementos puede provocar numerosas anomalías genéticas. Además, la metilación
es la base molecular de los fenómenos de impronta genómica (imprinting) que se
estudiarán más adelante, y es un mecanismo fundamental en la regulación de la
expresión génica durante el desarrollo embrionario. De hecho, el embrión sufre una
onda de des-metilación genómica global en la fase de mórula de 8 células, seguida
por la re-metilación gradual que vuelve a fijar los patrones de metilación en la fase
de blastocisto. También la inactivación del cromosoma X en mujeres es un proceso
básicamente controlado por procesos de metilación, acetilación y silenciamiento.
Por tanto, cada vez está más claro que la des-regulación de las modificaciones
epigenéticas de la cromatina está en la base de algunas enfermedades humanas. El
caso más claro es el de una enfermedad neurológica hereditaria llamada Síndrome
de Rett, en el que se han identificado mutaciones en el gen que codifica la proteína
de unión a metil-citosinas MECP2 dando lugar a un exceso de ―ruido
transcripcional‖ por falta de silenciamiento global de muchos genes, con efectos más
marcados en el cerebro que en otros órganos. Además, se ha visto que las células de
estos pacientes tienen desmetilación de los elementos LINE1 (que, por tanto,
muestran mayor actividad de retrotransposición en algunos tejidos). Por otra parte, el
papel de la metilación en cáncer también está cobrando cada vez más importancia,
ya que se ha visto que muchos tipos de tumores tienen alteraciones importantes en
los procesos de metilación de la cromatina:
La desaminación de citosinas metiladas (debida habitualmente a la acción
de una citidín-desaminasa, ó bien por desaminación hidrolítica espontánea) provoca
un cambio de Citosina por Timina, haciendo que los dinucleótidos CpG metilados
sean puntos calientes (hotspots) para la generación de mutaciones de este tipo. De
hecho, se ha estimado que el 30% de las mutaciones encontradas en tumores en el
gen TP53 (que codifica la proteína p53, un supresor tumoral importante) son

6
1
 Se ha comprobado que durante el proceso de iniciación tumoral hay
una hipometilación global del genoma de la célula pre-maligna, lo que
provoca un aumento en la inestabilidad genómica y la aparición de anomalías
cromosómicas. Por ejemplo, los ratones en los que el gen DNMT1 ha sido
inactivado muestran una elevada tasa de deleciones o duplicaciones de
regiones cromosómicas. Además, algunos oncogenes concretos se
sobreexpresan en algunos tumores por des-metilación de sus promotores (por
ejemplo el oncogén BCL2). Del mismo modo, se ha identificado una
enfermedad (Síndrome ICF, siglas de Inmunodeficiencia, inestabilidad
Centromérica y defectos Faciales) en la que los pacientes tienen mutaciones
en el gen DNMT3B, que codifica una metil-transferasa que metila
específicamente los satélites centroméricos 2 y 3; la desmetilación de esas
regiones de heterocromatina provoca fusiones entre cromosomas. En
conjunto, estos datos sugieren que la metilación es un mecanismo muy
importante para mantener la estabilidad del genoma.
Al mismo tiempo, la hipermetilación puntual de algunos genes
supresores tumorales, con el consiguiente silenciamiento y pérdida de
función, es un mecanismo muy frecuente de generación de distintos tipos de
cáncer. Por ejemplo, el gen RB1 está frecuentemente metilado en un tipo de
tumores llamados retinoblastomas esporádicos. También es frecuente la
hipermetilación (y silenciamiento) del gen supresor tumoral p16 en varios
tipos de tumores; la hipermetilación del gen VHL (Von Hippel-Lindau) en
20% de los carcinomas de células renales esporádicos; la inactivación, por
hipermetilación, del gen de reparación de desemparejamientos hMLH1 en
tumores de colon esporádicos que muestran inestabilidad de microsatélites.
En conjunto, se estima que en tejido tumoral hasta un 10% de las islas CpG
están metiladas, en contraste con células normales en las que este porcentaje
es mucho más bajo.
Por su parte, algunos complejos con actividad modificadora de la
cromatina se han asociado también con el desarrollo de cáncer. Por
ejemplo, el gen AIB1, que tiene actividad acetilasa de histonas, está
amplificado en cáncer de mama y por tanto se expresa a niveles más altos de
6
2
lo normal. Por otro lado, el co-activador transcripcional CBP, que también funciona
como una acetilasa de histonas, está fusionado con el gen MOZ ó con el gen MLL en
pacientes con leucemia mieloide aguda; esta fusión hace que la actividad acetilasa
esté aumentada en determinadas células de la médula ósea y esto desencadena la
leucemia. Además, otro co-activador transcripcional con actividad acetilasa de
histonas (la proteína p300) está mutado en cáncer colorrectal y delecionado en el
80% de los glioblastomas, un tipo de tumor cerebral. Lo mismo puede decirse de los
complejos con actividad des-acetilasa de histonas (HDAC): ya hemos visto que la
supresión de Myc y la unión de Rb con el factor de transcripción E2F dependen en
gran medida de su unión con complejos que tienen actividad des-acetilasa.
Además, se ha demostrado que algunas oncoproteinas virales como HPV
E7 ó el antígeno T de SV40 inactivan el gen RB1 al impedir su unión con complejos
que tienen actividad HDAC. Finalmente, las translocaciones asociadas con la
leucemia promielocítica producen fusiones entre factores de transcripción que
interaccionan con diversas acetilasas y des-acetilasas de histonas, con complejos
remodeladores de la cromatina y con proteínas que tienen actividad metil-transferasa
de histonas.
Considerando todos los ejemplos citados en los párrafos anteriores, podemos
concluir que los procesos que regulan la metilación de la cromatina están implicados
en la iniciación y progresión tumoral; esto, además, abre nuevas posibilidades
terapéuticas en muchos tipos de cáncer, ya que el estado de metilación es
potencialmente modificable mediante fármacos.

1.10. Relación entre secuencia, estructura y función de la cromatina:

territorios cromosómicos
Al ocuparnos de los mecanismos que regulan la función del genoma a nivel
global, es importante tener en cuenta el nivel superior de organización de un genoma
dentro del núcleo. En los últimos años se ha puesto en evidencia que distintas
regiones de la fibra de cromatina tienden a ocupar posiciones concretas en el
núcleo, dependiendo de la secuencia subyacente, del estado transcripcional de los
genes de esa región y de sus modificaciones epigenéticas, del tiempo de replicación
del ADN implicado, etc. Por tanto, cada vez está más claro que si queremos tener
6
3
 una imagen completa de cómo se regula la función del genoma, no podemos
ignorar aspectos estructurales tales como la composición en nucleótidos o la
posición dentro del núcleo.
Uno de los aspectos más intrigantes de la biología genómica de los
últimos años es la organización espacial de la cromatina dentro del núcleo de
la célula eucariota, dando lugar a lo que se han denominado "territorios
cromosómicos". Este concepto ha venido a completar la imagen del núcleo
eucariota como una estructura compartimentalizada, en la que distintas
regiones contienen maquinarias específicas que llevan a cabo funciones
concretas. Esta noción debe integrarse con la presencia de dominios
cromatínicos definidos y más o menos estables a lo largo de la vida de una
célula. Diversos estudios han mostrado de forma convincente que la
cromatina correspondiente a cada uno de los cromosomas tiende a ocupar
unas posiciones concretas en el núcleo en interfase, y que esas posiciones
tienden a mantenerse durante el ciclo celular. Por ejemplo, la posición de un
cromosoma concreto dentro del núcleo está relacionada con el tamaño del
cromosoma y con su riqueza en genes, que ―como hemos visto― se
correlaciona también con la secuencia de nucleótidos subyacente. En general,
se considera que los cromosomas pequeños tienden a localizarse hacia el
interior del núcleo; igualmente, cromosomas ricos en genes tienden a ocupar
posiciones centrales.
También existen datos que muestran que las regiones pobres en genes
y en secuencias Alu se asocian con la periferia del núcleo, dejando la
cromatina rica en genes en el interior. De todas formas, todavía se desconoce
cómo se establecen estos territorios y cómo se mantienen tras la mitosis.
La replicación del ADN y la transcripción génica son dos procesos
que tienen lugar dentro del núcleo y que exigen una remodelación importante
de la fibra de cromatina para permitir el acceso de las maquinarias proteicas
que los llevan a cabo. Además, se ha visto que ambos procesos no tienen
lugar al azar, en cualquier lugar del núcleo, sino en compartimentos
especializados a los que acuden las fibras de cromatina que están en la
vecindad. Se habla así de "fábricas de replicación" ó de "fabricas de
6
4
transcripción", regiones nucleares ocupadas por regiones genómicas que se replican
o transcriben simultáneamente aunque pertenezcan a territorios cromosómicos
distintos. Lógicamente, las asas de cromatina que ocupan una fábrica determinada
tendrán una configuración similar, en cuanto al grado de condensación de la
cromatina, la secuencia de nucleótidos, la riqueza en genes, etc; esto explica que el
genoma se organice como un mosaico de regiones que comparten características
similares, ya que esas regiones podrían interaccionar dentro del núcleo al situarse en
una misma fábrica de replicación o de transcripción. Por ejemplo, se ha visto que en
el genoma humano existen unas regiones llamadas RIDGES (Regions of IncreaseD
Gene Expression, en inglés) en las que son más abundantes los genes que se
transcriben activamente, y son regiones ricas en G+C, pobres en repeticiones tipo
LINE y con densidad génica alta. Junto a éstas, se observan también regiones con
poca densidad en genes, bajo nivel transcripcional y relativamente pobres en G+C,
que se llaman por tanto anti-RIDGES. Algo similar detectó el proyecto ENCODE,
del que se ha hablado en el capítulo anterior, al analizar una gran cantidad de
modificaciones epigenéticas a lo largo de todo el genoma. Según los datos de
ENCODE, se pueden definir dos tipos de regiones genómicas: a) dominios
“activos”, que serían las regiones definidas por niveles altos de transcripción,
replicación temprana, acetilación de la histona H3 y des-metilación de la lisina 27 de
la histona H3 (H3K27); b) dominios “inactivos”, correspondientes a regiones de
replicación tardía con poca actividad transcripcional, baja acetilación de H3 y
metilación de H3K27. Los dominios activos son muy ricos en sitios de inicio de la
transcripción, islas CpG y repeticiones Alu, mientras que las repeticiones tipo LINE1
y LTR están sobre-representadas en los dominios inactivos.
Pues bien, los genes presentes en RIDGES (equivalentes a los dominios
activos de ENCODE) tienden a localizarse, dentro del núcleo, en torno a las fábricas
de transcripción. Lo mismo sucede con los genes de replicación temprana, que se
asocian significativamente con las fábricas de replicación nucleares. Por tanto, los
modelos actuales postulan que los genes que son replicados o transcritos residen en
regiones cromatínicas relativamente descondensadas, las cuales salen de sus propios
territorios cromosómicos hacia fábricas de replicación o transcripción vecinas.
En esas fábricas, por tanto, pueden interaccionar regiones alejadas de un mismo
6
5
 cromosoma, o incluso asas de cromatina de territorios cromosómicos
distintos; esto permite explicar, en el caso de la transcripción, la acción de
potenciadores de la expresión que actúan a larga distancia ó incluso en trans.
Una de las aportaciones del proyecto ENCODE ha sido la de analizar,
a nivel global en todo el genoma, interacciones físicas entre regiones
distantes (interacciones de promotores con enhancers y otros elementos
reguladores relativamente alejados o incluso situados en otros cromosomas).
Esto da lugar a un cuadro bastante complejo en el que los promotores
interaccionan con muchos sitios, la mayoría de los cuales están a bastante
distancia (>120 kilobases). De hecho, sólo el 7% de las interacciones se
producen entre sitios reguladores y el gen más cercano. Además, se
observaron interacciones entre múltiples elementos a la vez, lo que da lugar a
redes de interacción que permiten una primera visión del genoma en tres
dimensiones.
Como es lógico, en todas estas interacciones son importantes las
modificaciones epigenéticas de la cromatina y del ADN que hemos estudiado
en este Capítulo, que en el fondo constituyen la base molecular que permite
los fenómemos de condensación y descondensación necesarios para la
replicación, transcripción y desplazamiento físico de las asas de cromatina.
Conjugando todos estos elementos, obtenemos una visión dinámica de la
cromatina nuclear en la que la estructura del núcleo se integra con la función
y secuencia del genoma. Esta visión es mucho más rica que los modelos
anteriores, que no tenían en cuenta todos estos factores, y además permite
explicar mucho mejor la regulación fina de la expresión génica durante el
desarrollo embrionario ó la diferenciación celular. La otra cara de la moneda
es que se trata de procesos tremendamente complicados y, por ello,
potencialmente frágiles, de modo que pequeñas perturbaciones en estos
mecanismos pueden dar lugar a alteraciones genéticas y enfermedades
humanas. En este sentido, el cáncer es un ejemplo típico de proceso
complejo de des-regulación de la diferenciación celular, en el que se observan
importantes alteraciones epigenéticas y una fuerte desorganización de la
estructura nuclear.
6
6
 1.11. La Estructura de la Cromatina
Con la secuenciación de gran número de genomas de distintos organismos y
sobre todo el de humano y otros eucariotas (levadura, arroz, Arabidopsis, Fugu
rubripes, Caenorhabditis), ha crecido el interés por saber cómo se regula la expresión
de los genes, cómo hacen las células para encenderlos o apagarlos de acuerdo a sus
programas de diferenciación y desarrollo. Se podría decir que nos falta conocer cómo
lee e interpreta la célula la información contenida en las cadenas del DNA: cómo a
partir de una tira de ácido desoxirribonucleico se logra obtener un organismo con
órganos, tejidos, extremidades y otras partes del cuerpo organizadas de manera
admirable de las técnicas microscópicas y bioquímicas se ha podido establecer que el
DNA (ácido desoxirribonucleico) está organizado en nucleosomas.
Anteriormente, los microscopistas habían podido observar la apariencia
nudosa de la cromatina, luego se vió con mayor claridad que tenía la apariencia de
perlas ensartadas en un hilo, los nucleosomas, que están formados por octámeros de
histonas, los cuales son proteínas pequeñas cargadas positivamente.
Las histonas se descubrieron en 1884 como componentes universales de los
cromosomas eucariotas y al refinarse los métodos de extracción se halló que estaban
constituídas por 5 tipos, H1, H2A, H2B, H3 y H4. La secuenciación de H4 permitió
saber que había una conservación casi perfecta entre las distintas especies (Kornberg
y Lorch, 1999), aunque también se ha detectado que la histona H3 está sujeta a
presiones adaptativas (Talbert et al., 2002).
El nucleosoma está compuesto de 146 pares de bases alrededor del centro
protéico de histonas. Si se impide la síntesis de histonas en levaduras se pierde el
arreglo en nucleosomas y se prenden los genes que estaban previamente apagados
(Kornberg y Lorch, 1999). Así, la ranscripción de genes que codifican para proteínas
requiere, además de la presencia de la pol II, factores generales de transcripción, T F
IIA, B, D, E, F y H; TF IID es un complejo compuesto de varias subunidades que
incluyen a TBP, la subunidad que se une a la caja TATA (Kim et al., 1994).
La posición que ocupa la cromatina dentro del núcleo es también importante
para la regulación; la que se localiza en el nucleolo o la periferia nuclear es menos
móvil que la que ocupa el interior del núcleo.
Los telómeros están anclados en la periferia del núcleo, donde hay
6
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 heterocromatina anclada a la membrana nuclear y eucromatina adyacente al
poro nuclear; al parecer la membrana nuclear puede servir de anclaje a los
factores de transcripción, contribuyendo así a la regulación genética (Carmo-
Fonseca, 2002). Las regiones del genoma que no se transcriben están
empacadas en heterocromatina, que está muy condensada, por lo cual no es
accesible a las proteínas que participan en la transcripción.
Los genes que se transcriben están en la eucromatina, que es más
accesible. El “corazón” del nucleosoma comprende al ADN enrollado (como
un ovillo) alrededor del tetrámero de histonas (H3)2 (H4)2 en el centro y las
H2A-H2B con dos copias de cada una en los extremos; los centros de los
nucleosomas se conectan entre sí a través de los conectores “linkers”,
secuencias de DNA de longitud variable pero importantes para la regulación
genética.
La histona H1está cerca del centro del nucleosoma pero en el interior
de la fibra de cromatina, junto con el “conector” al que se une; las otras
histonas tienen unas “colas” que sobresalen desde el corazón del nucleosoma
y la cola de la histona H4 de un nucleosoma interactua con el dímero
H2AH2B en la cara plana del nucleosome adyacente. Las interacciones
histona-DNA se restringen a la columna de enlaces fosfodiéster de las hebras
del DNA en la superficie interna de la superhélice; hay interacciones
electrostáticas y puentes de hidrógeno con el fosfato y contactos no polares
con la desoxirribosa.
Debido a esto y a que no interactúan con las bases del ADN, las
histonas pueden empacar cualquier DNA, sin importar su secuencia
(Kornberg y Lorch, 1999). Cada tipo celular, durante la diferenciación y el
desarrollo, empaca sus genes en un patrón único que es mantenido a lo largo
del ciclo celular y por lo tanto durante las divisiones celulares, heredándose
las características del linaje celular de generación en generación. Podría
decirse que las células de determinado órgano mantienen accesibles los genes
que usarán para cumplir su función y mantendrán apagados el resto
(Orphanides y Reinberg, 2002; Pflumm 2002). Por otra parte, el
silenciamiento de los transgenes está correlacionado con un aumento en la
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metilación del promotor del gen y es meiótica y mitóticamente heredable (Li et al.,
2002; Bender, 2001; Choi et al., 2002). Las evidencias indican que la “desrepresión”
o “liberación” al nivel de la fibra de cromatina precede a la del nucleosoma
individual; en vertebrados los genes transcripcionalmente activos (encendidos) están
en dominios cromosomales tan grandes como 100 kb (kilobases); en éstos parece
haber una descondensación de la cromatina e incluye un locus que puede regular la
actividad de varios genes dentro de un dominio único (locus regulador) y a los
aisladores “insulators” que delimitan las fronteras del dominio y que además
muestran un incremento en la acetilación de las colas de las histonas.
Hay aminoácidos específicos sobre las colas de las histonas que pueden ser
modificados por acetilación, fosforilación, ubiquitinación y ADPribosilación, lo que
ha llevado a postular que existe un código de histonas, es decir, que dependiendo de
las modificaciones que presenten éstas, los genes pueden o no transcribirse. Se
propone que los distintos patrones de modificación en las colas que están a la altura o
nivel de los promotores de los genes, facilitan o impiden la unión de las proteínas
que modifican la cromatina, incluidos los coactivadores y los correpresores.
La fosforilación de la H3 en su residuo de serina 10, junto con la acetilación
del residuo de la lisina 9 y/o la lisina 14 provoca la activación de genes que se
expresan de manera temprana durante el desarrollo de la planta; pero la fosforilación
de H3 y la incorporación de un análogo pericéntrico de H3, junto con otras señales,
puede inducir la condensación mitótica del cromosoma (Gamble y Freedman,2002;
Li et al., 2002; Kornberg y Lorch, 1999).
La posición de los genes en el núcleo y la compartamentalización de
proteínas son: otro modo de regular la transcripción. Las plantas, levaduras y
animales tienen dos tipos de histona acetil-transferasa (HAT-A) y(HAT-B); la
segunda acetila histonas en el citosol mientras que la primera la acetila en el
nucleosoma; la acetilación permite la transcripción mientras que la desacetilación lo
impide; en plantas hay tres tipos de desacetilasas (HDAC); una tipo RPD3, otra
HDA1; ambas parecidas a las de levadura y tienen además un tipo HD2 que parece
ser propio de plantas (Li et al., 2002). Las HATs, HDACs, metil transferasas e
histona cinasas son reguladores que catalizan la modificación post-traduccional de
las histonas.
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 El reclutamiento de HATs y HMTs a los promotores de los genes por
parte de los activadores da como resultado la acetilación y metilación,
respectivamente, de las histonas y se requieren para la activación de muchas
clases de genes. El reclutamiento de las HDACs por parte de los represores
transcripcionales provoca la desacetilación de las histonas y se requieren para
la represión (Orphanides y Reinberg, 2002).
1.12. Los complejos remodeladores de cromatina
La accesibilidad del DNA a la proteína es regulada por varios
complejos enzimáticos que alteran la estructura del nucleosoma en una forma
dependiente de ATP o por modificación de las histonas; este remodelamiento
de la cromatina permite que pueda interactuar con los factores de
transcripción, mediante los cuales, los genes son expresados de manera
específica (Emerson, 2002). Uno de los complejos multiprotéicos que
modifican la estructura del nucleosoma es SWI/ SNF; este complejo es capaz
de transferir el octámero de histona de una cadena de ADN a otra y, además,
está evolutivamente muy conservado (figuras 3 y 4). Otra manera de poner
accesible el DNA a los factores de transcripción es deslizando la cadena de
DNA sobre las histonas,dejando así expuesta una parte de la cadena que antes
no lo estaba (Choi et al., 2002).
Como se mencionó, al parecer, en una primera fase se modifican las
colas de histona y en una segunda se da el reclutamiento de factores como
consecuencia de la modificación de las histonas y se provoca el cambio local
de la estructura de la cromatina; después de esto se da el reclutamiento de la
maquinaria basal de transcripción. La transcripción requiere no sólo la unión
de proteínas activadoras al promotor, también se necesitan proteínas
mediadoras que forman complejos grandes que interactuan con activadores o
represores y la RNA polimerasa II (pol II) para facilitar o reprimir la
transcripción al llevar las señales desde los factores de regulación a la
maquinaria de iniciación basal (Emerson, 2002, Martel et al., 2002).
Los activadores y represores interactúan con el dominio carboxilo-
terminal de la pol II y los mediadores se requieren para la regulación de
muchas familias de genes. Hay dos tipos de correguladores de la
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0
transcripción: coactivadores reclutados por receptores nucleares unidos a ligando y
correpresores reclutados por receptores sin ligando unido o unidos a antagonistas
(Orphanides y Reinberg, 2002). Es decir, los receptores nucleares al unir su ligando,
unen también al corregulador y activan la transcripción.
En cambio, cuando no tienen ligando unido forman parte del complejo que
reprime la transcripción. Los factores de transcripción tienen actividad de HAT y
muchos correpresores tienen actividad de desacetilasa (Kornberg y Lorch, 1999).
Las DNA-metil transferasas y las histona desacetilasas están evolutivamente
muy conservadas; en plantas MET1 mantiene la metilación de dinucleótidos CpG y
CMT3 en CpNpGp y la metilación en éstos parece ser parcialmente redundante para
silenciar la mayoría de los genes;por ejemplo, la vernalización (exposición corta a
frío) reduce la metilación del DNA y promueve la floración temprana en
Arabidopsis. El DNA metilado atrae proteínas de unión a metil-citosina (MeCp) que
a su vez recluta desacetilasas que ayudan a formar la estructura de la cromatina
inactiva (Liet al., 2002, Bender, 2001). La maquinaria de transcripción es
ensamblada sobre los promotores, que se encuentran cerca del sitio donde se inicia la
transcripción; los activadores y represores se unen a otras secuencias de DNA y
afectan el estado transcripcional del gen, estas secuencias pueden estar localizadas en
la vecindad del promotor, en regiones delimitadas llamadas elementos reguladores
cis, o pueden hallarse alejadas a miles de bases del promotor e influir, no obstante,
sobre el nivel de la transcripción del gen.
El orden en que los distintos complejos se unen a un promotor parece
depender del tipo de promotor; en el Ho de la levadura primero se reclutan los
complejos remodeladores de cromatina y luego los que tienen actividad HAT; el
orden inverso se observa en el promotor del interferón (IFN-β). El receptor de
glucocorticoides se une a un elemento corto de DNA en el surco mayor de la doble
hélice y puede unirse a esta secuencia a pesar de que se halle en la región ocupada
por el nucleosoma; en cambio, el factor activador nuclear 1 reconoce una secuencia
más larga de DNA y es incapaz de unirse a ella si ésta se encuentra en los dominios
de un nucleosoma (Orphanides y Reinberg, 2002).
Los puentes de hidrógeno son muy importantes en el reconocimiento de las
secuencias a las que se unirán los factores de transcripción; enlaces mediados por
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1
 agua e interacciones de Van der Waals también toman parte para establecer la
interacción, aunque contribuyen más a estabilizar el complejo que a
determinar la especificidad; hay tambiéninteracciones hidrofóbicas que
contribuyen a la unión de la proteína con el ADN (Kornberg y Lorch, 1999).
Algunos ejemplos de la regulación de la expresión
Los receptores de hormonas esteroides, localizados en el núcleo, se
unen a potenciadores (enhancers) cercanos a promotores de respuesta a estas
hormonas. En ausencia de ligando (hormona) los receptores se hallan unidos
a correpresores que atraen el complejo sin3-HDAC y reprimen la
transcripción.
Cuando unen al ligando los receptores reclutan al complejo p300/
CBP, que tiene actividad de HAT, para potenciar la transcripción, además de
que también interactúan con el complejo mediador que da la señal a la pol II
para iniciar la transcripción (Kornberg y Lorch, 1999).
La proteína NF-E2 está compuesta por las subunidades p18 y p45 y es
un activador necesario para la expresión de la β-globulina; el loci que
codifica para ésta se halla localizado en la heterocromatina centromérica lo
mismo que p18, mientras p45 se halla localizado en la eucromatina. Durante
la diferenciación y antes de que se exprese el gen de la globulina, p18 es
trasladado hacia la eucromatina y se une a p45; una vez que se lleva a cabo la
diferenciación el loci de la β-globulina pasa de la heterocromatina a la
eucromatina y el gen es transcrito de manera activa (Emerson, 2002).
El potenciador del gen del interferón β está libre en el nucleosoma
pero la caja TATA no está accesible a los factores de transcripción; la HAT
GCN5 entra al principio para acetilar al nucleosoma, que permite al complejo
de HAT, CBP y la pol II unirse a la región de inicio de la transcripción
(Emerson, 2002). Dos proteínas conocidas como CBP/p300 parecen ser
reguladas mediante diversas modificaciones, incluyendo varias cinasas que
las fosforilan; de hecho no hay interacción física entre CBP y p300. CBP es
fosforilada en el residuo de serina 436 en una forma dependiente del factor de
crecimiento y esta fosforilación permite el reclutamiento de los promotores
dependientes de AP-I, además de reclutarse al complejo fos, jun y el factor de
7
2
transcripción específico de pituitaria Pit-1 (Gamble y Freedman, 2002). También,
CBP/p300 puede ser metilado por CARM 1 cuando es blanco de receptores
hormonales localizados en el núcleo; cuando CBP/p300 está metilado no puede ser
reclutado
por el activador CREB, de esta manera se impide la estimulación de la
transcripción en respuesta a la vía del cAMP (AMP cíclico). CARM1 funciona
entonces como coactivador de promotores inducibles por hormonas o como
correpresor de genes de respuesta a cAMP a través de la metilación del nucleosoma o
la metilación del cofactor (Emerson, 2002). En el tejido vegetativo de plantas, el gen
de la faseolina tiene un promotor (phas) no inducible por ABA (ácido abscísico),
pero que presenta una alta respuesta en embriones intactos. La respuesta diferencial
al ABA en los dos tejidos se debe a que en hoja el promotor phas se halla en una
estructura de cromatina represiva pero en semillas en desarrollo adopta una
configuración distinta, concomitante con su activación transcripcional. El cambio en
la cromatina es mediada a través de PvALF, un factor de transcripción específico de
semilla; el cambio permite la unión de factores de transcripción activados por ABA
(Li et al., 2002). Otros mecanismos de silenciamiento de genes, como aquéllos que se
ponen en marcha para silenciar ciertos genes que llevan la impronta paterna o
materna (imprinting), están siendo también desentrañados, como el caso del gen
DME, que codifica para una proteína de localización nuclear y con actividad de
glicosilasa; esta proteína podría marcar al alelo
MEA materno en el gametofito hembra permitiendo su expresión después de
la fertilización y como el alelo paterno no está marcado, no se expresa. Una de las
funciones de MEA es impedir la proliferación de la célula central y el desarrollo del
endospermo antes de la fertilización (Choi et al., 2002). En animales también parece
intervenir el ARN en el silenciamiento de genes; a partir del cromosoma X inactivo
se produce un ARN (ARN ist) que “decora” al cromosoma silenciado y parece iniciar
el silenciamiento; la metilación del residuo de la lisina 9 de H3 “marca” además la
heterocromatina constitutiva, pero no la facultativa (Carmo- Fonseca, 2002).
En células de mamífero se requiere de la actividad del proteosoma para que
se dé la actividad transcripcional inducida por el receptor de estrógenos; la
ubiquitinación potencia la actividad de un factor de transcripción, pero también es
7
3
 señalado de este modo para su degradación; la subunidad más grande de la
pol II también es ubiquitinada durante la transcripción in vitro, lo que podría
marcarla asimismo para la degradación. En la levadura se requiere del
proteosoma 19S para el alargamiento de la transcripción (Orphanides y
Reinberg, 2002). Poco después de iniciada la transcripción el RNA que está
siendo sintetizado es modificado por la adición de un “capuchón” (cap) en su
extremo 5´ que lo protege del ataque de nucleasas y sirve para la unión de
proteínas que participan en su exportación al citosol; este capuchón toma
luego parte en la traducción.
Cuando la pol II llega al final del gen, se detiene y el nuevo RNA es
escindido y se le agrega una cola de poli A en el extremo 3´. El mRNA es
llevado al citosol y se inicia la traducción mediante el reconocimiento del
codón de iniciación por factores traduccionales en conjunción con
subunidades del ribosoma (Orphanides y Reinberg, 2002). El estudio del
control de la transcripción es un tema de investigación básica que ha
permitido explorar, por ejemplo, acerca de las relaciones filogenéticas entre
organismos (White y Bell, 2002); pero también ha permitido avanzar en el
conocimiento de lo que ocurre con los transgenes, por qué se expresan más o
menos o son silenciados dependiendo del sitio de inserción del transgen en la
cromatina. Esto, evidentemente, tiene una aplicación al transformar
genéticamente a los organismos (Sutter et al., 2003). En plantas un tipo de
histona (H2A) es esencial para la integración del T-DNA en Arabidopsis (Li
y Holmes-Davis, 2002). Finalmente, como se dijo en la introducción, este
tema es muy amplio y avanza rápidamente. La importancia de la regulación
de la transcripción de los RNA mensajeros que codifican para los RNA
ribosomales 18S, 5.8S y 28S, a los que la célula dedica hasta el 50% de su
actividad transcripcional, es objeto de grandes esfuerzos a fin de elucidarla
(Moss y Stefanovsky, 2002). De hecho, el control de la RNA polimerasa II, al
momento de iniciar y llevar a cabo su actividad es un tema que abarca
muchas páginas en sí mismo (Young et al., 2002).

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