EXPERIMENTO # 9

DETERMINACIÓN DE CAFEINA EN BEBIDAS REFRESCANTES

MEDIANTE HPLC

I. OBJETIVOS
• Determinar el contenido de cafeína presente en bebidas refrescantes por
HPLC

II. MARCO TEÓRICO

Las bebidas conocidas popularmente como refrescos o bebidas refrescantes son bebidas
no alcohólicas preparadas, principalmente, a base de agua potable o mineral. En las últimas
décadas se ha dado un aumento en el consumo de estas bebidas refrescantes, en especial
las que contienen cafeína.

La cafeína es un alcaloide del grupo de las xantinas presente en algunas bebidas

refrescantes hechas a partir de componentes naturales. También es adicionada como
aromatizante para aportar sabor y olor a los refrescos de cola.

Las bebidas que contienen cafeína son consumidas diariamente por los efectos
estimulantes que produce como disminución de la sensación de fatiga y la somnolencia.
Si bien la estimulación del sistema nervioso puede resultar beneficiosa, un exceso en la
dosis puede producir reacciones adversas como nerviosismo, taquicardia, ansiedad,
taquicardia, irritabilidad, y problemas gastrointestinales. Es por ello, que conocer los
niveles de cafeína en las bebidas que consumimos es importante. Los niveles legales
permitidos son inferiores a los 150 mg/L.

Figura 1. Cafeína
Entre los distintos métodos existentes para llevar a cabo la determinación cuantitativa de
la cafeína, cabe destacar las técnicas cromatográficas, como la cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC). En esta práctica se va a llevar a cabo la cuantificación de cafeína
en bebidas refrescantes mediante HPLC en fase inversa con detección ultravioleta.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

HPLC-UV, matraces aforados, pipetas graduada, probetas, balanza analítica, columna

cromatográfica C 18, jeringas, pipetas aforadas, vasos químicos de 100 mL, baño de
ultrasonidos, micro jeringa de 100 µL, filtro de membrana de nylon, cafeína, metanol para
HPLC, muestra de bebidas refrescantes, ácido acético para HPLC, agua Milli Q.

IV. FASE EXPERIMENTAL

Preparación de las muestras

Se analizaron tres muestras de bebidas: Coca Cola regular (A), Pepsi (B) y Red Bull (C)
1. Las muestras fueron colocadas en un vaso químico y desgasificadas usando un
baño de ultrasonido.
2. Luego 2.5 mL de la muestra fueron diluidas a 5 mL. De la nueva disolución se
filtraron 2 mL a través de un filtro de jeringa de 0,22 µm. La solución filtrada se
transfirió a un vial de muestra para su análisis.

Preparación del estándar de cafeína

Se disolvió 0,01 g de cafeína en aproximadamente 5 mL de agua Milli Q. La disolución

resultante se transfirió a un matraz aforado de 10 mL y se enrasa con agua Milli Q. A partir
de esta disolución prepararon cinco disoluciones patrón de 10 mL que contenían
concentraciones entre 5 y 30 ppm y se enrasan con la disolución de la fase móvil. Las
disoluciones fueron empleadas en la construcción de las curvas de calibración.
Condiciones operacionales del HPLC para el análisis

Columna Sorbax SB C18

Temperatura ambiente
Detector UV: 270 nm
Volumen de muestra: 60 µL.
Flujo: 0.75 ml/min
Fase móvil: agua metanol (1:1) con 1% de ácido acético

Se inyectaron las disoluciones patrón de cafeína al equipo de HPLC. Luego, se inyectaron

las muestras.

Resultados
1. El tiempo de retención del analito fue 6.41 min.
2. Las áreas registradas para las diferentes concentraciones de los patrones de
cafeína se muestran a continuación

Cafeína (mg/L) Área

5 846.98
10 1681.5
15 2474.5
20 3225.3
30 4826.9

3. Los cromatogramas de las muestras se muestran en las siguientes páginas

 Calibration Report

Data file: C:\Cc2020-11-11 A

Sample name: Muestra A

Description:
Sample amount:

Percent report based on Area Name

RT [min] Area Height RF Amount
cafeina [mg/L]
1.425 248.321
1.721 120.32
2.537 235.516
6.481 2624.849
 Calibration Report

Data file: C:\Cc2020-11-11 B

Sample name: Muestra B.

Description:
Sample amount:

Percent report based on Area Name

RT [min] Area Height RF Amount
cafeina [mg/L]
1.541 50.32
2.525 120.516
6.385 2863.3347
 Calibration Report

C:\Cc2020-11-11 C
Data file:

Sample name: Muestra C

Description:
Sample amount:

Percent report based on Area Name

RT [min] Area Height RF Amount
cafeina [mg/L]
1.64 50.412
2.604 20.522
6.435 3223.7075