BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

GUIA DE LABORATORIO BLC-FT-002-

BUC Versión: 02

Curso: Bioanálisis Cód. Curso: 17946

Nombre del profesor: Ximena Montes Guía No: 2
Rincón
Horas totales (desarrollo de la 2 Tema: Hemoglobina Plasmática
práctica): Libre

1. Introducción
1. Definiciones

Hemoglobina Plasmática Libre: es la hemoglobina presente en el plasma como resultado del

proceso de lisis de los glóbulos rojos. La hemólisis es común en pacientes con circuitos
extracorpóreos.

Terapia ECMO: Oxigenación por membrana extracorpórea. La oxigenación por membrana

extracorpórea es un tratamiento que utiliza una bomba para hacer circular sangre a través de un
pulmón artificial de nuevo hacia el torrente sanguíneo de un paciente enfermo.

2. Fundamento de la prueba
La prueba se fundamenta en la conversión de especies de hemoglobina (incluyendo
cianometahemoglobina) en un complejo estable de hemoglobina alcalina en presencia de Triton
X-100 y NaOH 0,1 M (Reactivo AHD – Detergente de Hematina Alcalina), el cual absorbe a 575
nm. La determinación de Hemoglobina Plasmática Libre se basa en la comparación de la
absorbancia a 575 nm de las muestras desconocidas y la absorbancia de patrones de
concentración conocida de hemina después de la reacción con el Reactivo AHD.

3. Valores de referencia

La concentración normal de hemoglobina libre en plasma es menor o igual a 30 mg/dL

4. Interferencias

Las muestras hemolizadas, ictéricas, lipémicas o con turbidez dan resultados falsamente altos
con la prueba de Determinación de Hemoglobina Plasmática
2. Objetivo de la práctica
 Reconocer la importancia de la Terapia ECMO
 Describir el fundamento de la prueba de Hemoglobina Plasmática Libre
 Interpretar correctamente los resultados del control de calidad de la prueba de
Hemoglobina Plasmática Libre
 Interpretar los resultados obtenidos en la prueba
3. Metodología
3.1. Lista de materiales y equipos
Falcon de 15 mL
Pipeta de 5 mL
Pipeta de 10 mL

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Pipeteador
Lector de ELISA de 570-590 nm
Incubacdora de 37°C
Viales de 1.5 mL
Micropipeta de 1000 uL
Micropipeta de 10 uL
Agua destilada
Lector de placas de ELISA
3.2. Procedimiento
Tipo de muestra: Plasma citratado

Procesamiento de la curva de calibración

- Tener en cuenta que los estándares se deben procesar por duplicado.

- Marcar 8 tubos de 1,5 mL de la A – H
- Adicionar la cantidad de reactivo Detector 1X (Hemoglobina Detector) y estándar de
Hemina (500 µM Hemoglobin Standar) según la siguiente tabla:

Estándar de Detector Concentración

Calibrador Hemina 1X final
(500 µM) (mg/dL)
µL µL
A 0 500 0
B 10 490 16
C 25 475 40
D 50 450 80
E 100 400 160
F 150 350 240
G 200 300 320
H 250 250 400

- Servir 200 µL de los estándares según la hoja de trabajo diario Protocolo de Lectura
de Placa por Colorimetría (R-MAM404-208).
- Hacer lectura en el equipo.
o Incubación 15 minutos
o Mezclar la placa.
o Lectura fotométrica a 570-595 nm.

Procesamiento diario de muestras

- Por cada lote de pruebas incluir un estándar como control del ensayo. Seleccionar un
nivel (un estándar) para controlar la prueba.
- Siempre procesar el estándar y las muestras por duplicado.

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- Preparar en un vial de 1,5 mL el estándar a utilizar en el montaje, teniendo en cuenta

lo descrito en Procesamiento de la Curva de Calibración.
- Procesamiento de estándares: Adicionar a la placa 200 µL del estándar de
hemoglobina previamente preparado, en los pozos correspondientes.
- Procesamiento de muestras: Adicionar a la placa 180 µL de Detector de
Hemoglobina y 20 µL de muestra, para completar el volumen final de 200 µL.

Importante: realizar un adecuado pipeteo de las muestras, evitando la generación de

burbujas dentro de las celdas, porque esto puede generar

 Incubar la reacción 15 min a temperatura ambiente protegida de la luz.

 Lectura de placa en Lector de ELISA
 Realizar la curva de calibración en Excel y calcular la Hemoblogina Plasmatica Libre de
la prueba.

Validación de resultados

Para validar el montaje verifique que la absorbancia obtenida para el estándar procesado
se encuentra entre los valores esperados (máximo un 10% de variación con respecto al
dato obtenido en la curva de calibración).
4. Resultados y Discusión

5. Conclusiones

6. Bibliografía (Norma Vancouver)

CONTROL DE CAMBIOS

FECHA DE
VERSIÓN DESCRIPCIÓN DEL CAMBIO RESPONSABLE
APROBACIÓN

01 Elaboración de formato Docente: Biannys Milena Rojas 13/08/2020

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Modificación del encabezado – siguiendo las

pautas de la oficina de gestión documental.
02 Docente: Andrea Johanna Parada 04/03/2021
Inclusión del ítem tema

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