Instituto Politecnico Naciona Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio Metodos de Analisis
Determinación de cafeína en refrescos por HPLC
Profesora: Rosas Sandoval Guillermina
Alumno
Resultados:
Tabla 1. Condiciones cromatográficas
Fase estacionaria: C18
Longitud: 150 mm
Diametro interno: 4.6 mm
Columna: VARIAN, Res Elut 5u, C18, 90 Å Tamaño de partícula: 5 μm
Fase móvil H2O - Metanol (35:65)
Flujo 1.0 mL/min
Detector UV, 273 nm
Volumen de inyección 20 μL
% DER (triplicado de inyecciones) 1.50%
Presión del sistema 3.55 Kpsi
Tabla 2. Tiempos de retención, área bajo la curva de mediciones repetidas por muestra y concentraciones media de
las mismas.
Concentración de la
Muestra tR (minutos) Área bajo la curva (pixeles) Datos estadisticos muestra (mg/100mL)
2 561660
2 559976 X 561266
2 561794 S 838.2909
Éstandar 2 560872 %CV 0.14 10.3
2 711862 X 714283
2 715184 S 1717.9797
Coca cola
light 2 714283 %CV 0.24 13.1080
2 741261 X 636828
2 742224 S 1460.1007
Coca cola
café 2 739355 %CV 0.22 11.6866
2 1053497 X 1055653
2 1055653 S 1706.8016
Pepsi kick 2 1056867 %CV 0.16 19.3726
Calculos:
C oncentración (mg/100mL) :
561266 pixeles −−−−−− 10.3mg/100 mL
(714283)(10.3)
714283 pixeles −−−−−− X mg/100 mL X mg/100 mL = 561266
= 13.1080 mg/100mL
Tabla 3 . Datos cromatográficos del perfil de elución de coca-cola Cafe
Tiempo de corrida 3.5 min.
Tiempo de retención cafeína (tR A) 2.0 min.
Tiempo de retención segundo pico (tR B) 1.7 min.
Tiempo muerto (to) 0.7 min.
Factor de capacidad (K’ A) 1.8571
Factor de capacidad (K’ B) 1.4285
Factor de selectividad (α) 0.7692
Platos teóricos Cafeína (N) 1600
Altura equivalente de plato cafeína (H) 0.0937
Resolución (Rs) 1.5
Calculos:
S uperf icie de contacto :
V olumen columna = π r2 h = (π(2.3mm)2 )( 150mm) = 2492.8537mm 3
V olumen esf era = 34 πr3 = 34 π0.00253 = 6.5447x10 −8 mm 3
N úmero de esf eras = V olumen columna / V olumen esf era = 2492.8537mm 3 /6.5447x10 −8 mm 3 = 38, 088, 000, 000
Area esf era = 4πr 2 = 4π(0.0025) 2 = 7.8537x10 −5 mm 2
S uperf icie de contacto = (Area esf era )(N úmero de esf eras) = (7.8537x10 −5 mm 2 )(38, 088, 000, 000) = 2991336.3mm 2
F actor de capacidad (K´) :
t 0 = 0.7min t R A = 2.0min t R B = 1.7min K´ A = 2.0 − 0.7/0.7 = 1.8571 K´ B = 1.7 − 0.7/0.7 = 1.4285
F actor de selectividad (α) :
(tR) B −to 1.7−.07
α= (tR) A −to = 2.0−0.7 = 0.7692
Resolución (Rs) :
2[(tRB )−(tRA )] 2[2.0−1.7]
W A = 0.2 W B = 0.2 Rs = W A +W B
= 0.4
= 1.5
P latos teoricos (N ) :
2 2
N = 16(tR A /W A ) = 16(2.0/0.2) = 1600
Altura equivalente de plato (H) :
H = L/N = 150/1600 = 0.0937
Figura 1. Cromatogramas de estándar de cafeína y tres muestras de refrescos comerciales.
Figura 2. Comparativa de cromatogramas intercalados con perfiles de elución en diferentes colores, negro para el
estandar de cafeína, rojo obscuro para coca-cola light, coca-cola cafe rojo claro y pepsi kick en azul.
Discusión:
En la mayoría de los cromatogramas de las muestras encontramos un pico corresponde al
observado en el estándar, con un tiempo de retención de 2.0 minutos, indicando que en efecto,
nuestras muestras contienen cafeína dentro de su formulación, además de cafeína, todos los
cromatogramas de las muestras de bebidas de cola presentaron picos a diferentes tiempos de
retención, algo que no es inusual dado que refrescos son conformados por múltiples
componentes como saborizantes, edulcorantes y conservadores, alguno de estos
ingredientes podría continuar presente tras los procesos de sonicación, filtración y
centrifugación a los que se sometieron las muestras suponiendo que alguno de estos presente
características similares a las de la cafeína. En este análisis no se puede determinar con
certeza a qué compuesto pertenecen los picos no correspondientes a cafeína observados en
pepsi kick y coca cola light, dado que dentro de los ingredientes enlistados en los ingredientes
de las bebidas no se encuentra ningún compuesto correspondiente a estos picos pero
considerando que tanto pepsi kick y coca cola light penetran estos picos que son casi
idénticos entre sí (figura 1) podemos suponer, más no afirmar, que puede deberse a un
ingrediente presente para dar el sabor a bebida de cola, enlistado en los ingredientes como
concentrado. Para dar más peso a este argumento necesitamos realizar más determinaciones
con múltiples marcas y bebidas e otros sabores para saber si estos picos se presentan en
todos los casos, además de un posible barrido de muestras para saber si hay una longitud de
onda donde estos compuestos sean más evidentes e iniciar un análisis cualitativo.
En el caso de coca cola café, encontramos que múltiples picos que no corresponden a cafeína,
por lo que se hizo un cálculo de factor de capacidad para ambos picos, el de cafeína y el más
cercano a esta hacia la derecha.
K ´ A (caf eina) = 1.8571 K´ B (2° pico) = 1.4285
Un valor de K´que supera 10 unidades se considera despreciable desde el punto de vista
analitico mientras que una menor a una unidad es de resolución inadecuada por lo que las
condiciones en las que se llevó a acabo esta cromatografía son adecuadas para esta muestra
que aparentemente contiene concentrados que difieren de una bebida de cola regular, esta
está enlistada como “concentrado de cafe”
Figura 3. En Listado de ingredientes de cada muestra. A: coca cola light, B: coca cola caf, C: Pepsi kick, D: Red Bull
Las tres muestras presentan una cantidad variada de cafeína entre sí, esta se puede observar
en el la figura 2 donde se intrelapan los picos de concentración de cafeína poniendo en
manifiesto el aumento entre significativo entre las muestras y el estándar, estos datos se
cuantifican en la tabla 2 para otorgar un valor de mg/100 mL a cada muestra.
La norma oficial mexicana NOM-218-SSA1-2011 presente en el diario oficial de la nación
viernes 12 de febrero de 2012 , la cantidad máxima de cafeína que puede ser agregada a un
producto de consumo es 200 mg/L
Tabla 3. Comparativa de valores de cafeína
NOM-218-
Muestra Coca Cola light Coca Cola cafe Pepsi kick RedBull SSA1-2011
Exp Enlistado Exp Enlistado Exp Enlistado
Cafeina
(mg/L) 131.08 126.12 116.86 144.46 193.72 182.20 320.00 200
*Exp= valor experimental
Con respecto al valor dado por la norma oficial y los enlistados en la tabla 3 podemos ver que
todas las muestras concuerdan con esta ya que ninguna rebasa los 200 mg/L de cafeína
añadida pero los valores no son exactos los obtenidos en el laboratorio siendo menor al
enlistado en coca cola cafe y mayor al enlistado en coca cola light y pepsi kick, dado que el
error no es ni consistentemente mayor o consistentemente negativo podemos afirmar que las
muestras presentan una variación con respectos las cantidades de cafeína que contienen, algo
común en los productos de consumo masivo
Aunque en este caso todas la muestras cumplen con la norma oficial mexicana cabe recalcar
que el consumo excesivo de cafeína en exceso es dañino para la salud, aunque a nivel
mundial se consumen 300 toneladas diarias de café a nivel mundial por sus efectos como
estimulante del sistema nerviosos central no se debe ignorar sus efectos a largo plazo como
temblor constante al momento de hacer movimiento finos y resistencia a la cafeína, mismo
efecto que orilla a muchos a hacer uso bebidas con mayor concentración de cafeína como las
analizadas en este trabajo o inclusive bebidas que rebasan la medida recomendada por las
autoridades sanitarias como Red Bull que es 50% mayor (estas se exentan de la norma por no
ser comercializadas directamente a niños y siendo tratadas más como “suplemento alimenticio”
cuyas restricciones no son iguales a las de las bebidas de cola), considerando que la cafeína
evolucionó originalmente como un insecticida para alcanzar una dosis letal sería necesario
consumir una cantidad exageradamente alta en la que tendrás que consumir un gramo de
cafeína por cada kilogramo de tu masa para alcanzar una dosis letal.
Y si bien el posibilidad de muerte por consumir bebidas con cafeína es inexistente y las únicas
muertes en rencor por eso son de gente que toma pastillas de cafeína, también se tiene que
tener en cuenta que la cafeína es fisiológicamente adictiva y puede producir daño nervioso a
largo plazo.
Conclusión:
El sistema de cromatografía líquida de alta resolución demostró ser extremadamente eficiente
dada su sencillez para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo preciso con una cantidad
mínima de muestra, lo que de gran relevancia en industrias donde la cantidad de un analito
puede resultar fatal si está en mayor cantidad.
Biliografía:
● Rubiano Jesus A., Zuluaga Dominguez C. M. (2011) Determinación y estandarización
de un método para cafeina en el proceso de torrefacción por cromatografía líquida de
alta eficiencia. ,Ibagué, Colombia, Revista especializada en ingeniería de procesos
alimentos y biomateriales. Vol.6 ISSN 19006608
● https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1022034/pdf/westjmed00087-0054.pdf
(05-06-20)
● https://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8246/7/T2cromagraf.pdf (5-06-20)
● http://www.salud.gob.mx/cdi/nom/compi/NOM-218-SSA1-2011.pdf (5-06-20)
● https://www.youtube.com/watch?v=OTVE5iPMKLg (6-06-20)
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