EXPERIMENTO 8

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFÍA LIQUIDA

DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

I. OBJETIVOS
Entender el fundamento de la cromatografía líquida.
Determinar el contenido de carbohidratos en muestras de mieles nacionales.

II. MARCO TEÓRICO

La cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de análisis instrumental

en el cual los componentes a separar son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria, mientras que la otra es móvil (se mueve en una dirección definida). La
separación se logra en base a la diferencia de velocidad de movilidad de los analitos entre las
fases. Esa movilidad va depender del grado de afinidad que tenga el analito con la fase
estacionaria y la fase móvil.

En la HPLC la fase estacionaria esta empaquetada dentro de una columna que está conectada
a un sistema continuo de flujo de la fase móvil, y a un sensor electrónico al final de la columna
que detecta los analitos. Se clasifica en base a la interacción del analito con la fase
estacionaria, en cromatografía de: reparto, adsorción, intercambio iónico, elusión molecular
y quiral.

Es una técnica de alta sensibilidad y selectividad que se utiliza para la detección y

cuantificación automática de una infinidad de analitos, por ello su vasto campo de aplicación.

Los componentes básicos de un cromatógrafo liquido de alta resolución son (Figura 1):
• Reservorio para el disolvente: consiste de una botella de vidrio (que
contiene el disolvente filtrado y desgasificado) tapadas con un tapón
agujerado y atravesado por un tubo de teflón por él cual circula la fase móvil.
• Bomba: es el sistema encargado de impulsar la fase móvil por todo el sistema.
Hay de diferentes tipos isocráticas, binarias y cuaternarias.
• Inyector: Dispositivo donde se introduce la muestra en la corriente de la fase
móvil que fluye desde la bomba.
• Pre-columna: se encuentra a la entrada de la columna y actúa como filtro
para proteger la columna.
• Columna: es donde se llevará a cabo el proceso de separación. Es de acero
inoxidable y contiene en su interior la fase estacionaria. Se pueden analizar
más de 500 muestras con una misma columna.
• Detector: Dispositivo electrónico que detecta la propiedad física o química a
la que responde el analito y que es indicativa de la presencia del mismo.
Genera la señal que es proporcional a la cantidad del analito. Hay detectores
de fluorescencia, UV-Vis, masas, pulsos electroquímicos, índice de
refracción, entre otros.
• Registrador: registra la señal generada por el detector y la presenta por medio
de un cromatograma, el cual es una representación gráfica de la intensidad de
la señal detectada en función del tiempo (Figura 2). El tiempo en que sale cada
analito es el tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la introducción
de la muestra hasta la detección del pico del analito). Por medio del
cromatograma se puede identificar y cuantificar un analito en base al tiempo
de retención y el área de los picos, respectivamente, pero se requiere de la
comparación de la señal con estándares de los analitos.
Figura 1. Componentes básicos del HPLC

Figura 2. Cromatograma
En esta práctica de laboratorio se utilizará la técnica de HPLC para el análisis de
carbohidratos en mieles. La proporción y el tipo de carbohidratos en las mieles es uno de los
indicativos de su adulteración.

La separación de los carbohidratos se puede llevar a cabo mediante una cromatografía de

intercambio de ligandos empleando intercambiadores de cationes fuertes cargados con un
contraión. Dentro de los contraiones utilizados se incluyen hidrógeno, calcio, plomo, zinc y
sodio. La retención se rige por una combinación de exclusión de tamaño y atracción
electrostática entre los átomos electronegativos como el oxígeno en los azucares y los
contraiones electropositivos.

Los carbohidratos también se pueden separar mediante una cromatografía de intercambio

aniónico a pH alto (> 12) con soluciones de hidróxido de sodio o hidróxido de sodio / acetato
de sodio como fase móvil. Se espera que los carbohidratos posean una sola carga negativa
por unidad de sacárido (independientemente del grado de oligomerización) y eluyan en orden
de tamaño creciente y grado de ionización eficaz.

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

• Cromatógrafo líquido, sonicador, vortex, balanza.

• Vaso químico, varilla de vidrio, volumétricos de 100 y 10 mL, viales, jeringas de
3mL, filtros de jeringa de 0,22 y 0.45µm, tubos de centrifuga, micropipeta de 100 µL
y 1000 µL, agua grado HPLC, agua destilada, jeringa de vidrio.
• Curva de calibración de rafinosa, glucosa, fructuosa y arabinosa (1.5, 1.05, 0.75.
0.375 y 0.15 mg/mL)
IV. FASE EXPERIMENTAL

A. Preparación de las muestras las muestras de miel.

1. Homogenizar las muestras de miel y pesar 0,1 g en un vaso de 20 mL.
3. Diluir la muestra pesada en 10 mL de H2O grado HPLC y aforar en un matraz
volumétrico de 100 mL.
3. Filtrar 2 mL de la dilución preparada con un filtro de jeringa 0.22 µm.
4. Colocar el filtrado en un vial HPLC de 1.5 mL y desgasificar por 15 min en un
baño con ultrasonido.

B. Inyección de muestra en el HPLC

1. Lavar la jeringa de vidrio con agua grado HPLC y luego con la muestra tres veces.
2. Cargar 40 µL de la muestra con la jeringa de vidrio en el inyector.

C. Condiciones operacionales del HPLC para análisis de carbohidratos

Flujo: 0.4 mL/ min
Columna: 65° C, Hi-Plex H, 4.6 x 250 mm
Fase móvil filtrada (0.45 µm) y desgasificada: H2SO4 0.00085 M
La detección se realiza mediante un detector de índice de refracción (IR).
Detector IR: 40°C

Figura 3. Equipo de HPLC empleado (Agilent 1260 Infinity)

E. Curvas de calibración
Las curvas de calibración se realizan e inyectan con las muestras. Donde Y es el área, y X la
concentración.
 Report

Data file: Grupo QM 228 2020

Sample name: Miel A y B

Description:
Sample type: Sample
Instrument: HPLC CIBQUIA
Injection date: 10/21/2020 Location: 1
Injection: 1 of 1
Analysis method: Carbohidratos Injection volume: 20um

Operator: MMonrroy Acq. operator: SYSTEM

Ejemplo cromatograma Miel B

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 Report

Percent report based on Area

Name Miel A RT [min] Area Height Amount
[mg/mL]
Glucosa 15.195 106455 6001
Fructosa 16.218 150414 7105 Determinar con la curva

Percent report based on Area

Name Miel B RT [min] Area Height Amount
[mg/mL]
Glucosa 15.195 96710 5490
146388 Determinar con la curva
Fructosa 16.218 6827

Calibration Curves:

Compound: Fructosa

Signal: RID1A

Exp. RT: 16.232

Corr. Coeff.: 0.999886

Formula: y = ax + b

a: 426745

b: 1150

Compound: Glucosa

Signal: RID1A

Exp. RT: 15.208

Corr. Coeff.: 0.999980

Formula: y = ax + b

a: 344880

b: 1184

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