ELECTROFORESIS DE PROTEINAS DEL SUERO HUMANO

EN GEL DE POLIACRILAMIDA BAJO CONDICIONES

DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE)

Esquivel, Julia. 4-805-2067; Martínez, Kathleen. 4-805-77; Ríos, Paúl. 4-

772-2469; Santamaría, Jesús. 4-785-1093; Samudio, Sebastián. 4-805-867
Curso de Bioquímica Humana (QM 300), Escuela de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad
Autónoma de Chiriquí, República de Panamá.
Resumen
En el siguiente laboratorio se hizo una actividad virtual de la electroforesis, que no es más que una
técnica que se utiliza para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo
eléctrico, En el desarrollo del laboratorio se utilizó el simulador de BIOMODEL el cual simula el
proceso de electroforesis de las proteínas en un gel de poliacrilamida con SDS, que a su vez se puede
obtener la gráfica con los resultados y la masa molecular experimental de las muestras a partir de su
movilidad comparada con la de los patrones. En primera instancia se analizó el reconocimiento del
equipo de electroforesis y su modo de empleo, tomando en cuenta las prestaciones, posibles
aplicaciones y guiones de trabajo; en segunda instancia se analizaron las instrucciones detalladas y
la presentación, que incluían velocidad para la animación, la muestra, la concentración de acrilamida,(
que va de 7,5% a 15%), y el voltaje entre otras, que no son más que pasos y parámetros a seguir para
el uso del simulador de electroforesis; y como tercera y última instancia se procedió a realizar las
actividades asignadas en la plataforma, que incluía, la influencia de la diferencia de potencial aplicada,
la influencia de la concentración de acrilamida y la autoevaluación de los resultados de la masa
molecular, mediante estos procesos se logró comparar la masa molecular de algunas proteínas.
Palabras Claves: Hemoglobina, Electroforesis, Proteínas, Moléculas, Gel.
Objetivos en distinta medida a la carga eléctrica de las
• Evaluar el uso correcto del proceso de moléculas y a su masa. (Herráez, 2010).
electroforesis y de qué forma actúa.
• Preparar las soluciones y los geles que Según Harper, 2017, la mayoría de las
se utilizarán en el proceso de biomoléculas poseen una carga eléctrica, cuya
electroforesis. magnitud depende del pH del medio en el que
• Comparar la masa molecular de las se encuentran. Como consecuencia, se
proteínas problema. desplazan cuando se ven sometidas a un
campo eléctrico. Cada molécula se desplaza
Marco Teórico
por efecto del campo, alcanzando rápidamente
La electroforesis es una técnica para la
una velocidad constante al equilibrarse la
separación de moléculas según la movilidad de
fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico)
éstas en un campo eléctrico. La separación
con la resistencia al avance (fuerza de fricción
puede realizarse sobre la superficie hidratada
o rozamiento) impuesta por el medio en el que
de un soporte sólido (electroforesis en papel o
se desplaza. Las proteínas son compuestos
en acetato de celulosa), a través de una matriz
anfotéricos, por lo tanto su carga neta está
porosa (electroforesis en gel), o bien en
determinada por el pH del medio en el que
disolución (electroforesis libre). Dependiendo
están suspendidas. En una solución con un pH
de la técnica que se use, la separación obedece
por encima de su punto isoeléctrico, una
proteína tiene una carga neta negativa y en un
campo eléctrico migra hacia el ánodo, mientras
que migrará hacia el cátodo a pH por debajo de
su punto isoeléctrico. La carga presente en una
proteína es independiente de su tamaño y varía
de una proteína a otra, por lo tanto, la
separación electroforética de proteínas bajo
condiciones no desnaturalizantes se realiza en
virtud de su carga y tamaño. Herráez (2010). En verificamos el resultado de la masa
una electroforesis desnaturalizante, es la que molecular relativa.
somete a las proteínas a migración asegurando
la completa desnaturalización (pérdida de la
estructura tridimensional). En esta situación la
migración es proporcional a la carga y al Resultados y Discusiones
tamaño de la molécula pero no a su forma.
A) Influencia de la diferencia de potencial
aplicada.
1. ¿Cuál es el efecto de aumentar la
Materiales y Métodos
diferencia de potencial eléctrico entre
Materiales:
ambos electrodos?
Para la elaboración del laboratorio utilizamos:
Cámara de electroforesis, fuente de voltaje,
enfriador a 4°C, además utilizamos los
siguientes reactivos y patrones: solución stock
monómero (Solución Stock de Acrilamida al
7.5%-10%-12%-15%); en los patrones
utilizamos: beta-Galactosidasa, ovoalbúmina,
anhidrasa carbónica, triosa-fosfato-isomerasa,
mioglobina, lisozima, Inhibidor de tripsina,
temed, amortiguador reductor para las
muestras : SDS, 2-mercaptoetanol, Glicerol,
Azul de bromofenol, amortiguador pH 6,8, Ilustración 1. Influencia en la diferencia de voltaje aplicada.
fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%),
fijador B (Metanol 50%), sensibilizador
(Tiosulfato de sodio 0,02%), marcador (Nitrato B) Influencia de la concentración de
de plata 0,1%), revelador (Formaldehído acrilamida
0,04%, carbonato de sodio 2%), enjuague 1. ¿Cuál es el efecto de aumentar la
(Ácido acético 5%),agua desionizada. concentración de acrilamida que forma
el gel?

Método General:
Elegimos una velocidad media para la
animación, posteriormente seleccionamos
una muestra, luego elegimos la
concentración de acrilamida en él,
seleccionamos todos los patrones
marcando las casillas que hay junto a sus
nombres, luego, seleccionamos todos los
voltajes, posteriormente pulsamos el botón
de Añadir Patrón para cargar los patrones
Ilustración 2. Influencia de la concentración de acrilamida..
en el primer pocillo,, luego pulsamos el
botón de Añadir Muestra para cargar la
muestra en el segundo pocillo y finalmente 2. ¿Cómo lo interpretas, en términos del
pulsamos los botones para conectar la mecanismo de la separación?
corriente y comenzar la electroforesis, y
para detenerla antes de que las bandas se
salgan por abajo; este procedimiento se
repite para la parte A y B, para la parte C
C. Autoevaluación de los resultados de masa • Problema N°4
molecular.
• Problema N°1

Porcentaje de error: 1.9%

Porcentaje de error: 1.4%

• Problema N°5

• Problema N°2

Porcentaje de error: 2.07%

Porcentaje de error: 2.6%

• Problema N°3 • Problema N°6

Porcentaje de error: 0.4%

Porcentaje de error: 2.6%
• Problema N°7
Porcentaje de error: 1.3%
• Problema N°8
Porcentaje de error: 0.9%
• Problema N°9
Porcentaje de error: 1.2%
• Problema N°10
Porcentaje de error: 1.3%
Tabla de resultado 1.
Ilustración 3. Verificación de la masa molar relativa para
todos los problemas.
Discusión de Resultados
A) Influencia de la Diferencia de
Potencial Aplicada
En la Fase experimental A, procedimos a
calcular la Influencia de la diferencia de
potencial aplicada. Analizando la pregunta;
¿Cuál es el efecto de aumentar la diferencia de
potencial eléctrico entre ambos electrodos?
Como ya sabemos, la electroforesis en gel es
una técnica utilizada para separar fragmentos
de ADN según su tamaño.
Las muestras de ADN se cargan en pozos
(ranuras) en un extremo de un gel y se aplica
una corriente eléctrica para arrastrarlas a través
del gel.
Los fragmentos tienen carga negativa, por lo
que se mueven hacia el electrodo positivo.
Puesto que todos los fragmentos de ADN tienen
la misma cantidad de carga por masa, los
fragmentos pequeños atraviesan el gel más
rápido que los grandes.
Conforme corre el gel, los fragmentos más
cortos de ADN viajarán más rápido a través de
los poros de la matriz del gel que los fragmentos
más grandes. Después de un rato que ha
corrido el gel, los fragmentos más cortos de
ADN estarán más cerca del extremo positivo del
gel y los más largos se mantendrán cerca de los
pozos. Los fragmentos de ADN muy pequeños
podrían correr hasta salirse del gel si lo
dejáramos corriendo por demasiado tiempo. El
voltaje típico para correr un gel de agarosa para
ADN estaría en el intervalo de 808080 - 120. Un
voltaje más alto hará que el gel corra más
rápido, pero también puede derretir el gel si
corre por un largo periodo de tiempo. Un voltaje
más bajo hará que el gel corra más
lentamente (Academy, 2020). Esto lo
comprobamos en la lustración 1 aumentando el
potencial eléctrico en el simulador mientras
observábamos la tendencia de las muestras en
cada aumento eléctrico a adquirir una mayor
velocidad de separación; confirmamos que a
medida que aumentamos el voltaje los
componentes se separan a una mayor
velocidad.
B) Influencia de la Concentración de
Acrilamida
En la fase Experimental B, procedimos a
calcular la Influencia de la concentración de
acrilamida; analizando las siguientes preguntas
¿Cuál es el efecto de aumentar la
concentración de acrilamida que forma el gel?
¿Cómo lo interpretas, en términos del
mecanismo de la separación?
Según salvan (2020) El hidrogel de polímero de
acrilamida es el soporte donde tiene lugar la
separación de proteínas, gracias a la fricción de
las moléculas de proteína con la estructura del
gel, determinar la concentración apropiada para
las moléculas que se van a evaluar por medio
de un gel de poliacrilamida resulta crucial. El
tamaño de los poros de estos geles está
determinada por la concentración final de
acrilamida y biscacrilamida, de los cuales
usualmente hay una proporción 19:1 para la
observación de DNA o RNA desnaturalizado y
una proporción de 29:1 para la mayoría de las
proteínas y geles nativos para DNA y RNA. Si
se regula adecuadamente la relación y
concentración de acrilamida con poliacrilamida
se podrán obtener diferentes porosidades, que
serán menores que la de geles de agarosa.
De acuerdo con Wikipedia (2017) Los geles de
poliacrilamida actúan a modo de tamiz
molecular retardando el movimiento de
macromoléculas grandes mientras que
permiten a moléculas más pequeñas moverse
libremente potenciando de esta forma la
separación. Se forman enlaces cruzados entre
los 2 polímeros de acrilamida, de manera que
se generan geles con tamaño de poro
determinado tanto por la concentración total
(%T) como por la concentración relativa de
acrilamida y de biscacrilamida. El tamaño del
poro puede ser ajustado para optimizar la
separación de la muestra de interés. Así, geles
con un porcentaje alto de acrilamida (10-15%T)
son óptimos para la separación de proteínas de
pequeño tamaño (menores de 50KDa),
mientras que geles de porcentajes menores
(<10%T) son los indicados para la separación
de proteínas mayores. Generalmente la
relación utilizada entre acrilamida y
biscacrilamida es 37,5:1.
C) Autoevaluación de los resultados de
masa molecular.
Según Maldonado A. M. En la SDS-PAGE, la
separación es función del tamaño (masa
molecular), lo que permite determinar el peso
molecular de las proteínas.
La SDS-PAGE se usa, como ilustramos en la
presente práctica, para determinar el peso
molecular de proteínas. Para ello se compara el
Rf de la proteína problema con el de proteínas
de referencia cuyo peso molecular se conoce.
También según Maldonado A. M. el peso
molecular de un polipéptido desconocido se
obtiene mediante la comparación de su
posición después de la electroforesis con las
posiciones de las proteínas desnaturalizadas
estándar. Los pesos moleculares de las
proteínas estándar se han determinado
previamente. Después de que las proteínas se
visualizan por tinción y decoloración, se mide su
distancia de migración. El log10 de los pesos
moleculares de las proteínas estándar se
representa frente su distancia de migración.
Tomando el logaritmo Rf permite que los datos
se representen gráficamente como una línea
recta. El peso molecular de las proteínas
desconocidas se calcula fácilmente a partir de
la curva estándar.
En los resultados de la Tabla de Resultados 1
calculamos la masa relativa de cada proteína
problema, esto se cálculo a partir de la
Anexos
movilidad relativa de la molécula y con ayuda
de la curva estándar. En el caso de la proteína
problema n°1 (Aconitasa) obtuvimos que su
movilidad relativa fue de 0.16, conociendo este
valor buscamos su peso molecular
correspondiente obteniendo 81455 de masa
relativa con un porcentaje de error de 1.4%. En
el caso de la segunda proteína problema
(Concanavalina A) su movilidad relativa fue de
0.54 correspondiendo a 25025 de masa relativa
con un porcentaje de error de 2.07%. Con la
tercera proteína problema (Glucosa-oxidasa) se
obtuvo una movilidad relativa de 0.25 con la
ayudar del grafico vemos que este valor
corresponde a 61370 de masa molar con un
porcentaje de error de 2.6%. Con esto
confirmamos la relación de la movilidad relativa
con la obtención de la masa relativa; En todos
los problemas proteína se obtuvo un porcentaje
de error menor a 3%.
Conclusiones
• Se determinó la separación de
moléculas mediante la técnica de
electroforesis empleada con el simulador
de BIOMODEL.
• Se determinó que la electroforesis es un
método muy analítico, en el que se
separan biomoléculas según su carga y
bajo la acción de un campo eléctrico.
• Se comparó las masas moleculares de
las proteínas mediante el método de
separación con poliacrilamida.
• Se analizó el uso del gel de
poliacrilamida que funciona como filtro
poroso y que actúa principalmente en la
separación de mezclas de biopolímeros
(ADN, proteínas).
• Como consecuencia de lo expuesto el
método de electroforesis se basa en la
migración de solutos iónicos bajo la
influencia de un campo eléctrico; estas
partículas migran hacia el cátodo o
ánodo, dependiendo de su combinación
de cargas, peso molecular y estructura
tridimensional.
1. En electroforesis suelen preferirse los
amortiguadores de baja fuerza iónica,
ya que siendo menos conductores
llevan la producción de calor a un
mínimo, esto es deseable ya que el
calentamiento suele distorsionar las
bandas; sin embargo, la fuerza iónica
no debe ser tan baja que precipiten las
proteínas. ¿Afectará la fuerza iónica del
amortiguador la separación en
condiciones desnaturalizantes y en
condiciones no desnaturalizantes?
La fuerza iónica del sistema tampón debe
mantenerse a un nivel adecuado para
garantizar la solubilidad de la muestra y
suficiente capacidad amortiguadora. Es
usual utilizar concentraciones de tampón
en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero
pueden emplearse concentraciones sobre
0,5 mol/L en sistemas fuertemente ácidos,
pues a bajos valores de pH muchos ácidos
débiles (que son los más empleados) están
débilmente ionizados y es necesaria una
alta concentración para obtener la
adecuada capacidad amortiguadora. En
condiciones no desnaturalizantes afectará
en menor medida la fuerza iónica del
amortiguador debido a que la proteína se
encuentra o se desea que este precipitada,
ya que en esa condiciones
desnaturalizantes, por otro lado en
condiciones no desnaturalizantes las
 proteínas se les somete a una migración
sin desnaturalización, por lo que se
requiere que a lo largo del proceso no se
vea afectada la estructura de la proteína lo
que con lleva a que a utilizar
amortiguadores de baja fuerza iónica ya
que siendo menos conductores llevan la
producción de calor a un mínimo, evitando
la desnaturalización de la proteína.
3. ¿Por qué para asegurar la unión
estequiométricas del SDS a las
proteínas es necesario reducir sus
puentes disulfuro tratándose con 2-
mercaptoetanol?
La muestra se trata con SDS (a mayor
concentración que en la composición del gel),
para provocar la desnaturalización y es
necesario añadir también βmercaptoetanol
para reducir los puentes disulfuro, separando
así las subunidades de la proteína y
permitiendo que se extiendan por efecto del
SDS.
4. Discuta la influencia del pH del gel de
apiñamiento sobre la calidad de las
bandas. El voltaje sobre el tiempo de
corrido y la generación de calor.
Si hay una variación del pH (aumenta o
disminuye) al mismo tiempo que el tiempo de
corrida del voltaje esto tiende a desnaturalizar
la proteína, es decir, que el proceso de
electroforesis se debe mantener a un pH
neutro donde la proteína no se desnaturalice
respectivamente.
4. La cuantificación de las bandas suele
realizarse densitométricamente. ¿En qué
consiste el método?
Es un método en el cual se determina el factor
de retardo de las muestras en estudio y el
peso molecular. Se utiliza peso moleculares
conocidos de patrones y se realiza curvas
patrones de los diferentes patrones y se
determina la concentración de las muestras.
Referencias Bibliográficas
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De Electroforesis. [online] (5 de
octubre del 2020). Obtenido de:
http://biomodel.uah.es/lab/SDS-
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Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Universitario de Rabanales.
(5 de octubre del 2020). Obtenido de:
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• Khan Academy (2020). Electroforesis
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2020). Obtenido de:
https://es.khanacademy.org/science/
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• Menor Salvan. (2 de febrero de
2019). La técnica de la electroforesis
en gel de poliacrilamida. 2020, (5 de
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http://www3.uah.es/chemevol/index.
php/sds-page-electroforesis-en-gel-
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• Anónimo. (7 de agosto de 2017).
Electroforesis en gel. 2020, de
Wikipedia (5 de octubre del 2020).
Obtenido de:
https://es.m.wikipedia.org/wiki/Usuari
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