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1. Cal es la funcion de TEMED y APS?

APS (Persulfato amnico) S2O8 (NH4)2


Es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscpico, es
decir, suele hidratarse con facilidad. Por lo tanto, deber realizarse un
control peridico del frasco que lo contiene a fin de evitar la humedad en
su interior y consecuentemente la prdida de sus propiedades qumicas
durante el proceso de polimerizacin.
Funcin: es un iniciador para la polimerizacin de la acrilamida. El
persulfato amnico en disolucin se disocia formando dos iones sulfato
con un radical libre, que activa la acrilamida inducindola a romper el
doble enlace (C=C) para convertirse tambin en un radical libre, que al
encontrarse en otra molcula se une a ella formando un polmero lineal
de acrilamida, al encontrarse tambin en disolucin molculas de
bisacrilamida, tambin entran en el juego, pero doblemente, ya que
pueden integrar dos cadenas de acrilamida.

TEMED (Tetrametilen- diamina ) (CH3)2CHNHCH (CH3)2

Es el catalizador de la reaccin, de modo que la polimerizacin tendra


lugar sin su presencia, pero sera extremadamente lento. Hay que tener
en cuenta que el O2 inhibe la polimerizacin de la acrilamida.
Cules son las fuentes de error en una electroforesis?
La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por
muchos errores experimentales, as como:
Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel: La
movilidad de las protenas vara entre otras causas porque la
viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas. Este efecto
puede atenuarse con el empleo de un tampn ms diluido o
manteniendo temperaturas bajas durante el desarrollo de la
electroforesis. La uniformidad de la temperatura a travs del gel
mientras ocurre la corrida electrofortica generalmente elimina el
efecto de la deformacin de las bandas en forma de sonrisa.
Velocidad de la polimerizacin: Una polimerizacin muy rpida
puede deformar las bandas, porque ocurre una contraccin no
uniforme del gel.
Pureza de los reactivos: El empleo de reactivos de alta calidad y
agua desionizada es un prerrequisito para hacer geles
reproducibles y de alta resolucin.
Tiempo de corrida: La determinacin del tiempo adecuado de
corrida es muy importante, pues corridas muy cortas impiden que

las muestras avancen el espacio necesario para su correcta


separacin, pero tambin se ha probado que tiempos de corrida
cortos minimizan la dispersin de la muestra y el ensanchamiento
de la banda.
Preparacin de las muestras: En el caso de la SDS-PAGE es
necesario lograr una completa desnaturalizacin de las protenas,
para evitar la aparicin de bandas fantasmas en la electroforesis.
Carga de muestras incorrectas: Aunque parece bastante simple,
cargar tus muestras en los pocillos pequeos en el gel puede
resultar difcil. Lo ms importante es asegurarte de que sabes
cunto vas a poner en cada pocillo. El exceso de la muestra podra
causar que sean manchas grandes o que aparezcan ms pequeas
de lo que realmente son; a su vez, muy poco de la muestra puede
ser imposible de ver. Adems, no perfores el gel al cargar las
muestras, ya que esto puede causar problemas, al igual que las
otras imperfecciones de gel.
Qu otros buffer de carga que se pueden utilizar en
electroforesis?
Estos protocolos describen el modo de preparacin de buffers de carga
para electroforesis en agarosa y poliacrilamida. El producto de PCR o el
cido nucleico generalmente se mezcla con buffer de carga 6x. Los
buffers de carga facilitan la visualizacin y sedimentacin del producto
de PCR o de cidos nucleicos en los pozos para lo cual emplean distintos
tipos de colorantes, cada uno de ellos exhibe un patrn de migracin
diferente.
Preparacin de buffer de Xylene Cyanol 6x (Migracin nominal
4kbp)
-

25 mg de Xylene Cyanol
3 mL de glicerol o 1.5 grs de Ficoll-4 o 4 grs de Sacarosa
Aforar a 10 mL de H2Od.

Preparacin de buffer de Azul de Bromofenol 6x (Migracin


nominal 300bp)
-

25 mg de Azul de Bromofenol
3 mL de glicerol o 1.5 g de Ficoll-400 o 4 g de sacarosa
Aforar a 10 mL de H2Od

Preparacin de buffer de Naranaja G 6x (Migracin nominal 50


bp)
-

Mezclar 18 mL de glicerol grado ACS con 40 mL de H2Od

Agregar 60 mg de Naranja G y aforar a 50 mL


Homogeneizar la mezcla con vortex

Preparacin de buffer Mixto 6x (Azul de Bromofenol y Xylene


Cyanol)
-

25 mg de Azul de Bromofenol
25 mg de Xylene Cyanol
3 mL de glicerol o 1.5 g de Ficoll-400 o 4 g de dacarosa
Aforar a 10 mL de H2Od