UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS 102

CARRERA: BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: BIOQUÍMICA APLICADA
LABORATORIO PRESENCIAL N°1
CONVERSIÓN DE GRASA EN SACAROSA: GERMINACIÓN Y DETERMINACIÓN DE ISOCITRATO LIASA

A. OBJETIVOS
a) Estudiar el ciclo del gliosilato en semillas germinadas y no germinadas
b) Determinar la actividad de la isocitrato liasa

B. FUNDAMENTO TEÓRICO
Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia
de piruvato, ocurre una modificación especial del ciclo TCA conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas
circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (vías anapleróticas) ya
que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El
oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que
se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario
normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato. En la segunda reacción el acetil-CoA se condensa
con el glioxilato para formar malato, éste pasa a citosol, donde origina oxalacetato, que puede ser transformado
en glucosa por la gluconeogénesis. Así, el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite
el funcionamiento normal del ciclo TCA. El ciclo de glioxilato de esta forma permite la conversión de acetil-CoA y,
por tanto, de ácidos grasos, la glucosa.

A pesar de que la grasa es una forma común de almacenamiento de energía, en los vertebrados como los
humanos, los ácidos grasos, no pueden ser transformados en glucosa por gluconeogénesis, ya que estos
organismos no pueden convertir el acetil-CoA en piruvato. Como resultado, tras un tiempo de inanición, los
vertebrados necesitan producir cuerpos cetónicos a partir de los ácidos grasos para reemplazar la glucosa en
tejidos como el cerebro, que no puede metabolizar ácidos grasos. En otros organismos como las plantas y las
bacterias, este problema metabólico es solucionado utilizando el ciclo del glioxilato.
a) Metabolismo glucídico en la célula vegetal
1. Ciclo del Glioxilato

El Ciclo del Glioxilato es una forma modificada del Ciclo de Krebs que tiene lugar en la mayoría
de las plantas, hongos y microorganismos, pero no ocurre en animales superiores ya que carecen
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de las dos enzimas clave del proceso. Este ciclo les permite utilizar los ácidos grasos o el acetato
(en forma de Acetil-CoA) como fuente de carbono para la síntesis de Glucosa. Tiene lugar en los
glioxisomas, que no están presentes en los tejidos vegetales de forma permanente. Son
especialmente abundantes durante la germinación de las semillas oleaginosas, las cuales tienen
poca capacidad fotosintética para producir los hidratos de carbono que necesitan para crecer.
El acetato proveniente de la degradación de los ácidos grasos funciona como combustible rico
en energía y como una fuente de fosfoenolpiruvato para la síntesis de glucosa a través de la
gluconeogénesis. El proceso se da como sigue:
1- La ruta del glioxilato, de forma similar a la del ciclo de Krebs, comienza con la condensación
de una molécula de acetil-CoA con otra de oxalacetato para rendir citrato, reacción catalizada por
la enzima citrato sintasa.
2- La enzima aconitasa convierte este citrato en isocitrato
3- El Isocitrato (C6) es escindido por la enzima Isocitrato Liasa para rendir Succinato (C4) y
Glioxilato (C2).
4- Posteriormente, el Glioxilato se condensa con una molécula de Acetil-CoA gracias a la enzima
Malato Sintasa para formar Malato.
El Malato podrá ser oxidado a Oxalacetato de la misma manera que ocurre durante el ciclo de
Krebs y así poder continuar con el Ciclo. El oxalacetato entra a la ruta gluconeogénica para la
producción de glucosa gracias a su conversión en fosfoenolpiruvato, que es catalizada por la
enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa.

2. Gluconeogénesis
Muchas plantas almacenan lípidos y proteínas en sus semillas para utilizarlos como fuente de
energía y como precursores biosintéticos durante la germinación, antes de que se hayan
desarrollado los mecanismos fotosintéticos. En las semillas en germinación tiene lugar una
gluconeogénesis activa que proporciona la glucosa para la síntesis de sacarosa, polisacáridos y
muchos metabolitos procedentes de hexosas. en las plántulas que están emergiendo de las
semillas la sacarosa proporciona gran parte de la energía química necesaria para el crecimiento
inicial.
las células animales pueden realizar la gluconeogénesis a partir de precursores de tres y cuatro
carbonos, pero no de los dos carbonos acetílicos del acetil-CoA. Debido a que la reacción de la
piruvato deshidrogenasa es efectivamente irreversible, las células animales no tienen forma de
convertir el acetil-CoA en piruvato u oxalacetato. A diferencia de los animales, las plantas y
algunos microorganismos pueden convertir el acetil-CoA formado durante la oxidación de los
ácidos grasos en glucosa. Algunos de los enzimas esenciales para esta conversión se encuentra
en los glioxisomas, en donde los isozimas de la B-oxidación específicos del glioxisoma degradan
los ácidos grasos a acetil-CoA. La separación física de los enzimas de este ciclo del glioxilato y
los de la B-oxidación con las enzimas del ciclo del ácido cítrico mitocondrial impide la oxidación
posterior del acetil-CoA a CO2. En su lugar el acetil-CoA se convierte en succinato en el ciclo del
glioxilato. El succinato pasa a la matriz mitocondrial en donde se convierte en oxalacetato que
sale al citosol. Como ya se dijo, el oxalacetato se convierte por gluconeogénesis en fructosa 6-
fosfato, que es el precursor de la sacarosa. Debido a que sólo tres de los cuatro carbonos de
cada molécula de oxalacetato se convierten en hexosa en el citosol, alrededor del 75% el carbono
de los ácidos grasos almacenados como lípidos de las semillas se convierten en glúcidos. El 25%
restante se pierde en forma de CO2 en la conversión de oxalacetato a fosfoenolpiruvato. por otro
lado, la hidrólisis d elos triglicéridos de reserva también produce glicerol 3-fosfato, que puede
entrar en la ruta gluconeogénica después de su oxidación a dihidroxiacetona fosfato.
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3. Pools metabólicos
Las rutas metabólicas de las plantas están interconectadas de modo que existen reservas (pools)
de intermediarios metabólicos. Uno de estos fondos de metabolitos incluye las hexosas fosfato:
glucosa 1-fosfato, glucosa 6-fosfato y fructosa 6-fosfato; un segundo fondo incluye los 5-fosfato
de las pentosas ribosa, ribulosa y xilulosa; un tercero incluye las triosas fosfato: dihidroxiacetona
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fosfato y gliceraldehído 3-fosfato. El flujo de metabolitos a través de estos fondos cambia en
magnitud y dirección como respuesta a cambios en las circunstancias de la planta, variando
también según el tipo de tejido. Los transportadores de la membrana de cada orgánulo
transportan compuestos específicos hacia adentro y hacia afuera, y la regulación de estos
transportadores probablemente influye en el grado con el que se mezclan estos fondos.
Durante las horas diurnas, las triosas fosfato producidas en el tejido de las hojas por el ciclo de
Calvin salen del cloroplasto y van a la reserva o fondo de hexosas fosfato citosólicas, donde se
convierten en sacarosa para su transporte a tejidos no fotosintéticos. En estos tejidos la sacarosa
se convierte en almidón para su almacenamiento o se utiliza como fuente de energía a través de
la glucólisis. En las plantas en crecimiento, las hexosas fosfato también son retiradas del fondo
para ser utilizadas en la síntesis de paredes celulares. Durante la noche, el almidón se metaboliza
a través de la glucólisis para proporcionar energía, esencialmente de la misma manera que en
los organismos no fotosintéticos, y se obtienen NADPH y ribosa 5-fosfato a través de la ruta
oxidativa de las pentosas fosfato.

C. METODOLOGÍA
a) Germinación de las semillas en casa
1. Materiales
(1) Semillas de ajonjolí/sésamo (12 gramos, que equivalen a 2 cucharadas aproximadamente)

(2) Cucharilla de plástico para gelatina

(3) 4 servilletas de papel

(4) Pinzas
(5) 4 frascos de boca ancha ó 4 vasos cilíndricos de boca ancha
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(6) Lavandina (Hipoclorito de sodio)

(7) Cernidor
(8) Agua hervida enfriada
(9) Bandeja de plástico

(10)Gasa ancha para cubrir las bocas de los frascos/vasos cilíndricos

(11) 4 ligas

2. Procedimiento
(1) Con las pinzas, descartar las semillas más pequeñas y oscuras
(2) Medir cuatro cucharillas de semillas
(3) Colocar cada una de las 4 cucharillas de semillas en 4 servilletas
(4) Identificar la concentración de hipoclorito de sodio en la lavandina
(5) Preparar 250 mL (un vaso) de hipoclorito de sodio al 1% usando lavandina
(6) Lavar cada una de los 4 medidas de semillas con 50mL de hipoclorito de sodio al 1%

(7) Una vez que las semillas estén de color blanco, cernir las semillas
(8) Lavar las semillas con agua hervida enfriada
(9) Distribuir las cuatro medidas de semillas en cada uno de los frascos o vasos
(10)Tapar con 2 capas de gasa sosteniéndolas con una liga
(11)Guardar dos lotes de semillas
(12)Verter un poco de agua en la bandeja
(13)Colocar los dos lotes de semillas restantes boca abajo sobre la bandeja
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(14)Mantener en un lugar oscuro por 10 días

b) Preparación de los extractos y determinación de la enzima isocitrato liasa

1. Material biológico por parejas
(1) Semillas germinadas
(2) Semillas no germinadas
2. Material de laboratorio por parejas
(1) 2 morteros
(2) 1 pipeta de 10mL
(3) Vidrio de reloj
(4) Tubos de centrífuga
(5) 1 pipeta de 2mL
(6) 2 pipetas de 1mL
(7) Propipeta
(8) 1 micropipeta con capacidad de 200-1000uL
3. Material a traer por parejas
(1) Hielo
4. Reactivos químicos
(1) Solución amortiguadora de fosfato pH 7,5
(2) Cloruro de magnesio 3mM en solución amortiguadora de fosfato
(3) Mercaptoetanol 0,125M en solución amortiguadora de fosfato
(4) Isocitrato de sodio 0,16M (si la mezcla es racémica) en solución amortiguadora de fosfatos
(5) Ácido tricloroacético 10%
(6) Mezcla ácido oxálico 10mM y fenilhidrazina 1% fresca en proporción 5:1
(7) Ferricianuro de potasio 5% fresco
(8) Ácido clorhídrico concentrado
5. Procedimiento
(1) Preparación de extractos
(a) Homogenizar en un mortero a baja temperatura (sumergido en hielo) un lote de semillas
germinadas y por separado un de semillas sin germinar; cada lote con 10mL de cloruro de
magnesio 3mM en solución amortiguadora de fosfato
(b) Centrifugar a 1500rpm durante 15 minutos. Si es necesario, centrifugar de nuevo
(c) Guardar los extractos en frío mientras se utilizan
(2) Determinación de isocitrato liasa
1 2 3 4
Tubos Semillas sin Semillas
Blanco Blanco
germinar germinadas
Cloruro de magnesio 3mM en
solución amortiguadora de 1,5 1,5 1,5 1,5
fosfato (mL)
Mercaptoetanol (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2
Ext. Enzimas 0,1 0,1 0,1 0,1
(a) Preincubar a 30°C por cinco minutos
Isocitrato (mL 0,2 - 0,2 -
(b) Incubar a 30°C por 30 minutos
ATA 10% (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2
Isocitrato mL) - 0,2 - 0,2
Mezcla ácido
oxálico:fenilhidrazina (mL) 6 6 6 6
(c) Calentar a hervir
(d) Enfriar en hielo
HCl (c) (mL) 4 4 4 4
Ferricianuro de potasio (mL) 1 1 1 1
(e) Mezclar bien y leer exactamente 7 minutos después de haber agregado el ferricianuro, a
520nm cada tubo problema contra su blanco
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D. RESULTADOS
a) Germinación de semillas en casa
1. ¿Cuál es la función del hipoclorito de sodio?
2. ¿Por qué se tuvo a las semillas en oscuridad?
3. ¿Cuál es la composición de las semillas de ajonjolí/sésamo?
b) Preparación de los extractos y determinación de la enzima isocitrato liasa
1. Preparación de extractos
(1) ¿Por qué la molienda de semillas debe realizarse a bajas temperaturas?
(2) ¿Cuál es la composición en cada una de las fases obtenidas tras la centrifugación?
2. Determinación de la isocitrato liasa
(1) ¿Cuál es la función de cada uno de los siguientes reactivos: Cloruro de magnesio 3mM en
solución amortiguadora de fosfatos y mercaptoetanol?
(2) ¿Por qué se realiza la preincubación a 30°C?
(3) ¿Para qué se añade el isocitrato?
(4) ¿Qué ocurre durante los 30 minutos de incubación a 30°C?
(5) ¿Cuál es la función de cada uno de los siguientes reactivos: ATA, isocitrato y mezcla ácido
oxálico:fenilhidracina?
(6) ¿Por qué se calienta a hervir y luego se enfría?
(7) ¿Cuál es la función de cada uno de los siguientes reactivos: ácido clorhídrico y ferricianuro de
potasio?
(8) ¿Por qué la lectura en el espectrofotómetro se realiza a los 7 minutos de añadido el ferricianuro
de potasio?
(9) Registrar la absorbancia de cada extracto en una tabla
(10)Reportar para cada lote de semillas (germinadas y sin germinar) los micromoles de glioxalato
producidos en 30 minutos de incubación
(𝐴𝑏𝑠520 − 0,05)
𝐺𝑙𝑖𝑜𝑥𝑎𝑙𝑎𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 =
(1,15)

𝑆𝑖 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑠 𝑑𝑒 0,1𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑙𝑡𝑖𝑝𝑙𝑖𝑐𝑎𝑟 𝑝𝑜𝑟 10

(11)Calcular las unidades internacionales de isocitrato liasa/mL de extracto

(12)Compare los datos obtenidos para cada una de las condiciones experimentales, indicando que
era lo esperado de acuerdo con lo reportado en la literatura
(13)De no obtenerse los resultados esperados justifique los motivos por los cuales el experimento
pudo haber fallado

E. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
a) ¿Cuál es la función del ciclo del glioxilato en las bacterias?
b) Investigue el protocolo para estudiar el ciclo del glioxilato en bacterias
Alemani & Font, 1983; Bohinski, 1991; Clark, 1966; Nelson & Cox, 2009; Stryer et al., 2003)
F. BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA
a) Alemani, M., & Font, S. (1983). Prácticas de Bioquímica (Alhambra (ed.); 1st ed.).
b) Bohinski, R. (1991). Bioquímica (Addison-Wesley (ed.); 5th ed.). Iberoamericana.
c) Clark, J. (1966). Bioquímica Experimental (Acribia (ed.); 1st ed.).
d) Nelson, D., & Cox, M. (2009). Principios de Bioquímica: Lehninger (5th ed.). OMEGA.
e) Stryer, L., Berg, J., & Tymoczko, J. (2003). Bioquímica (Reverté (ed.); 5th ed.).