Optimización de la producción de goma de xantano por Xanthomonas campestris cultivado en melaza

RESUMEN
Producción de goma xantana por Xanthomonas campestrisSe estudió ATCC 1395 utilizando melaza de
remolacha azucarera como fuente de carbono. Se investigó el pretratamiento de la melaza de remolacha
azucarera y la suplementación del medio para mejorar la producción de goma de xantano. Adición de K2HPO4
para el medio tuvo un efecto positivo significativo tanto en la goma de xantano como en la producción de
biomasa. El medio se optimizó posteriormente con respecto a la melaza, K2HPO4concentración y pH inicial. La
producción máxima de goma xantana (53 g / l) se observó después de 24 ha 175 g / l de melaza, 4 g / l K 2HPO4y
a pH inicial neutro. Los resultados indican que K2HPO4 sirve como agente tamponador y como nutriente para el
crecimiento de X. campestris. La melaza de remolacha azucarera parece ser un sustrato industrial adecuado para
las fermentaciones de goma xantana.
INTRODUCCIÓN
La goma de xantano, el exopolisacárido de Xanthomonas campestris pv campestris, es uno de los principales
biopolímeros comerciales producidos con una producción mundial anual de 30 000 toneladas, que corresponde
a un mercado de $ 408 millones. Debido a su estructura única, el xantano muestra propiedades pseudoplásticas
especiales, alta viscosidad y solubilidad, mayor estabilidad en una amplia gama de valores de pH y
temperaturas, así como compatibilidad con muchas sales, ingredientes alimentarios y otros polisacáridos
utilizados como agentes espesantes. Estas características contribuyen al empleo de xantano en una amplia gama
de aplicaciones, especialmente en la industria alimentaria como agente espesante y estabilizador, en cosméticos,
en la industria papelera, textil y en el sector farmacéutico y también en la recuperación mejorada de petróleo. La
producción, recuperación y propiedades de la goma xantana se ha revisado recientemente.
La melaza es un coproducto de la producción de azúcar, tanto de la remolacha azucarera como de la caña de
azúcar, y se define como el jarabe de escorrentía de la etapa final de cristalización, a partir de la cual se
cristaliza El azúcar no es económico. A pesar de sus similitudes, la melaza de remolacha y caña exhiben
diferencias significativas con respecto a los compuestos nitrogenados, azúcares fermentables, cenizas y
contenido de vitaminas. La melaza de remolacha azucarera, por lo tanto, es una solución de azúcar, materia
orgánica e inorgánica en agua con una sustancia seca del 74/77% (p / p). Los azúcares totales (principalmente
sacarosa) constituyen aproximadamente 47/48% (p / p) de melaza, cenizas 9/14% (p / p) y compuestos que
contienen nitrógeno total (principalmente betaína y ácido glutámico) 8/12% (w / w). Las variaciones en la
composición ocurren entre años y plantas azucareras. La melaza de remolacha azucarera se usa ampliamente
como sustrato en las fermentaciones, ya que constituye una fuente valiosa de sustancias de crecimiento como el
ácido pantoténico, inositol, oligoelementos y, en menor medida, biotina. Sin embargo, la aparición de pirazinas
nitrogenadas volátiles no deseadas, se han descrito pirrol, así como furanos y fenoles. También se detectaron
otros contaminantes como metales pesados, biocidas y ácidos orgánicos, pero la mayoría de ellos a niveles de
concentración inferiores a los necesarios para afectar la inhibición del proceso. Sin embargo, en procesos con
melaza como sustrato único o cuando se usa en grandes cantidades como co-sustrato, los inhibidores específicos
se eliminan parcialmente en el pretratamiento.
Hasta donde sabemos, la melaza de remolacha azucarera solo se ha utilizado en un estudio anterior para
producir xantano, en el que se seleccionaron varios sustratos industriales para la producción de goma de
xantano. En el presente estudio, se realizó la optimización de la producción de goma xantana a partir de melaza
de remolacha azucarera en términos de composición media y pretratamiento de melaza. La melaza de remolacha
azucarera demostró ser un excelente sustrato, ya que en condiciones optimizadas se mejoró la producción de
goma de xantano y la formación de biomasa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismo y condiciones de crecimiento
X. campestris ATCC 1395, una cepa de tipo salvaje, se utilizó a lo largo de este estudio. La cepa se adaptó a
altas concentraciones de melaza como se describe a continuación y se mantuvo en cultivos sumergidos en caldo
LB100S (en g / l: extracto de levadura 5, triptona 10, NaCl 10, sacarosa 100) almacenada a / 73 ° C. Para los
dos primeros pasos de adaptación, X. campestris se cultivó durante la noche en una incubadora de agitación
orbital (250 rpm) a 30 ° C en medio LB que contiene 25 y 100 g de sacarosa, respectivamente, mientras que
para los siguientes tres pases se cultivó en las mismas condiciones en 200 g / l de melaza de remolacha
azucarera. En cada pase se midieron la biomasa y la goma de xantano y se obtuvieron los mejores resultados en
el quinto paso anterior (20.0 y 40.5 g / l, respectivamente).

Inóculo
Se inocularon los sesgos consistentes en LB25S (sacarosa 25 g / l) del cultivo almacenado sumergido por medio
de rayas. Los sesgos se incubaron a 289/1 8C durante 36/40 h y se usaron para inocular 20 ml de LB25S en
matraces Erlenmeyer de 100 ml. La absorbancia inicial a 600 nm (A600) del medio se ajustó a
aproximadamente 0,1 y los matraces se incubaron en una incubadora de agitación giratoria (289/1 8C, 200 rpm)
durante 7 h hasta que su A600 alcanzó aproximadamente 1,4. Se usaron alícuotas de 10 ml para iniciar cultivos
de 100 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían una concentración final de melaza de remolacha
azucarera de 105 g / ly se cultivaron en condiciones idénticas durante 17 h. Los cultivos de producción de goma
de xantano fueron posteriormente con un 5% (v / v) de inóculo del último cultivo.
Fermentaciones
Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio que contenía
melaza de remolacha azucarera en las mismas condiciones que los cultivos previos durante 3 días. Los cultivos
se cultivaron por duplicado y se añadieron aditivos estériles en condiciones asépticas después de la
esterilización en autoclave. Se extrajeron alícuotas de aproximadamente 12 ml de forma aséptica de los cultivos
cada 24 h.
 Melaza y resinas
La melaza de remolacha azucarera fue suministrada por la Platy Sugar Plant de Hellenic Sugar Industry S.A.
Las resinas de grado industrial utilizadas para el pretratamiento de la melaza fueron ofrecidas por Rohm & Haas
S.A.
Estimación de la goma de xantano
La goma de xantano se analizó según se informó anteriormente con la diferencia de que la solución de cloruro
de potasio se suplementó con EDTA para lograr una concentración final de EDTA de 4 mM. Se tuvieron en
cuenta los precipitados derivados de medios no inoculados y los valores se corrigieron en consecuencia. Todos
los ensayos se realizaron por duplicado y las medias se basaron en los valores derivados de los cultivos
duplicados.
Peso molecular y contenido de piruvato de xantano
El peso molecular se determinó de acuerdo con Papagianni et al. (2001) [8]. El contenido de piruvato se
determinó por HPLC después de la hidrólisis con HCl a 80 ° C y la extracción con acetato de etilo como se
informó anteriormente.
Diseño experimental y análisis estadístico.
El diseño experimental de Plackett / Burman se utilizó para evaluar la importancia relativa de varios nutrientes
para la producción de goma de xantano basada en el modelo de primer orden:

sin interacción entre los factores utilizados. Se analizaron cinco variables en ocho experimentos con dos
variables ficticias, cada una de las cuales es un componente medio.
Los coeficientes de regresión y los valores t se calcularon mediante un análisis compatible de los datos
obtenidos de los cultivos duplicados en la producción de goma xantana y biomasa utilizando el software de
cálculo MINITAB.
RESULTADOS
Adaptación al crecimiento de X. campestris en melaza
Con el fin de lograr un crecimiento rápido y, con ello, una mayor eficiencia, el organismo se adaptó a entornos
de melaza alta mediante subcultivos consecutivos. El cultivo puro resultante poseía características mejoradas en
términos de crecimiento y producción de goma de xantano.
Modificación del ensayo de goma xantana
Durante la precipitación de biomasa cuando la melaza se usó como sustrato, se observó que parte de xantano
coprecipitaba con biomasa, incluso cuando las muestras se diluían a un factor de dilución de hasta 10. Por lo
tanto, el método se modificó como se describe en la Sección 2 en para evitar la coprecipitación observada de
goma xantana con biomasa durante la centrifugación. La concentración óptima de EDTA para la solubilidad de
la goma de xantano sin afectar la biomasa se determinó comparando la centrifugación y los precipitados de
etanol a concentraciones crecientes de EDTA. A concentraciones de EDTA de hasta 4 mM, el precipitado de
centrifugación disminuyó bruscamente mientras que el precipitado de etanol mostró un aumento igual (Fig. 1).
A concentraciones más altas de hasta 10 mM, tanto la centrifugación como los precipitados de etanol
permanecieron sin cambios.
Por lo tanto, a una concentración de EDTA de 4 mM, la recuperación de la goma de xantano se consideró
máxima y esta concentración se usó para la posterior separación de la biomasa y la goma de xantano.
Pretratamiento de melaza
Se emplearon varios reactivos y tratamientos para el pretratamiento de la melaza con el objetivo de eliminar
factores inhibidores del crecimiento como metales pesados, ácidos orgánicos volátiles y alcoholes con seis o
siete átomos de carbono. Los pretratamientos utilizados, sus respectivos modos de acción y la mayor
producción de goma de xantano obtenida de cada cultivo se enumeran en la Tabla 1, donde se muestra que
ninguno de estos pretratamientos tuvo un efecto positivo ni en la goma de xantano ni en la producción de
biomasa.

Selección de aditivos.
Se identificó un conjunto inicial de cinco componentes de medios que podrían afectar la producción de goma
xantana y biomasa. La disposición de los niveles de factor, de acuerdo con el plan experimental Plackett /
Burman, se proporciona en la Tabla 2. Los datos sobre la producción de goma xantana y biomasa a las 24 h de
fermentación mostraron una amplia variación de 11.9 a 47.5 g / l para la goma xantana y de 12.6 a 31.7 para
producción de biomasa. A partir de las respuestas (producción de goma xantana y biomasa) de los ocho
experimentos informados en la Tabla 2, se calculó el efecto de cada una de las cinco variables y se indicó
claramente que la adición de K2HPO4 tuvo un efecto positivo en la producción de goma de xantana y biomasa.
Además, los cultivos con una concentración de melaza de 210 g / l mostraron una mayor producción de biomasa
y goma de xantano que aquellos a una concentración de 140 g / l. Todos los demás factores tuvieron un efecto
ligeramente negativo en los tres valores medidos.
La prueba t para cualquier efecto individual permite una evaluación de una probabilidad, P, que mostró que el
nivel de confianza del cálculo de los efectos de K2HPO4 y la melaza fue superior al 95%.
Determinación de la concentración óptima de melaza
La producción de goma xantana y biomasa de cultivos con concentraciones crecientes de melaza que van de
105 a 245 g / l se muestran en las Fig. 2a yb, respectivamente. Se obtuvo una producción máxima de goma de
xantano de 55 g / l a una concentración de melaza de 210 g / l después de 48 h de incubación. El efecto de la
concentración de melaza en la producción de biomasa no fue tan profundo como el de la producción de xantano
(Fig. 2a). La biomasa máxima se obtuvo por los cultivos con una concentración de melaza superior a 175 g / l,
mientras que la biomasa fue más baja después de 72 h de incubación en todos los cultivos, lo que indica la lisis
de las células.
La determinación del peso molecular (MW) de la goma de xantano producida en las condiciones experimentales
anteriores mostró que oscilaba entre 0,8 y 1,4 / 106 Da. Se obtuvo un máximo de goma de xantano con el
crecimiento en una concentración de melaza de 105 g / l. Se observó una disminución en el MW de xantano al
aumentar la concentración de melaza (Fig. 3).
Determinación de la concentración óptima de K2HPO4
X. campestris se cultivó en cultivos que contenían la concentración óptima de melaza (175 g / l) y
concentraciones crecientes de K2HPO4 que oscilaban entre 0 y 10 g / l. Fig. 4 muestra que la producción
máxima de goma de xantano se obtuvo a 4 g / l de concentración de K2HPO4 después de 24 h, mientras que fue
menor después de 72 h en todos los cultivos que contenían más de 4 g / l de K2HPO4. La producción máxima
de biomasa se obtuvo a la misma concentración de K2HPO4 también después de 24 h. La concentración óptima
determinada experimentalmente es comparable con la concentración óptima de fosfato de 6 g / l observada en
un estudio previo.
Para investigar si K2HPO4 mejoró la productividad ya que los iones fosfato actuaban como un agente
tamponador o porque se proporcionaron los fosfatos esenciales para el crecimiento del microorganismo y
también si los iones potasio desempeñaron un papel importante, los cultivos que contenían concentraciones
equimolares de K2HPO4 (4 g / l, aproximadamente 23 mM), se compararon Na2HPO4 y Tris / tampón, pH 7,0
con respecto a la producción de biomasa y goma de xantano (Fig. 5). Los cultivos con Na2HPO4 añadido
exhibieron una producción idéntica a los que tenían K2HPO4 y superiores a los que contenían Tris / tampón.
Sin embargo, los cultivos que contenían Tris / tampón exhibieron una mayor producción de biomasa y goma de
xantano que los que no tenían aditivos. La presencia de concentraciones de K2HPO4 y KH2PO4 no tuvo un
efecto significativo sobre el MW promedio del xantano producido que permaneció en el orden de 1.1 /1.3 / 106
Da. Con respecto a los valores iniciales de pH, se encontró que la goma de xantano con un MW máximo se
obtuvo a un valor de aproximadamente 6.0 (datos obtenidos, pero no mostrados). Aunque los pretratamientos de
melaza no mejoraron la producción de goma de xantano, el MW fue mayor en todos los casos (/1.4 / 106 Da).
El contenido de piruvato se estimó en el orden de 1.2 /2.3%.
Determinación del pH inicial óptimo
El efecto del pH inicial se estudió en cultivos X. campestris con un pH inicial que oscila entre 5,1 y 7,7 (Fig. 6).
La adición de sales de fosfato a las soluciones de melaza esterilizadas afectó en gran medida sus valores de pH
como soluciones tampón de una concentración significativa
fueron creados (23 mM). Esta propiedad particular de los iones fosfato fue explotada para lograr una molaridad
de fosfato equivalente, pero valores de pH iniciales diferentes. En todos los cultivos con un pH inicial superior a
5,9, la producción de biomasa fue superior a 30 g / l después de 24 h (Fig. 6b), mientras que la fluctuación del
pH mostró un patrón similar en todos los cultivos. Después de 20 h, el pH de los cultivos disminuyó a
aproximadamente 6,0, mientras que después de 48 y 72 h aumentó a aproximadamente 7,0 (Fig. 6c). La
producción máxima de goma de xantano se obtuvo después de 24 h de los cultivos con un pH inicial de 6.6
(Fig. 6a).
Comparación de medios
La figura 7 proporciona una comparación entre el LB y la melaza utilizada como medio de fermentación e
inóculo. En la melaza, el crecimiento y la producción de goma de xantano fueron mayores que en el sustrato
sintético LB que contiene concentraciones idénticas de sacarosa. Además, los cultivos inoculados de los
sustratos de melaza mostraron una mayor producción de goma de xantano que los inoculados de LB.
DISCUSIÓN
Se informa sobre la adaptación de X. campestris en ambientes de alta melaza mientras se mantiene su capacidad
para producir xantano. El éxito se logró al alcanzar el crecimiento a concentraciones de melaza superiores a 140
g / l, superando así las dificultades encontradas por los investigadores anteriores que informaron la inhibición
del crecimiento a tales concentraciones de melaza. De manera similar con estos hallazgos, la aparición de
variantes espontáneas de alta producción de X. campestris ha sido demostrada anteriormente por varios
investigadores. Además, la importancia de la adaptación de la cepa a la melaza también se ha subrayado
anteriormente.
El método para la determinación de la goma de xantano se modificó para evitar la coprecipitación observada de
la goma de xantano y la biomasa debido a la presencia de cationes polivalentes, especialmente calcio que es
abundante en la melaza de remolacha azucarera. Los cationes polivalentes como el calcio, el aluminio y las
sales de amonio cuaternario son especialmente efectivos en la precipitación de la goma de xantano debido a la
unión iónica de los cationes a los grupos ionizados en el polisacárido polianiónico.
En comparación con otros polisacáridos utilizados como aditivos alimentarios, se ha demostrado que la goma de
xantano se encuentra entre las que unen el calcio más fuerte. Por lo tanto, suplementar la solución de KCl,
utilizada en la precipitación de biomasa con EDTA, dio como resultado una mejora de la solubilidad de la goma
de xantano (Fig. 1).
Aunque la melaza de remolacha normalmente contiene la mayoría de las sustancias necesarias para la nutrición
de los microorganismos, dependiendo de la fermentación, pueden complementarse con ciertos componentes
como nitrógeno, fósforo o magnesio. Debido a su bajo costo, se investigó el uso de agua del grifo, ya que
también puede servir como una fuente adicional de magnesio para el medio, ya que contenía aproximadamente
34 mg / l de magnesio. Se ha informado que Triton 80 mejora el rendimiento de xantano y la calidad del
polímero por X. campestris cultivado en un medio químicamente definido. Sin embargo, en los presentes
experimentos, la productividad no mejoró (Tabla 3) probablemente porque la melaza ya contiene sustancias que
actúan como tensioactivos. Esto también se indica por el hecho de que la espuma se observa con frecuencia en
la melaza fermentaciones cuando la adición de un agente antiespumante no es suficiente. El extracto de
levadura, que sirve como fuente adicional de nitrógeno, tuvo un efecto negativo tanto en la producción de
xantano como de biomasa (Tabla 3) probablemente porque el contenido de nitrógeno orgánico en la melaza es
suficiente para soportar el crecimiento de X. campestris mientras que aumenta aún más mediante la adición de
levadura extracto tuvo un efecto perjudicial.
Esto también está respaldado por hallazgos anteriores que indicaron el efecto inhibidor de las altas
concentraciones de nitrógeno tanto en el crecimiento como en la producción de goma de xantano. En
conclusión, entre los aditivos que se investigaron, solo los fosfatos demostraron tener un efecto positivo en la
producción de goma de xantano (Tabla 3). Los niveles óptimos de melaza y fosfatos se definieron
posteriormente con mayor precisión en los experimentos del presente estudio.
Aunque, Abd El Salam et al. (1993) informaron que la fortificación con cloruro de amonio de un medio
utilizando melaza de caña de azúcar como fuente de carbono, una comparación entre sus hallazgos y los
presentados en este estudio, debe tratarse con cuidado. La melaza de remolacha contiene significativamente más
compuestos nitrogenados y se espera que satisfagan la demanda de nitrógeno del organismo en mayor medida,
pero por otro lado también contienen menos biotina.
La investigación sobre el papel de los fosfatos en el medio de cultivo reveló que la producción de xantano fue
menor en presencia de Tris que en presencia de K2HPO4 y Na2HPO4, pero mayor que en medios sin aditivos.
Esto indicó que la adición de fosfatos mejoró la producción de goma de xantano tanto porque el medio era
deficiente en fosfatos y se requería su suplementación como porque sirven como agente tamponador,
reduciendo las fluctuaciones de pH del cultivo. Por lo tanto, una concentración de K2HPO4 de 4 g / l es la
concentración crítica a la que se cumplieron los requerimientos de nutrientes del organismo mientras el pH se
mantiene relativamente constante. En general, se acepta que un pH casi neutro es óptimo para la síntesis de
polisacáridos y el crecimiento del organismo. La importancia del pH en las fermentaciones de X. campestris ha
sido revisado anteriormente.
En el presente trabajo, se informa que la producción de aproximadamente 53 g / l de goma de xantano en 24 h
se usa como sustrato de melaza de remolacha azucarera, un subproducto de la industria alimentaria. La
producción y el rendimiento (61%) se encuentran entre los más altos reportados para fermentaciones de goma
xantana en un medio industrial o de laboratorio. En un estudio anterior se informó una producción de goma
xantana de 22.8 g / kg de medio a partir de melaza de remolacha azucarera. Aunque, en los biorreactores de
laboratorio, la producción de polisacáridos rara vez supera los 25 g / l, los procesos industriales pueden alcanzar
un contenido final de goma de xantano de aproximadamente 50 g / l. Sin embargo, Abd El Salam et al. (1993)
informaron una producción de goma de xantano de hasta 70.5 g / l de un cultivo cultivado en melaza de caña de
azúcar utilizando una concentración de azúcar inicial relativamente alta del 25%. El aumento en la producción y
el crecimiento observado usando melaza como sustrato probablemente se atribuya en parte a la alta
disponibilidad de aminoácidos y especialmente de glutamato en la melaza. De hecho, en un estudio anterior
mostró que la mejor fuente de nitrógeno para X. campestris era glutamato a una concentración de 15 mM (2.2
g/l) mientras que en el presente estudio el medio de fermentación contenía aproximadamente 1.3 g / l de
glutamato libre y unido, con un aminoácido total contenido de 4.0 g / l. Además, la melaza de remolacha
azucarera contiene cantidades significativas de ácidos orgánicos, lo que podría mejorar la producción de goma
de xantano como se ha observado anteriormente en presencia de ácidos orgánicos metabolizables y ácido
cítrico. Por lo tanto, el efecto combinado del contenido de aminoácidos y ácidos orgánicos de la melaza junto
con la adaptación de la cepa podría ser la razón de la alta producción observada en el presente estudio.
El trabajo futuro se centrará principalmente en la caracterización química y reológica del producto, así como en
los métodos de purificación y clarificación. La escala a biorreactores de laboratorio y planta piloto es un
requisito previo para el estudio detallado de los efectos del tiempo y los parámetros de ingeniería en la
producción y calidad de xantano.