Obando Ballardo Kevin Rogger

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Tecnicas de Inmunohistoquimica

Inmunohistoquimica y Patologia Molecular

6to ciclo

2020

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 Definicion
La inmunohistoquimica es un procedimiento de laboratorio, donde se hace el uso de
anticuerpos monoclonales o policlonales unidos en su fraccion constante (Fc) a una
enzima. Este complejo de anticuerpo y enzima se uniran a un epitopo especifico o que
sea de interes para que despues sea analizado en el microscopio

Fundamentos
Como ya se habia mencionado antes se puede utilizar dos tipos de anticuerpos en
particular que son:

Estos anticuerpos son aquellos anticuerpos Estos anticuerpos, a diferencia de los

que provienen de varias clonas de celulas
plasmaticas por lo que en el suero hay
presencia de varios anticuerpos especificos a
varios epitopes, pero en el uso de laboratorio
estos anticuerpos son comercializados y son
extraidos de ratones, conejos, cabras
policlonales, son anticuerpos que provienen
de una sola clona de una celula plasmatica,
por lo que el anticuerpo es especifico para un
solo epitope. Estos provienen de ratones para
su uso en los laboratorios

Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales

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 La particularidad de estos anticuerpos es que para su uso en Anticuerpo
inmunohistoquimica se utiliza una enzima unida a la fraccion
constante del anticuerpo, la cual al agregar su respectivo Enzima
sustrato dara como resultado un producto, este porducto
enzimatico generado por la reaccion enzima sustrato mostrara Enzima
una coloracion la cual se evidenciara por el microscopio Anticuerpo

Enzima
Enzima
Anticuerpo Anticuerpo
Enzima
Enzima

Enzima Enzima

Enzima

Etapas de la Reaccion Antigeno-Anticuerpo en Inmunohistoquimica

Para que se genere una reaccion antigeno anticuerpo los componentes necesarios es
obtener la muestra del corte histologico que exprese el antigeno que nosotros queremos
detectar con nuestro anticuerpo primario para luego agregarle un anticuerpo secundario
con respectiva enzima conjugada y finalmente revelar la reaccion con un sustrato mas
un comogeno, en esencia serian estos tres pasos :

 Reaccion del anticuerpo primario con el antigeno presente en la muestra

histologica
 Union del anticuerpo secundario con su enzima conjugada al anticuerpo
primario
 Agregacion del sustrato + cromogeno

Sustrato+cromogeno

Anticuerpo secundario

Anticuerpo primario

Antigeno

Corte histologico

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Procedimiento de IHQ

Existen fases especificas para un adecuado proceso de la muestra en la cual se divide en

dos grandes grupos Fase Histologica y Fase Inmunologica

Fase Histologica Fase Inmunologica

Fase Preanalitica Fase Analitica Fase Postanalitica
 Prefijacion  Recuperacion  Diseño de
Antigenica controles
 Fijador  Bloqueo de  Controles Positivos
enzimas endogenas
 Fijacion  Anticuerpo  Controles
primario Negativos
 Postfijacion  Diluyente  Interpretacion
 Sistema de  Indicadores criticos
deteccion
 Cromogeno
 Contracolor y
montaje

1. Fase Histologica
1.1 (Preanalitica)

Esta fase es crucial para un buen desarrollo del tejido ya que se suele cometer los
mayores errores en esta fase, siendo la tasa de perdida antigenica la mas comun de
todas. Considerando que una mala fijacion de la muestra va impedir que los resultados
sean fiables y reproducibles en la tecnica inmunohistoquimica

1.1.1 Prefijacion
En esta fase de prefijacion se deben tener en cuenta dos conceptos importantes para
que la probabilidad del detrioro de epitopes sea menor :
 TIEMPO DE ISQUEMIA CALIENTE
Este concepto hace referencia es el teimpo que transcurre desde la
interrupcion del flujo sanguineo hasta la exeresis (extraccion del organo o
tejido)
 TIEMPO DE ISQUEMIA FRIA
En cambio el tiempo de isquemia fria es el tiempo que transcurre desde la
exeresis hasta que la muestra es sumergida en formol

Por otro lado la obtencion y tipo de muestras en Inmunohistoquimica se puede

obtener de tejidos como biopsias de piel, intraoperatoria, extendidos de sangre, liquido
encefaloraquideo, saliva, secreciones y extendidos biologicos

1.1.2 Fijador

En esta etapa la importancia de escoger un buen fijador se centra en la preservacion

de la morfologia celular para mantener la integridad estructural de los antigenos en

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 cuestion. Por otro lado las caracteristicas que debe cumplir el fijador adecuado es
impedir la perdida o desplazamiento del antigeno en especial los que poseen bajo
peso molecular y no deberia interferir en la reaccion antigeno-anticuerpo, siendo el
fijador como excelencia el formaldehido

Propiedades del Formaldehido:

Este fijador presenta una composicion de formol buferado al 10% con un pH neutro
(7) la cual va a permitir cambios reversibles en la composicion quimica de las
celulas. Por otro lado si el tejido es sumergido por mucho tiempo en formol es
posible que se generen radicales libres de CH2 o CH2(OH)2 por eso es recomendable
su uso entre 24-72 horas como maximo

1.1.3 Fijacion

En el proceso de fijacion el tejido va a pasar por un varias soluciones de alcohol

para deshidratar el tejido, etanol en diferentes grados de 70, 90, 96 y 100 por ciento
y por ultimo el Xilol. Luego el tejido deshidratado pasa por un proceso de
parfinizacion en una estufa de 60 grados centigrados para luego ser vaciado en el
molde y tener como resultado final el bloque de parafina

1.1.4 Postfijacion

En esta etapa el bloque de parafina se traslada al microtomo, quien es responsable

de los cortes histologicos, para que finalmente se coloquen en las laminas
histologicas y se deriben a sus diferentes areas de analisis en inmunohistoquimica

II.Fase Inmunologica (fase analitica y post-analitica)

2.1 fase analitica

En esta fase comienza con el desparafinado del tejido porcesado y termina con el
montado de los cortes contacolorados. Las variables de esta fase, las cuales a
diferencia de la preanaliticas pueden controlarse y modificarse dentro del laboratorio
de patologia.

2.1.1 Hidratacion de muestras

Para que la reaccion antigeno-anticuerpo se de a cabo, el tejido pasara por un

proceso de hidratacion en la cual se iniciara con el Xilol, etanol al 100%, etanol al
95%, etanol al 70% y para finalizar por agua destilada. Por otro lado en el caso de
secreciones se utilizara acetona fria para que luego ambas muestras biologicas pasen
por inmunohistoquimica

2.1.2Recuperacion antigenica

La recuperacion antigenica fue una tecnica desarrollada en la decada de los 90

indicando que los puentes de metilo entre las proteínas y el formol podían romperse con
temperaturas superiores a 100°C o tratamiento alcalino, posteriormente se le denomino
recuperacion antigenica inducida por calor (HIER). Existen varias hipotesis acerca del
mecanismo de accion, pero la mas fuerte explica que dependería de la hidrolisis de los

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enlaces cruzados inter e intramoleculares exponiendo nuevamente la secuencia lineal
aminoacídica de los antígenos.

Es muy importante tener en cuenta que para realizar el proceso de rescate antigenico
existen varios metodos, como los siguientes :

 Digestion proteolitica

Enzima Concentracion de Temperatura de Timepo de

trabajo activacion incubacion
Proteinasa K 0.1%, pH 8 25-37°C 5-10 minutos

Tripsina 0.1-0.25%, pH 6 37°C 10 minutos

Pepsina 0.2-0.4%, pH2 37°C 5-20 minutos

Proteasa XXIV 0.05%-01%, 37°C 5-10 minutos

PH7.6

Proteasa XIV 0.05%-01%, 25-37°C 10-30 minutos

PH7.6

 Tratamiento con calor

Equipo Ventajas Inconvenites Temperatura y

tiempo
Microondas Comodidad. No hay Recuperación desigual. 100°C. 20 minutos.
que estar pendiente Inherente al principio
del T ni la T. de calentamiento del
MO. Recuperación
variable según el
modelo de MO y el
número de vidrios.
Olla a presion Rapidez. Se toma el Alteración 120°C. 2-5 minutos.
T a partir del morfológica. Hay que
momento en que la estar muy pendiente de
válvula alcanza la tiempo. Manipulación
segunda marca. de la olla peligrosa.

Baño termico Reproducibilidad. Requiere más tiempo. 95-99°C 20-40

Condiciones Si no es digital hay que minutos.
fácilmente controlar la
estandarizables. temperatura
permanentemente.
Camara de Fiabilidad. Posible 125°C 1-5 minutos.
Parámetros de desprendimiento y/o
presion paracial presión y calor rotura de los cortes.
controlados
automáticamente y
6 confirmables
mediante bandas
reactivas.
  Solucion de desenmascaramiento

Solucion pH
Buffer citrato 6
EDTA 8
Target Retrieval 9
Tris-Buffer Salino 7.6

2.1.3 Bloqueo de enzimas endogenas

En el laboratorio las coloraciones mas frecuentes son las de peroxidasa y fosfatasa

alcalina, entonces para que exista una correcta coloracion inmunohistoquimica en el
tejido procesado o secrecion se debe inhibir la actividad enzimatica endogeno y no
ocurra interferencia en la reaccion IHQ.

La enzima a bloquear dependera de la enzima que se vaya a usar para la coloracion

siendo las mas comunes la fosfatasa alcalina , biotina y la actividad peroxidasa

Para eso existen diferentes soluciones bloqueadoras de la actividad enzimatica:

 H2O2
 Avidina
 Biotina
 Leche descremada
 Albumina serica bovina

2.1.4 Anticuerpos primarios

Una glicoproteina con capacidad de unirse a moleculas especificamente, producidas por

las celulas plasmaticas ante un estimulo antigenico. Cada Cada Ig está compuesta de dos
cadenas pesadas -H- (Heavy) idénticas y dos cadenas livianas -L- (light) idénticas (Ver figura1).

La diferencia entre las distintas clases y subclases de Ig radica en las propiedades antigénicas y
estructurales de las cadenas H (α, δ, Ɛ, γ, μ). Las dos cadenas L son de clase kappa o de clase
lambda. En cada molécula de Ig existen áreas globulares llamadas dominios que pueden ser -C-
constantes (extremo carboxilo terminal) o variables -V- (extremo amino terminal). El dominio
variable de la cadena liviana (VL) y el dominio variable de la cadena pesada (VH) forman juntos
el sitio de unión con el antígeno llamado paratope.

En el laboratorio de inmunohistoquimica se suele utilizar todos los tipos de inmunoglobulinas

(IgG,IgA,IgE,IgD y con menor frecuencia la IgM)

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En esta imagen se puede obser las Diagrama mostrando los dominos
fracciones Fab (antigen-binding) y Fc variables y constantes de la cadena
(cristalizable) de una inmunoglobunia. pesada H y cadena ligera L

En la fraccion de union antigenico esta

compuesto por una cadena ligera L y una
pesada H, mientras que la fraccion
cristalizable por una cadena ligera

2.1.6 Enzimas y cromogenos

Basándose en la reacción enzima–sustrato los métodos de coloración inmunoenzimáticos

utilizan enzimas para convertir cromógenos, sin color, en productos finales coloreados como
resultado de su oxidación. Las enzimas son proteínas catalizadoras (sustancia que acelera o
retarda un reacción química). Las dos enzimas usadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina.

Peroxidasa (HRP): La enzima peroxidasa es obtenida por la raiz del rabano. El mecanismo
que tiene esta enzima es formar un complejo de hematina con el peroxido de hidrogeno
donde el producto de esta reaccion dara H2O y oxigeno O2. Este oxigeno liberado del
producto de la reaccion oxidara el cromogeno 3,3'- 2 diaminobenzidina (DAB) produciendo un
color pardo insoluble en alcohol

Fosfatasa alcalina: Esta enzima es obtenida del intestino del ternero y su mecanismo de
accion es hidrolizar los esteres de naftol fosfato, siendo este su sustrado de la fosfatasa
alcalina dando como producto de la reaccion compuestos fenolicos y fosfatos. Estos
compuestos fenolicos van a reaccionar con el cromogeno DIAZONIO

Cromógenos: Rojo Rápido (Fast Red TR) y Azul Rápido (Fast Blue BB) producen un color rojo o
azul brillante en su producto final, respectivamente. Ambos son solubles en solventes
alcohólicos u otros solventes orgánicos

2.1.5 Sistema de deteccion

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 a. Metodo de Estreptavidina-Biotina

 Metodo ABC modififcado

 Este metodo el fundamento que presenta es la alta afinidad que tienen la estreptavidina
(glicoproteina de la bacteria Streptomices Avidinii) y la biotina (vitamina que se encuentra
en la yema del huevo). La biotina tiene la facilidad de ser conjugada con diferentes
anticuerpos y enzimas, con la capacidad de unirse por enlaces covalentes, por otro lado
como dato adicional por cada anticuerpo se puede unir aproximadamiente 150 moleculas
de biotina

 La estreptavidina posee cuatro sitios de unión para la biotina, pero a causa de la

orientación molecular de los sitios de unión, menos de cuatro moléculas de biotina se
unirán realmente.
El único requerimiento es que la enzima (peroxidasa/fosfatasa alcalina) tenga al menos dos
moléculas de biotina unidas. De manera que el anticuerpo secundario conjugado con
biotina actúa como puente entre el anticuerpo primario, unido al epitope antigénico, y el
complejo “estreptavidina/enzima biotinilada”. A su vez la enzima biotinilada actúa de
puente entre las estreptavidinas

 Metodo LSAB

 Otra opción es el uso de estreptavidina directamente marcada con la enzima. La ventaja de

este método respecto al ABC son su mayor sensibilidad y la estabilidad del complejo
estreptavidina-enzima que a diferencia del complejo ABC, que debe prepararse en el
momento de su empleo, puede ser diluido y almacenado durante largos periodos de
tiempo.

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 b. Sistema de deteccion basados en polimeros

 Metodo EnVision

 En este metrodo se utiliza dos componentes principales el dextran y las enzimas. Una
molecula larga de dextran posee incorporado 100 moleculas de enzimas (peroxidasa o
fasfatasa alcalina) que a su ves esta unido a 20 anticuerpos de conejo o de raton la cual al
unirse al anticuerpo primario las enzimas van a reaccionar provocando una coloracion mas
nitida

 Metodo PowerVision

 Emplea pequeñas moléculas capaces de polimerizar con el anticuerpo secundario y con

moléculas de enzimas de manera lineal y compacta a modo de “rascacielos”. Esta
disposición permite la unión de múltiples conjugados a antígenos próximos, a los cuales el
dextrano por su alta masa molecular y su compleja disposición tridimensional puede
facilitar la union a la molecula

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 2.2 Fase Post analitica
En esta ultima fase se corrobora los reactivos y el tejido ya que se tiene un control
positivo , control negativo , control de intensidad y un control de especificidad

 Control Positivo
Este control hace referencia a un tejido que se sabe que tiene el antigeno
expresado, en la cual se quiere estudiar

 Control Negativo
En este control es todo lo contrario al control positivo. En este caso se va
aislar u obtener un tejido que no exprese el antigeno en cuestion

 Control de intensidad
Asegurar un tejido que exprese mayores cantidades de antigeno que se
quiera evaluar

 Control de especificidad
En este control hace referencia al anticuerpo, la cual es un isotopo
monoclonal o policlonal identico a la estructura molecular pero sin
especificidad del antigeno que se quiere detectar

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 Bilbliografia

1. [Internet]. Faeditorial.es. 2020 [cited 3 October 2020]. Available from:

https://www.faeditorial.es/capitulos/anatomia-patologica-MANUAL-7.pdf

2. [Internet]. Iah.salud.gob.ar. 2020 [cited 3 October 2020]. Available from:

http://iah.salud.gob.ar/doc/Documento203.pdf

3. [Internet]. Fbioyf.unr.edu.ar. 2020 [cited 3 October 2020]. Available from:

https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/156025/mod_resource/content/1/Cla
se%2017.%20Inmunohistoquimica.pdf

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