Bioquímica I- PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ENZIMA ANTIOXIDANTE ENDÓGENA

CATALASA

Práctica 11: Enzimas antioxidantes endógenas

TÍTULO: AISLAMIENTO, EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN

DE CATALASA
Casabona Acevedo,Denisse; Torres Mera, Katherine; Flores Berrocal, Thuany; Medrano
Miranda, Danna.
 

1. Objetivos

❖ Determinar la actividad enzimática de la catalasa.

❖ Presentar el método de extracción, purificación y cuantificación de la enzima catalasa.

2. Materiales y equipos

❖ Material vegetal: papa

❖ Espectrofotómetro
❖ Luna de reloj
❖ Tampón fosfato y NaCl
❖ Vasos de precipitado
❖ Agua oxigenada
❖ Tubos de ensayo
❖ Agua destilada
❖ Pipeta
❖ EDTA

3. Elegir la fuente

Se obtendrá de material vegetal tubérculo: papa ( Solanum tuberosum)​. El fundamento según

investigación bibliográfica: Se conocen mecanismos de defensa antioxidante frente al daño oxidativo
provocado por las EROs (especies reactivas de oxígeno), formados por sistemas enzimáticos
(catalasa-CAT, superóxido dismutasa-SOD)​. ​Cuando hay un desequilibrio en el balance entre la
generación de radicales libres y su eliminación por los antioxidantes, se produce una situación de
estrés oxidativo, la catalasa (CAT) metaboliza por degradación al peróxido de hidrógeno.
2 H2O2 ----> O2 + 2H2O

4. Extraer la proteína de la fuente

❖ Cortar la papa en trozos de igual tamaño.

❖ Pesar aproximadamente 1 gr de material vegetal.
❖ Rotular 5 vasos de precipitados con números del 1 al 5.
❖ Introducir el trozo de papa en cada recipiente.
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❖ A continuación, se realiza la disolución de agua oxigenada correspondiente y cubriendo la

papa.
❖ Llenar los tubos de ensayo con la disolución correspondiente y con mucho cuidado para que
no entre aire introducirlos por la parte estrecha del embudo.
❖ Cuando transcurran 20 minutos marcar con un rotulador la cantidad de oxígeno acumulado en
el extremo de cada tubo.
❖ A continuación medir el volumen de oxígeno, llenando el tubo de ensayo con agua hasta la
marca realizada, con ayuda de una pipeta de 10 mL
❖ Repetir el experimento pero sin papa, esto servirá de control.

5. Cuantificación de la proteína en el extracto crudo

El volumen del sobrenadante se purifica a través de una columna de intercambio aniónico, utilizando
como buffer de elusión a 50 mM Tris 0.1 mM EDTA ph 7.0 con diferentes concentraciones de NaCl
con un flujo de elusión más alto de proteína a una concentración de 1 M NaCl. el volumen en
investigación bibliográfica indica de 0.6 mL con concentración determinada con el
método de Bradford de (0.2 mg/mL)

Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas preparadas como se
indica en la tabla.

Dejar a temperatura ambiente y leer las absorbancias a una longitud de 240 nm .

6. Aislamiento y concentración (Purificación parcial)

Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades fisicoquímicas o biológicas de la
proteína de interés para separarla del resto de las moléculas.

Diálisis

Fundamento:

La diálisis es una forma de filtración molecular. Es un proceso que separa moléculas de acuerdo con
su tamaño, mediante el empleo de membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones
inferiores a las macromoleculares. Estos poros permiten que moléculas pequeñas, tales como las de
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los disolventes, sales y metabolitos pequeños, se difundan a través de la membrana pero bloqueen el
tránsito de moléculas mayores.

Procedimiento:

Para eliminar el exceso de NaCL de la fracción eluida en la cromatografía de intercambio iónico y que
se utilizará para medir la actividad enzimática, se sometió al proceso de diálisis. En este proceso se
utilizó una membrana Spectra/Por N° 1 que. conteniendo la fracción a dializar, se suspendió en un
litro del mismo buffer de elusión que se empleó en la purificación sin NaCl y se dejó por 24 hrs bajo
refrigeración.

7. Evaluación del proceso de purificación.

Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 100 mM tampón fosfato de potasio (pH 6.5), 1.0 mM
EDTA, 60 mM H2O2. La actividad se determinó siguiendo la descomposición de peróxido de
hidrógeno (H2O2) a 240 nm en un espectrofotómetro.

8. Referencias Bibliográficas:
Veramendi G, Jury Magne. Respuesta de variedades mejoradas de papa (Solanum tuberosum) al
estrés hídrico sequía. Journal of the Selva andina Biosphere. 2013; 1(1): 25-36