Microbiologia Informe Tecnico

Informe tecnico parte microbiología
Operación Descripción Materiales Y Reactivos Condiciones Manejo De

Equipos De Operación Residuos
Extracción Se realiza -Cajas de -lugol Debe estar Se debe

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prima, en el medio
este caso
(Eucaliptus
globulus).
Luego de
esto se
realiza una
tinción de
Gram
RESUMEN DE LA TABLA ANTERIOR
Se realiza una extracción de celulosa para determinar las propiedades
antimicrobianas, anti fúngicas y determinar la capacidad de degradación de
la celulosa de la bacteria bacillus subtilis presente en el eucaliptus globulus,
también realizando una tinción de Gram, teniendo en cuenta los materiales,
equipos y reactivos que se van a utilizar para realizar el procedimiento y un
buen acondicionamiento del laboratorio para evitar las contaminaciones del
medio. Al finalizar el proceso se debe llevar al autoclave y finalmente se
lleva a las canecas de riesgo biológico ubicadas en el laboratorio.
RUTA BIOQUIMICA
1.Determinar el volumen necesario a preparar del medio de
cultivo
2.Calcular la cantidad requerida de cada componente para preparar el
medio de cultivo
3.Colocar sobre el mechero un soporte y su malla de asbesto
4.Colocar sobre la malla de asbesto un frasco Shock
5.Agregar un pequeño volumen de agua al frasco Shock
6.Precalentar el volumen contenido en el frasco Shock
7.Pesar la cantidad de cada componente
8.Agregar al frasco Shock
9.Disolver
10Mantener agitación hasta disolver completamente
11Auto-clavar
12Calentar
13.Enfriar
14.Verter sobre las cajas de Petri
15.Esperar a que gelifique
2.3.1 DESCRIPCIÓN DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO

(Biotecnología)
Primero se revisó la literatura para verificar la bacteria que requería la materia

prima para observar las propiedades antifúngicas y antimicrobianas que posee el
material vegetal, como resultado de la investigación dio positivo para bacillus
subtilis el cual, primero se procede a hacer un medio de cultivo para que este
pueda reproducirse.
El aislamiento de microorganismo se hizo para determinar la capacidad de

obtención de celulosa a partir de la bacteria bacillus subtilis presente en la
materia prima.
BACILLUS SUPTILIS
La bacteria bacillus suptilis son un grupo de bacterias ubiquitarias gram-
positivas, aerobias y formadoras de esporas. Es considerado un organismo
no patógeno. Producen endosporas termo resistente, enzimas hidrofílicas
extracelulares que le permiten descomponer polisacáridos y ácidos
nucleicos, que más tarde usara como fuente de carbono. Producen
antibióticos como la bacitricina, polimixina, gramicidina y circulina,
Fermentan la caseína y el almidón, vive dentro de los límites de 55 a 70ºC.
Además, es un gran controlador biológico.
Ya con la bacteria seleccionada se procede hacer la preparación de la

materia prima y los respectivos agares.
Se realizó la preparación de caldo mendels, en un frasco Schott luego se
procede a introducir la materia prima, previamente seca y triturada (lista
para la destilación) esto se hizo con el fin de extraer la celulosa.
Se realizó un método consiste en tomar tres muestras representativas del

producto, a fines de, evidenciar presencia alguna de celulosa y, dentro de la
misma, formación de colonias. Se requirió tomar 1 ml de la mezcla que se
encuentra en el frasco Scott de la para las tres cajas de petri, sembradas a
profundidad con el agar nutritivo, en los respectivos periodos de tiempo
(hora 00, 24, 72); adicionalmente, se tomaron 5 ml de la misma muestra
para depositarlos en los tubos de ensayo para revisar el grado de turbidez y
comparar con los patrones de Mc.Farland.
Para las alícuotas tomadas de la mezcla anterior, se pusieron sobre el medio de

cultivo y se dejaron en incubadora esperando un crecimiento favoreciendo el
proyecto. De las tres cajas que se sembraron, se les hizo lectura a diferentes
horas y se lograron obtener los siguientes resultados:
HORA 00:00
En la hora 00:00 se realizó la primera lectura de colonias. se logró evidenciar un
crecimiento de 29 colonias en total las cuales se pudo deducir que este
crecimiento se debió a que el medio de cultivo creció una bacteria diferente por
causa de contaminación del medio, ya sea mientras se sembraba o durante el
tiempo que tuvo la caja en reposo
Hora: 24:00
Hora: 72:00
En la hora 24:00 y 72:00 no se evidenció crecimiento, ya que no se extrajo

la suficiente celulosa de la materia prima. además de que la bacteria
bacillus subtilis no se pudo desarrollar ya que el eucalipto cuenta con
propiedades microbianas.
2.3.2 RUTA BIOQUÍMICA PARA LA OBTENCIÓN DEL METABOLITO (Biotecnología)
No se hizo una ruta metabólica, se realizó una extracción de celulosa para

ver la degradación de celulosa de la materia prima para obtener un mejor
rendimiento en el aceite además de verificar que la bacteria Bacillus suptilis
está haciendo un buen trabajo como protectora de la materia prima,
permitiéndole soportar condiciones ambientes extremas.
La celulosa es la sustancia sólida, blanca, amorfa, inodora y sin sabor, e
insoluble en agua, alcohol y éter, que constituye la membrana celular de
muchos hongos y vegetales; se emplea en la fabricación de papel, tejidos,
explosivos, barnices, etc.
La extracción de celulosa se utiliza para romper estructuras en la materia
prima exponiendo sus componentes activos para la extracción de aceite, la
celulosa recubre las hojas de eucalipto esto hace que la ruptura de los
enlaces que contienen mayores cantidades de aceite sea menos eficaz o
con mayor dificultad, al extraerle la celulosa hace que sus componentes
volátiles queden libres, también pueden tener efectos negativos como
perder componentes volátiles más de los que se deben que implican en un
compuesto importante para el aceite quedaría en baja proporción, o
simplemente no se obtenga suficiente aceite.
1. PROCEDIMIENTO PARA MATERIA PRIMA
Se le realizo una extracción de celulosa, con el fin de degradar la materia prima

para obtener un mejor rendimiento en el aceite esencial. Para esto se llevaron
a cabo algunos procedimientos, que van desde el alistamiento hasta el conteo
de colonias que se reprodujeron en los medios, los procedimientos fueron los
siguientes:
● Limpieza y Alistamiento
Antes de realizar cualquier procedimiento es obligatorio realizar la limpieza
de las zonas que serán utilizadas para el desarrollo de la práctica, de igual
forma los materiales que vayan a ser utilizados durante el desarrollo de la
práctica. Puesto que las trazas de químicos que contengan, así como, la
presencia de microorganismos diferentes, al objetivo pueden afectar en
gran medida la obtención de resultados, generando variaciones
inesperadas y afectando el análisis. Una vez lavado y desinfectado el
material, así como las zonas que vayan a ser utilizadas se procede a
encender mecheros en cada zona de trabajo y posteriormente ubicar el
material para cada grupo de trabajo.
● PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Preparación de Agar Nutritivo
Determinar el volumen necesario a preparar del medio de cultivo

Calcular la cantidad requerida de cada componente para preparar el
medio de cultivo
Colocar sobre el mechero un soporte y su malla de asbesto
Colocar sobre la malla de asbesto un frasco Shock
Agregar un pequeño volumen de agua al frasco Shock
Precalentar el volumen contenido en el frasco Shock
Pesar la cantidad de cada componente
Agregar al frasco Shock
Disolver
Mantener agitación hasta disolver completamente
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Verter sobre las cajas de Petri
Esperar a que gelifique
Sembrar cepa bacteriana
1.
Preparación Caldo Mendels
medio de cultivo
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Verter en tubos de ensayo
Comparar con patrón de McFarland
Preparación Caldo Nutritivo
medio de cultivo
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Verter en tubos de ensayo
Comparar con patrón de McFarland
Preparación Agar almidón
Para la realización de este medio de cultivo se decidió preparar un medio de
cultivo único para todos los grupos de trabajo. Para ello se realizaron
los siguientes pasos:
medio de cultivo
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Preparación Agar Carboximetilcelulosa (CMC)
medio de cultivo
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Auto-clavar material y medios de cultivo
Lavar material destinado a auto-clavar
Envolver material en papel craft
Marcar cada grupo de material
Introducir en autoclave
Soltar un 1/4 la tapa de cada frasco Shock
Introducir los medios de cultivo en la autoclave
Programar la autoclave
Temperatura: 121 °C
Presión: 1 atm
Tiempo: 30 minutos
Esperar que la autoclave culmine
Extraer los materiales y medios de cultivo de la autoclave
Colocarlos cerca al mechero
Retirar el papel craft de cada grupo de material
Secar todos los materiales extraídos
Colocarlos nuevamente cerca al mechero✓
● Cultivo cepa de Bacillus subtilis

Siembra por Aislamiento por estrías
Tomar un haza, y calentar a rojo vivo, durante unos segundos
Tomar una caja de Petri, con el medio gelificado y abrirla cerca al mechero
Enfriar el haza con las paredes de la caja de Petri
Tomar una muestra de la cepa de Bacillus subtilis
Sembrar por método de aislamiento por estrías
Marcar la caja de Petri, con líneas guí
Cerrar caja de Petri
Calentar a rojo vivo nuevamente el asa
Siembra a profundidad
Limpiar y desinfectar la superficie de trabajo
Encender un mechero y ubicar llama
Extraer frasco Shock del sheaker
Extraer material esterilizado de la autoclave
Tomar una alícuota del medio de cultivo adecuado de 1ml y depositar en
la caja de Petri
Agregar 15ml de agar nutritivo y agitar suavemente
Cerrar la caja de Petri
Marcar cada caja de Petri
Agrupar cajas de Petri, envolver e introducir en incubadora
Lavar material utilizado y auto-clavar nuevamente
Regresar frasco Shock al shaker
Siembra por punzón
Marcar líneas guía sobre cajas de Petri en forma de cuadrantes, así como
puntos en la mitad de cada cuadrante
Punzar suavemente sobre el punto realizado anteriormente, sin penetrar
profundamente
Realizar el paso 5
Realizar nuevamente el paso 6, hasta completar los cuatro cuadrantes
Cerrar la caja de Petri, y calentar a rojo vivo el asa
● Prueba Patrón de McFarland

Encender el mechero y acercar los materiales a utilizar
Tomar un tubo de ensayo
Agregar 5 ml de Caldo nutritivo
Introducir al interior del tubo de ensayo, agitar suavemente y rápidamente
Comparar la turbidez al interior del tubo, con el patrón de McFarland II
● Adecuación de medios de cultivo

Caldo de cultivo Nutritivo
Ubicar el frasco Shock cerca al mechero
Abrir el frasco Shock
Introducir el haza en el frasco Shock, agitar suavemente y rápidamente el
haza al interior del frasco Shock
Extraer el haza del interior del frasco Shock
Introducir materia prima al frasco y combinar con el medio de cultivo
Al finalizar la adición de la materia prima, adicionar los tubos de ensayo
preparados anteriormente
Auto-clavar el medio
Introducir en el shaker el frasco schott con el medio adecuado
Tinción de Gram
Tomar una muestra representativa del medio donde se evidencia el
crecimiento de dicha bacteria.
Por medio de una aza tomar la muestra y llevarla a una lámina que contiene
una gota de agua destilada con la intención de plasmarla en su
totalidad en la lámina.
Fijar la muestra, para ello, pasar la lámina cerca a la llama del mechero.
Una vez fijada la muestra, ejecutar la técnica de tinción de Gram.
Usar Cristal Violeta, Lugol por un minuto cada uno, luego se adiciona una gota
de alcohol acetona por 30 segundos, seguido del colorante Fuscina con
un lapso de un minuto y por último se deja secar la lámina a
temperatura ambiente. ✓
Observación Microscopio
Conectar y encender el microscopio
Limpiar el microscopio
Colocar la lámina de cristal en el portaobjetos
Observar utilizando los objetivos en 4x, 10x y 40x, anotar lo que se observa
Añadir dos gotas de aceite de inmersión
Observar utilizando el objetivo 100x, anotar lo que observa
Lavar el material utilizado y limpiar los objetivos del microscopio
Monitoreo de crecimiento de la cepa bacteriana

Ubicar el frasco Shock cerca del mechero
Abrir el frasco Shock
Tomar una pipeta esterilizada de la autoclave
Desenvolver la parte superior del material y colocar el pipeteador
correspondiente
Tomar una alícuota de 1 ml y verter sobre la caja de Petri
Adicionar sobre la alícuota, 15 ml de agar nutritivo
Mezclar
Seis veces en dirección a las manecillas del reloj
Seis veces en contra a las manecillas del reloj
Seis veces de arriba-abajo
Seis veces de izquierda a derecha
Seis veces en L a la izquierda
Seis veces en L a la derecha
Tomar una alícuota de 5 ml y agregarla a un tubo de ensayo
Marcar la caja de Petri y el tubo de ensayo
Hora
Fecha
Grupo
Ficha
Sub-grupo
Introducir a la incubadora
Realizar los pasos anteriores cada 24 horas hasta cumplir 72 horas
● Conteo de colonias
Curva de crecimiento
Extraer las cajas de Petri de la incubadora
Revisar la presencia de colonias bacterianas
Identificar las colonias de Bacillus subtilis
Realizar el conteo de cada UFC existente en cada una de las cajas de
Petri (Si es necesario dividir la placa por cuadrantes)
Realizar la curva de crecimiento de las bacterias
2. PROCEDIMIENTO PARA PRODUCTO TERMINADO:
Se llevó a cabo una preparación de dos medios de cultivo para realizar el

análisis de inhibición del aceite esencial de eucalipto.
Se usaron unos sencidiscos con los cuales se impregnarían con el aceite
esencial para luego llevarlos a sembrar a la caja de petri con el agar ya
preparado y listo. El procedimiento va desde el alistamiento del laboratorio
hasta la lectura de halos de inhibición.
● Limpieza y alistamiento
Este paso es muy importante se debe llevar a cabo en cada proceso que se lleve
a cabo en el laboratorio. Para dar inicio con el proceso se debe lavar y
desinfectado el material, así como las zonas que vayan a ser utilizadas se
procede a encender mecheros en cada zona de trabajo y posteriormente
ubicar el material para cada grupo de trabajo.
● Preparación de agar nutritivo

medio de cultivo
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Se toma un hisopo se impregna de la levadura saccharomyces que se
encuentra en un tubo de ensayo
Se pasa el hisopo impregnado haciendo un barrido sobre el agar nutritivo
● Preparación de agar antibiotico #1

Calcular la cantidad requerida del agar antibiotico #1 para preparar el
medio de cultivo
Pesar la cantidad del agar antibiotico #1
Disolver
Auto-clavar
Calentar
Enfriar
Se toma un hisopo se impregna de la bacteria E-coli que se encuentra en
un tubo de ensayo
Se pasa el hisopo impregnado haciendo un barrido sobre el agar
antibiotico
● Preparación de los sencidiscos

Se toma un papel filtro (nivel laboratorio)
Por medio de un abre huecos se le hacen aproximadamente 100
huecos
Se recojen los círculos provenientes del abre huecos
Se empacan el una bolsa hecha de papel craff
Auto-clavar
Deja enfriar
● Siembra del aceite
Se toma una caja de cada agar ya preparado

Con un depilador para cejas se toman los sencidiscos individual
Se llevan al aceite, dejándolos impregnar bien
Se colocan sobre ambos agares
Se envuelven las cajas de petri en papel vinipel
Se llevan las cajas de Petri a la incubadora
Se llevan a la nevera para evitar crecimiento excesivo
● Lectura de halos de inhibición
Se sacan las cajas de Petri de la nevera, se dejan a qu7e lleguen a

temperatura ambiente

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Extracción Se realiza -Cajas de -lugol Debe estar Se debe

2.3.1 DESCRIPCIÓN DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMO

Primero se revisó la literatura para verificar la bacteria que requería la materia

El aislamiento de microorganismo se hizo para determinar la capacidad de

Ya con la bacteria seleccionada se procede hacer la preparación de la

Se realizó un método consiste en tomar tres muestras representativas del

Para las alícuotas tomadas de la mezcla anterior, se pusieron sobre el medio de

En la hora 24:00 y 72:00 no se evidenció crecimiento, ya que no se extrajo

2.3.2 RUTA BIOQUÍMICA PARA LA OBTENCIÓN DEL METABOLITO (Biotecnología)

No se hizo una ruta metabólica, se realizó una extracción de celulosa para

Se le realizo una extracción de celulosa, con el fin de degradar la materia prima

● PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Preparación de Agar Nutritivo

Determinar el volumen necesario a preparar del medio de cultivo

● Cultivo cepa de Bacillus subtilis

● Prueba Patrón de McFarland

● Adecuación de medios de cultivo

Monitoreo de crecimiento de la cepa bacteriana

2. PROCEDIMIENTO PARA PRODUCTO TERMINADO:

Se llevó a cabo una preparación de dos medios de cultivo para realizar el

● Preparación de agar nutritivo

Determinar el volumen necesario a preparar del medio de cultivo

● Preparación de agar antibiotico #1

Determinar el volumen necesario a preparar del medio de cultivo

● Preparación de los sencidiscos

● Siembra del aceite

Se toma una caja de cada agar ya preparado

● Lectura de halos de inhibición

Se sacan las cajas de Petri de la nevera, se dejan a qu7e lleguen a

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