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1.- TECNICAS DE VISUALIZACION MICROSCOPICA DE
MICROORGANISMOS
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estéril sobre el portaobjeos, para posteriomente, con ayuda del asa
de siembra
(Previamente flameada y enfriada) realizar una suspensión del
producto.
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2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS.
2.1.2.- SECADO.
Se dejara secar el frotis a temperatura ambiente. Para ello, se
puede agitar varias veces el porta al aire hasta comprobar su secado.
2.1.3.- FIJACIÓN.
Tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del
material a estudiar en un estado lo más próximo al estado vivo. Las
formas más habituales de fijación son:
Por el calor, se pasa varias veces, la parte inferior de la
preparación por la llama azul de un mechero BUNSEN,
hasta que se note caliente al colocarlo en el dorso de la
mano, sin que queme.
Alcohol en frió, se cubre la preparación con etanol o
metanol. Se deja actuar durante varios minutos, se
escurre y se deja secar.
2.1.4.- COLORACION.
Es el proceso de coloración de los microorganismos, para
teñirlos existe un gran número de productos químicos con
propiedades colorantes. Su elección está condicionada al tipo de
tinción a realizar.
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el chorro directamente al frotis. El secado se sitúa la preparación en
posición inclinada y al aire.
2.2.2.1.- GRAM.
Esta coloración fue desarrolladas, en 1983, por Christian Gram
y es la coloración diferencial mas utilizada en microbiología Por medio
de ella, se dividen a los microorganismos en dos grandes grupos,
grampositivos y gramnegativos, según retengan o no el primer
colorante (cristal violeta) utilizado en la tinción.
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Gram positivas. El alcohol deshidrata las bacterias Gram positivas que
poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de
peptidoglicano. El resultado es el cierre de los poros de las paredes
impidiendo el escape del complejo de cristal de iodo insoluble.
Reactivos:
Cristal violeta
Lugol
Alcohol-cetona
Safranina
Técnica
Preparar los frotis bacterianos.
Teñir con cristal violeta 2 min.
Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
Cubrir con Lugol 1 min.
Lavar con agua el exceso de Lugol.
Decolorar con alcohol hasta que la preparación deje de
perder color (30 segundos)
Lavar con abundante agua para eliminar el resto de
disolvente.
Teñir con fucsina básica 5 min.
Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
Secar la preparación.
Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color
de cada preparación.
Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos.
Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la
tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados
en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos.
En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los
colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos
tipos (grampositivas y gramnegativas) para ajustar así los tiempos y
tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se
hagan mientras duren esos colorantes son fiables.
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Se observa al microscopio con objetivo de 40x, los bacterias
grampositivas, se teñirán con el primer colorante (cristal violeta),
mientras que las gramnegativas lo harán de color rojo (Safranina).
2.2.2.2.- ZHIEL-NEELSEN
La tinción del Zhiel-Neelsen o de Bacilos Ácido Alcohol
Resistentes (BAAR) se utiliza para diferenciar las bacterias ácido
alcohol-resistentes de las que no lo son, esta diferenciación viene
dada por la existencia de un componente en la pared de la bacteria
(ácido teicoico, es un ácido graso de cadena larga) que permite
soportar la decoloración ácida de la tinción. Esta tinción requiere un
previo calentamiento del frotis, para que el colorante pueda atravesar
la pared de la bacteria y se quede fijado a los componentes de ella.
Reactivos:
Fucsina fenicada de Zhiel-Neelsen
Solución de decolorante alcohol clorhídrico
Azul de metileno fenicado.
Técnica
Una vez preparado y fijado el frotis por calor, se cubre
con la fucsina fenicada y se caliente mediante una llama,
hasta la emisión de vapores.
Se lava con agua destilada.
Se cubre el portaobjetos con la solución decolorantes
durante un minuto y se escurre el porta.
Se lava con agua y se elimina el exceso.
Se cubre con el colorante de contraste y se deja actuar
un minuto
Se lava con agua deshilada y se elimina el resto
Se seca al aire.
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y perfectamente aclarados con agua destilada. Existen tres tipos de
tinciones: Rhodes, Tribondeau y Leifson.
Rhodes:
Los reactivos son el mordiente de Rhodes y el nitrato de plata
amoniacal. Los flagelos se pueden observar gracias al
precipitado negro que se ha depositado en torno a la
estructura.
Tribondeau.
Como reactivos se emplean el mordiente de Tribondeau y
solución violeta de cristal, la visualización de los flagelos es de
de color castaño.
Leifson.
Como colorante se unas el Leifson., los flagelos se observan
de color rojo a azulnegruzco.
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Hiss.
Como reactivos se emplean solución acuosa de cristal violeta
1% y solucion acuosa de sulfato de cobre 2%.Las cápsulas se
observancion objetivo de inmersión y las cápsulas se
visualizaran de azul pálido y las bacterias de color púrpura y
el fondo claro.
Tinta china.
Cono reactivos tenemos, solución de fucsina diluida y
nigrosina o tinta china. Se observa al microscopio con objetivo
de inmersión y se visualizan las bacterias teñidas de rojo por
la fucsina y la cápsula será un halo blanco que las envuelve.
Albert.
Como reactivos tenemos, solución de lugol y colorante de
Albert, se observa la extensión con objetivo de inmersión y los
corpúsculos metacromáticos se verán de color oscuro sobre el
cuerpo bacteriano más claro.
Loeffler.
Los reactivos empleados son, solución de azul de metileno de
Loeffler, los gránulos se verán de azul intenso, sobre el fondo
de la célula azul mas claro.
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3.- TINCIONES ESPECIALES
3.1.1.- TECNICA
Como reactivos se emplean Naranja de Acridina al 0,01% en
tampón de acetato de pH 4, el procedimiento es el siguiente:
se extiende y se seca la preparación.
se fijan los frotis con metanol o por calor.
se cubre la preparación con el colorante y se deja durante
dos minutos
se lava con agua
se seca al aire.
se examina la preparación con objetivo de inmersión en
microscopio de fluorescencia.
Las bacterias presentan un color naranja brillante sobre un
fondo verdoso u oscuro.
3.1.2.- TECNICA.
Como reactivos reemplean: solución colorante rodamina-
auramina, solución de colorante, colorante de contraste. El
procedimiento es el siguiente:
se cubre la preparación con el colorante auramina-rodamina,
durante quince minutos
se lava con agua destilada
se cubre la preparación con solución decolorante (alcohol
clorhídrico) dejándose actuar durante dos o tres minutos.
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se lava con agua destilada
se cubre la preparación con el colorante de contraste y se deja
actuar durante tres o cuatro minutos.
se lava y se deja secar al aire.
Se observa a microscopia de fluorescencia, las bacterias ácido
alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja sobre un fondo
verdusco.
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