UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA MESA

FACULTAD DE CIENCIAS
N° 4
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 5

ESPECTRO DE ABSORCIÓN –
DETERMINACIÓN DE ƛ ÓPTIMO

Integrantes:

 Blaz Villafuerte, Fiorella Romina 20141013

 Caurino Salazar, Liz Dayana 20130969

 Fuentes Guevara, Dennisse Yeriot 20161438

 Mendizábal Huaman, Camila 20161448

20161449
 Morales Robladillo, Sammy Anthony

Grupo: Lunes 2:00 – 4:00 PM (F*)

Fecha de la práctica: 02/09/17

Fecha de entrega del informe: 09/10/17

2017-I
 I. INTRODUCCIÓN

Los métodos espectrométricos son un amplio grupo de métodos analíticos que se basan en las
espectroscopias atómica y molecular. La espectrometría y los métodos espectrométricos hacen
referencia a la medida de la intensidad de la radiación mediante un detector fotoeléctrico o con otro
tipo de dispositivo electrónico.

Los métodos espectrométricos más ampliamente utilizados son los relacionados con la radiación
electromagnética, que es un tipo de energía que toma varias formas, de las cuales las más fácilmente
reconocibles son la luz y el calor radiante y sus manifestaciones más difícilmente reconocibles
incluyen los rayos gamma y los rayos X, así como las radiaciones ultravioleta, de microondas y de
radiofrecuencia. Muchas de las propiedades de la radiación electromagnética se explican con un
modelo clásico de onda sinusoidal, que utiliza parámetros como la longitud de onda, la frecuencia,
la velocidad y la amplitud.

A diferencia de otros fenómenos ondulatorios, como el sonido, la radiación electromagnética no

necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se propaga fácilmente a través del vacío.

II. RESULTADOS

Cuadro N°1: Espectro de absorción del Azul de Bromofenol

520nm 560nm 580nm 600nm 620nm 640nm

%T 83.6% 62.1% 47.5% 48.4% 83.6% -
A 0.078 0.207 0.323 0.315 0.078 -
(Fuente: Manual de Prácticas de Bioquímica)

Cuadro N°2: Curva de calibración del Azul de Bromofenol

TUBO N° BLANCO T1 T2 T3 T4 T5
Sol. Trabajo de
- 2 4 6 8 10 MUESTRA
ABF stock (mL)
PROBLEMA
H 2 O destilada
10 8 6 4 2 -
(mL)
Absorbancia - 0.060 0.134 0.201 0.265 0.326 0.195
Concentración
(mg/mL)
- 8 x 10−4 1.6 x 10−3 2.4 x 10−3 3.2 x 10−3 4 x 10−3 X

Mg% - 8 x 10−6 1.6 x 10−5 2.4 x 10−5 3.2 x 10−5 4 x 10−5

ug/mL - 0.8 1.6 2.4 3.2 4
Mg/L ó ppm - 0.8 1.6 2.4 3.2 4
(Fuente: Manual de Prácticas de Bioquímica)
 Cuadro N°3: Espectro de absorción del Naranja de Metilo

400nm 420nm 440nm 460nm 480nm 500nm

%T 67.6% 60.4% 54.3% 51.2% 53.2% -
A 0.170 0.219 0.265 0.291 0.274 -
(Fuente: Manual de Prácticas de Bioquímica)

Cuadro N°4: Curva de calibración del Naranja de Metilo

TUBO N° BLANCO T1 T2 T3 T4 T5
Sol. Trabajo de
- 2 4 6 8 10 MUESTRA
NM stock (mL)
PROBLEMA
H 2 O destilada
10 8 6 4 2 -
(mL)
Absorbancia - 0.061 0.117 0.177 0.236 0.293 0.155
Concentración
(mg/mL)
- 8 x 10−4 1.6 x 10−3 2.4 x 10−3 3.2 x 10−3 4 x 10−3 X

mg% - 8 x 10−6 1.6 x 10−5 2.4 x 10−5 3.2 x 10−5 4 x 10−5

ug/mL - 0.8 1.6 2.4 3.2 4
mg/L ó ppm - 0.8 1.6 2.4 3.2 4
(Fuente: Manual de Prácticas de Bioquímica)

III. DISCUSIONES

AZUL DE BROMOFENOL

ESPECTRO DE ABSORCIÓN DEL AZUL BROMOFENOL: Cada curva tiene un determinado

punto de luz monocromática donde se produce la mayor absorción de la luz que incide sobre ella.
La curva que nos muestra la variación de absorbancia en función de diferentes longitudes de onda
es conocida como espectro de absorción y el pico más alto representa la longitud de onda de
máxima absorción o λ óptimo (Aliaga et al., 2017).

Por medio de un espectro de absorción se determina la longitud de onda (λ) óptima de absorción de
una sustancia dada. El espectro de absorción de una sustancia se obtiene midiendo la absorbancia de
la muestra a diferentes longitudes de onda; si se trabaja en el espectro visible, el rango de medición
es desde 400nm hasta 700nm (Mora, 2007). Para esto se usa el espectrofotómetro, se oprime ABS/
100%T para llevar el espectrofotómetro a cero de A (absorbancia), luego de esto se inserta la
muestra de concentración cero en un recipiente de dimensiones fijas, un tubo o una cubeta e
indicamos la longitud de onda (Harris, 2007).

En el caso del Azul de Bromofenol, usando el espectrofotómetro y seleccionando las longitudes de

onda (desde 520nm hasta 640nm), el equipo nos daba la absorbancia. Resultó que la máxima
absorbancia era de 0.323, cuya longitud de onda fue de 580nm.
PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN DEL COLORANTE AZUL DE
BROMOFENOL: La cantidad de luz absorbida por la muestra es directamente proporcional a la
concentración de la muestra (a mayor concentración mayor absorción y menor transmisión) y a la
longitud del cuerpo atravesado por el haz (ancho de la cubeta). Por lo tanto:

A = ε. c. l
A : Absorbancia. Proporción de luz absorbida= log I0 /I
ε : Coeficiente de extinción molar. Constante de proporcionalidad o absortividad
c : Concentración de la muestra
l : Diámetro de la cubeta. Longitud de trayectoria del haz (cm)
I0 : Intensidad de rayo incidente
I : Intensidad de rayo emergente (Mora, 2007)

Si en una experiencia de medición de absorbancia se mantienen constantes los parámetros (la

absortividad y el ancho de celda) entonces la absorbancia será proporcional a la concentración de la
solución. Es decir, a mayor concentración mayor absorbancia (Aliaga et al., 2017).
Existe una relación lineal entre absorbancia y concentración puesta por la ley de Beer con
concentraciones ascendentes de cada colorante leídas a una misma longitud de onda (λ óptimo), que
fue calculado anteriormente. En base a ese lambda óptimo se calculó la absorbancia con la ayuda
del espectrofotómetro, de las distintas concentraciones y la concentración teórica. Se demostró que
a medida que aumenta la absorbancia, también aumenta la concentración de la sustancia.

NARANJA DE METILO

El naranja de metilo y su ácido conjugado, por ser un indicador ácido-base, tienen diferentes
cromoforos y en consecuencia, absorben a diferentes longitudes de onda en la zona visible del
espectro. Los diferentes colores que presenta el compuesto permiten emplearlo para detectar un
cambio en la acidez de una disoluciones alrededor del valor de pH en que se protona y desprotona
(Ege, 2000). La máxima absorbancia de este colorante se obtuvo cuando el Lamba óptimo fue de
460nm, consiguiéndose una absorbancia de 0.291.
Teniendo como dato fijo la lambda óptima se procedió a calibrar a fin de hallar la absorbancia para
cada muestra, observándose un constante crecimiento en línea recta de la misma, comprobando de
esa forma la relación directamente proporcional de Concentración-Absorbancia.
El cálculo de la concentración de la alícuota se halla, gracias a la concentración inicial de la
solución stock, la cual atravesó por fases de preparación, en Solución Stock, luego Solución
Estándar y finalmente se preparó la Muestra Trabajo, o alícuota, complementándolo con Agua
Destilada, a fin de homogenizar el volumen de todas las alícuotas.

 Solución Stock, solución pura, con una concentración conocida.

 Solución Estándar, disolución de solución stock con otro solvente.
 Tubo de trabajo, o patrón, muestra de la solución Estándar con volumen fijo.
(Rocca, 2003)
IV. CONCLUSIONES

 Con la ayuda de un espectrofotómetro se puede calcular la absorbancia o la trasmitancia con un

lambda óptimo de absorción de una sustancia coloreada (longitud de onda).
 En base a las leyes de Lambert y Beer se demostró que la absorbancia es directamente
proporcional con las concentraciones ascendentes de cada colorante a un mismo λ, y su gráfica
describe una línea recta con pendiente positiva.
 Esquematizando la curva de calibración de soluciones colorantes de concentración desconocida,
se determinó gráficamente que la muestra de Azul de Bromofenol tiene una concentración de
0.0024 mg/mL, y la muestra de Naranja de Metilo tiene una concentración de 0.00215 mg/mL.

V. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
 Aliaga, P.; Jorge, P.; Kitazono, A.; Nieto, C. & Ríos, E. (2017). Manual de Prácticas de
Bioquímica. Universidad Nacional Agraria La Molina: Departamento Académico de
Química.
 Ege, S. (2002). Química Orgánica: Estructura y Reactividad. Editorial Reverté S.A.
 Harris, D. (2007). Análisis químico cuantitativo. Barcelona, España: Editorial Reverté, S.A.
 Mora, S. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Universidad
estatal a distancia San José.
 Olsen, E. (1990). Metodos Ópticos de Análisis. Barcelona: Editorial Reverté S.A.
 Rocca, P. (2003). Bioquímica, Técnicas y Métodos. España: Editorial Hélice.