TEMA 4 TECNICAS ANALITICAS

RELACIONADAS CON LAS

PROTEINAS

1. Introducción
Las proteínas son polímeros de aminoácidos.
En las proteínas podemos encontrar hasta veinte tipos diferentes de aminoácidos.
Las proteínas se diferencian entre sí según el tipo, número y secuencia de aminoácidos
que forman el esqueleto del polipéptido. Como resultado, tienen diferentes estructuras
moleculares y propiedades físico-químicas. Las proteínas son componentes importantes
de alimentos para una serie de razones diferentes.
Son una fuente importante de energía, así como de aminoácidos esenciales (lisina,
triptófano, metionina, leucina, isoleucina y valina). Muchas proteínas son enzimas que
son capaces de aumentar la velocidad de las reacciones bioquímicas.
A continuación veremos las principales técnicas analíticas empleadas en el estudio de la
concentración total, el tipo, la estructura molecular y propiedades funcionales de las
proteínas.

2. Determinación de la concentración de proteína

total

2.1. El método Kjeldahl

Por lo general se considera que es el método estándar para determinar la concentración
de proteína. Debido a que el método de Kjeldahl no mide el contenido de proteínas
directamente, es necesario un factor de conversión (F) para convertir la concentración de
nitrógeno medido ,en una concentración de proteínas. Un factor de conversión de 6,25
(equivalente a 0,16 g de nitrógeno por gramo de proteína) se utiliza para muchas
aplicaciones, sin embargo, esto sólo es un valor medio, y cada proteína tiene un factor
de conversión diferente, dependiendo de su composición de aminoácidos. El método
de Kjeldahl convenientemente se puede dividir en tres etapas: la digestión, la
neutralización y titulación.
La digestión
La muestra de alimento a analizar se pesa en un matraz de digestión y es digerido por
calentamiento en presencia de ácido sulfúrico (un agente oxidante que digiere los
alimentos), sulfato de sodio anhidro (para acelerar la reacción al aumentar la
temperatura de ebullición) y un catalizador, como el cobre, selenio, titanio, o el
mercurio (para acelerar la reacción). La digestión convierte cualquier nitrógeno de los
alimentos (excepto los que se encuentra en forma de nitratos o nitritos) en amoniaco, y
otras materias orgánicas de C0 2y H 20. El gas de amoníaco no es liberado en una
solución ácida debido a que el amoniaco es en forma de ion amonio (NH 4+)
que se unea los iones de sulfato (SO 42 -) y por lo tanto permanece en solución.

Neutralización

Después de que la digestión se ha completado, el matraz de digestión se conecta a un

matraz receptor por un tubo. La solución en el matraz de digestión se hace entonces
alcalina mediante la adición de hidróxido de sodio, que convierte el sulfato de amonio
en gas amoníaco.
El gas amoniaco que se forma se libera de la solución y se mueve fuera del matraz de
digestión y en el matraz de recepción - que contiene un exceso de ácido bórico-. El bajo
pH de la solución en el matraz receptor convierte el gas amoníaco en el ion amonio, y al
mismo tiempo convierte el ácido bórico en ion borato.

Valoración

El contenido en nitrógeno entonces se calcula mediante una valoración de

borato con el ácido sulfúrico o clorhídrico estándar, utilizando un indicador
adecuado para determinar el punto final de la reacción.
La concentración de iones hidrógeno (en moles) requerido para alcanzar el punto final
es equivalente a la concentración de nitrógeno que estaba en el alimento original.
Una vez que el contenido de nitrógeno se ha determinado que se convierte en
un contenido de proteínas utilizando el factor de conversión: Proteína = % F% N.

Ventajas y desventajas

Ventajas. El método de Kjeldahl es ampliamente utilizado a nivel internacional y sigue

siendo el método estándar para la comparación con otros métodos. Su universalidad,
alta precisión y buena reproducibilidad han convertido en el principal método para la
estimación de la proteína en los alimentos.
Desventajas. No da una medida de la proteína verdadera, ya que todo el nitrógeno en
los alimentos no es en forma de proteínas. Las diferentes proteínas necesitan diferentes
factores de corrección debido a que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. El uso
de ácido sulfúrico concentrado a las altas temperaturas supone un riesgo considerable, al
igual que el uso de algunos de los posibles catalizadores La técnica dura mucho tiempo.

2.2. Mayor Dumas método

Es una técnica instrumental automatizada que se ha desarrollado recientemente que es capaz

de medir rápidamente la concentración de proteínas de muestras de alimentos. Esta

técnica se basa en un método descrito por primera vez por un científico llamado Dumas, hace

más de un siglo y medio . Se está empezando a competir con el método de

Kjeldahl como el método estándar de análisis de las proteínas de algunos alimentos

debido a su rapidez.

Principios generales

Una muestra de masa conocida se quema a una temperatura alta (900 °C) en la cámara mufla

con presencia de oxígeno. Esto conduce a la liberación de CO2,H 2O y N 2.

El CO 2y H 2O se eliminan al pasar los gases por columnas especiales que los absorbe. El

contenido de nitrógeno se mide haciendo pasar los gases restantes a través de una

columna que tiene un detector de conductividad térmica en el extremo. La columna

ayuda a separar el nitrógeno de cualquier residuo de CO 2y H 2O que han permanecido

en la corriente de gas. El instrumento se calibra mediante el análisis de un material que

es puro y tiene una concentración de nitrógeno conocidos, tales como EDTA (= 9,59%

N). Así, la señal del detector de conductividad térmica se puede convertir en un

contenido de nitrógeno. Al igual que con el método de Kjeldahl es necesario un factor de

conversión para convertir y obtener la concentración de nitrógeno de una muestra

Tambien aquí los factores de conversión adecuados, dependen de la secuencia de

aminoácidos de la proteína .

Ventajas y desventajas

Ventajas: Es mucho más rápido que el método de Kjeldahl (menos de 4 minutos por

cada medición, en comparación con 1.2 horas para Kjeldahl). No necesita productos

químicos tóxicos o catalizadores. Muchas muestras se pueden medir de forma

automática. Es fácil de usar.

Desventajas: Alto costo inicial. No da una medida de la proteína verdadera, ya que

todo el nitrógeno en los alimentos no esta en forma de proteínas. Las diferentes proteínas

necesitan diferentes factores de corrección debido a que tienen diferentes secuencias de

aminoácidos. El tamaño de la muestra hace que sea difícil obtener una muestra
representativa.

2.3. Los métodos que utilizan espectroscopía UV-visible

Un gran número de métodos se han ideado para medir la concentración de proteína, que se

basan en la espectroscopia UV-visible. Estos métodos son capaces de utilizar la capacidad

natural que tienen las proteínas, para absorber (o dispersar) la luz, en la región UV-visible del
espectro electromagnético, o química o modificar físicamente de las proteínas para hacerlas

absorber (o dispersar) la luz en esta región. El principio básico detrás de cada una de

estas pruebas es similar. En primer lugar se prepara una curva de calibración de absorbancia
(oturbidez) en comparación con la concentración de proteínas a partir de una

serie de soluciones de proteínas de concentración conocida. La absorbancia (o turbidez)

de la solución que se analiza se mide en la misma longitud de onda, y la concentración

de proteína, se determina a partir de la curva de calibración. La principal diferencia entre

las pruebas son los grupos químicos que son responsables de la absorción o dispersión

de la radiación, por ejemplo, los enlaces peptídicos, aromáticos grupos secundarios,

grupos de base y agregados de proteínas.

Algunos de los métodos mas comúnmente utilizados UV-visible para la

determinación del contenido en proteínas de los alimentos, se citan a continuación:

Medición directa a 280 nm

El Triptófano y la tirosina absorben la luz ultravioleta fuertemente a 280 nm. El contenido

de tirosina y triptófano de muchas proteínas se mantiene bastante constante, por lo que

la absorbancia de las soluciones de la proteína en 280 nm puede ser utilizado para

determinar su concentración. Las ventajas de este método son que el procedimiento es

sencillo de realizar, que no es destructiva, y no se requieren reactivos especiales. La

principal desventaja es que los ácidos nucleicos también absorben fuertemente a 280

nm, por lo que podría interferir con la medición de la proteína si están presentes en

concentraciones suficientes. A pesar de ello, se han desarrollado métodos para superar

este problema, por ejemplo, midiendo la absorbancia a dos longitudes de onda

diferentes. 260 y 280 y calcular su cociente.

Método de Biuret

Un color violeta se produce cuando los iones de cobre (Cu 2 +) interactúan con

los enlaces peptídicos en condiciones alcalinas. El reactivo de biuret, que contiene

todos los productos químicos necesarios para llevar a cabo el análisis, se puede

adquirir comercialmente. Se mezcla con una solución de proteínas y luego se deja

reposar durante 15-30 minutos antes de que se lee la absorbancia a 540 nm. La

principal ventaja de esta técnica es que no hay interferencia con materiales que absorben

a menores longitudes de onda, y la técnica es mas sensible para proteínas totales, ya que

utiliza la absorción de participación de los enlaces peptídicos que son comunes a todas

las proteínas, en lugar de los grupos secundarios específicos. Sin embargo, tiene una

sensibilidad relativamente baja en comparación con otros métodos visible-UV.

Método de Lowry

El método de Lowry combina el reactivo de biuret con otro reactivo (el Ciocalteau

fenol reactivo Folin-), que reacciona con los residuos de tirosina y triptófano en las

proteínas. Esto le da un color azulado que puede ser leído en alguna parte entre 500 -

750 nm en función de la sensibilidad necesaria. Hay un pequeño pico alrededor de 500

nm que se pueden utilizar para determinar las altas concentraciones de proteínas y un

gran pico alrededor de 750 nm que se pueden utilizar para determinar las proteínas en bajas

concentraciones. Este método es más sensible a bajas concentraciones de proteínas que

el método de biuret.

Métodos de tinción

Se agrega un exceso de un colorante conocido con carga negativa (aniónicos) a una

solución de proteína cuyo pH se ajusta de modo que las proteínas tienen carga positiva

(es decir, <el punto isoeléctrico). Las proteínas forman un complejo insoluble con el

colorante, debido a la atracción electrostática entre las moléculas, pero el colorante no

unido permanece soluble. El colorante se une a los grupos catiónicos

de aminoácidos básicos (histidina, lisina y arganina) y deja libres a los grupos

amino terminales. La cantidad de colorante no consolidado que queda en solución

después de formarse el complejo insoluble proteína-colorante se elimina (por ejemplo, por

centrifugación) y se determina midiendo su absorbancia. La cantidad de proteína presente

en la solución original es proporcional a la cantidad de colorante que se une al colorante

Turbidimetria

Las moléculas de proteínas que normalmente son solubles en una solución, se puede hacer

precipitar mediante la adición de ciertos productos químicos, por ejemplo, el ácido

tricloroacético. La precipitación de proteínas hace que la solución sea turbia. Así, la

concentración de proteínas se puede determinar midiendo el grado de turbidez.

Ventajas y desventajas

Ventajas: Las técnicas UV-visible son bastante rápidos y simples de realizar, y son

sensibles a concentraciones bajas de proteínas.

Desventajas: Para la mayoría de las técnicas visible-UV, es necesario utilizar

dilución y soluciones transparentes, que no contengan sustancias contaminantes que

absorban o dispersen la luz en la misma onda que la proteína que se analiza. La

necesidad de soluciones transparentes significa que la mayoría de los alimentos deben

someterse a una buena y meticulosa preparación de la muestra antes de que pueda

ser analizada, por ejemplo, la homogeneización, extracción por solvente,

centrifugación, filtración, …..que pueden ser lentas y laboriosas. Además, a veces es difícil de

extraer cuantitativamente las proteínas de determinados tipos de alimentos,

especialmente después de haber sido procesada de manera que las proteínas se agregen

por enlaces covalentes con otras sustancias. Además, la absorción depende del tipo de

proteínas analizadas (diferentes proteínas tienen diferentes secuencias de aminoácidos).

2.4. Otras Técnicas Instrumentales

Hay una gran variedad de diferentes métodos instrumentales disponibles para la

determinación del contenido de proteína total de productos alimenticios. Éstos se

pueden dividir en tres categorías diferentes de acuerdo a sus principios fisicoquímicos:

(i) la medición de propiedades físicas por peso

(ii) medición de la absorción de la radiación,
 (iii) la medición de la dispersión de la radiación.

Cada uno de los métodos clásicos tiene sus propias ventajas y desventajas, y un rango de
alimentos a los que se puede aplicar.

La medición de propiedades físicas por peso

• Densidad: La densidad de una proteína es mayor que la de la mayoría de los

componentes de otros alimentos, y así se produce un aumento en la densidad de

un alimento cuando aumenta su contenido de proteínas. Así, el contenido de

proteínas de los alimentos puede ser determinada mediante la medición de su

densidad.

• Índice de refracción: El índice de refracción de una solución acuosa aumenta con la

concentración de proteínas y por lo tanto las mediciones de RI puede

ser usadoas para determinar el contenido de proteína.

La medición de la adsorción de las Radiaciones :

• UV-visible: La concentración de proteínas se puede determinar midiendo la

absorbancia de la radiación ultravioleta-visible (véase más arriba).

• Infrarrojos: técnicas de infrarrojo se puede utilizar para determinar la

concentración de las proteínas en muestras de alimentos. Las proteínas absorben IR

natural debido a las vibraciones características (estiramiento y flexión) de

determinados grupos químicos de los enlaces peptídico a lo largo de la “columna vertebral” del

polipéptido. Las mediciones de la absorción de la radiación en ciertas

longitudes de onda por lo tanto puede ser utilizadas para cuantificar la

concentración de proteína en la muestra. IR es particularmente útil para un

análisis rápido del contenido de proteínas. También requiere poca preparación

de la muestras y no es destructiva. Sus principales desventajas son su alto

costo inicial y la necesidad de calibración costosa.

• Resonancia Magnética Nuclear: La espectroscopía de RMN se pueden utilizar

para determinar la concentración total de proteínas de los alimentos. El

contenido de proteína se determina midiendo el área bajo un pico en un rango de

espectros de RMN químicas que corresponde a la fracción proteica.

Medida de la dispersión de la radiación

• De dispersión de luz: La concentración de agregados de proteínas en solución

acuosa se puede determinar utilizando técnicas de dispersión de la luz debido a

la turbidez de una solución , la cual es directamente proporcional a la concentración de

los agregados presentes.

• La dispersión por ultrasonidos: La concentración de agregados de proteínas

también se puede determinar utilizando técnicas de dispersión por ultrasonidos,

porque la velocidad ultrasónica y la absorción de la ecografía se relacionan con

la concentración de agregados proteicos presentes.

Ventajas y desventajas

Algunos de estos métodos instrumentales tienen grandes ventajas sobre las otras

técnicas mencionadas anteriormente, ya que no son destructivas, requieren poca o

ninguna preparación de la muestra, y las mediciones son rápidas y precisas. Una

desventaja importante de las técnicas que se basan en mediciones de propiedades físicas

de la mayor parte de los alimentos, es que la curva de calibración debe estar preparada

entre la propiedad física de interés y el contenido de proteína total, y esto puede

depender del tipo de proteína y la la matriz dentro de la que se encuentra. Además,

las técnicas basadas en las mediciones de las propiedades físico-químicas por peso sólo

se puede utilizar para analizar los alimentos con composiciones relativamente simples.

En un alimento que contenga muchos componentes diferentes, cuya concentración puede

Variar, es difícil separar la contribución que hace la proteína a la medición global de la

de los otros componentes.

2.5. Comparación de los métodos de cuantificación de proteinas

Como científicos sabemos que a menudo se puede estar en una posición donde

tenemos que elegir una determinada técnica para medir la concentración de la proteína

de un alimento.

¿Cómo decidir qué técnica es la más apropiada para nuestra aplicación

en particular? Lo primero que debe determinar es para que tipo de información va a ser
utilizada. Si el análisis se llevará a cabo con fines oficiales, por ejemplo, legales o

de los requisitos de etiquetado, es importante utilizar un método reconocido

oficialmente. El método de Kjeldahl, y cada vez más el método de Dumas, han sido

autorizados oficialmente para una amplia gama de aplicaciones en alimentos. En

contraste, sólo un pequeño número de aplicaciones de la espectroscopia de UV-visible

han sido reconocidas oficialmente.

A efectos de control de calidad, a menudo es más útil contar con medidas rápidas y

sencillas de contenido de proteínas y por lo tanto las técnicas de IR son las más

adecuados. Para los estudios fundamentales en el laboratorio, donde las proteínas puras

se han analizado, las técnicas de espectroscopía visible-UV ,son las mas usadas

porque dan mediciones rápidas y fiables, y son sensibles a concentraciones bajas de

proteína.

Otros factores que pueden tenerse en cuenta son la cantidad de preparación de

la muestra requerida, su sensibilidad y su velocidad. El Kjeldahl, Dumas y los métodos

de IR requieren de muy poca preparación de muestra. Después de seleccionar una muestra

representativa de los alimentos, por lo general se pueden ejecutar estas tecnicas

directamente. Por otra parte, los distintos métodos de UV-visible, requieren una preparación de

la muestra antes del análisis. La proteína debe ser extraída de los alimentos en una

solución diluida transparente, que generalmente implica mucho tiempo de

homogeneización, extracción, filtración de disolventes y los procedimientos de

centrifugación. Además, puede ser difícil de aislar por completo algunas proteínas de

los alimentos, ya que están fuertemente ligadas a otros componentes. Las diversas

técnicas también tienen sensibilidades diferentes, es decir, varia la menor o mayor

concentración de proteínas que se pueden detectar con cada tecnica. Los métodos UV-visible

son los más sensibles, siendo capaces de detectar concentraciones de proteína tan bajas

como 0,001% en peso.

La sensibilidad de los Dumas, Kjeldahl y métodos de IR es de alrededor de 0,1% en peso.

El tiempo requerido por el análisis, y el número de muestras que se pueden ejecutar al

mismo tiempo, son también factores importantes a considerar al decidir qué técnica de

análisis utilizar. Las técnicas de infrarrojos son capaces de un análisis rápido (menos de 1

minuto) de la proteína, una vez que han sido calibrados. El método de Dumas actualmente
es totalmente automático y se puede medir la concentración de proteínas de una muestra en

menos de 5 minutos, en comparación con el método de Kjeldahl que toma entre 30 minutos y 2

horas para llevar a cabo.

Los métodos UV-visible-varios oscilan entre un par de minutos a una hora (dependiendo del

tipo de colorante que se utiliza y cuánto tiempo tarda en reaccionar), aunque tiene la

ventaja de que muchas muestras se pueden ejecutar simultáneamente. Sin embargo,

suele ser necesario llevar a cabo una amplia preparación de muestra antes del

análisis con el fin de obtener una solución transparente. Otros factores que pueden ser

importantes al seleccionar una técnica apropiada son: el equipo disponible, facilidad de

uso, la precisión deseada, y si la técnica es o no destructiva.

3. Separación y Caracterización de la proteína

En el punto anterior, se vieron las técnicas utilizadas para determinar la concentración total

de proteína en un alimento. Los analistas de alimentos se han interesado

también en el tipo de proteínas presentes en un alimento, no solo en la cantidad, ya que cada

proteína tiene propiedades nutricionales y fisicoquímicas diferentes.

El tipo de proteína es determinada generalmente por la separación y aislamiento de las

proteínas individuales de una mezcla compleja de proteínas, de modo que puedan ser

posteriormente identificadas y caracterizadas . Las proteínas son separadas en base a las

diferencias en sus propiedades fisicoquímicas, como el tamaño, la carga, las características de

laadsorción, la solubilidad y estabilidad térmica.

La elección de una técnica de separación adecuada depende de una serie de factores,

incluyendo las razones para llevar a cabo el análisis, la cantidad de muestra disponible, la

pureza deseada, el equipo disponible, el tipo de proteínas presentes y el costo.

Los métodos a gran escala son los elegidos para los aislamientos en crudo de grandes

cantidades de proteínas, mientras que los métodos a pequeña escala están disponibles para

las proteínas que son caras o sólo están disponibles en pequeñas cantidades. Uno de los

factores que deben ser considerados durante el proceso de separación es la posibilidad de que

la estructura nativa tridimensional de las moléculas de proteína, pueda estar alterada.

Un conocimiento previo de los efectos de las condiciones ambientales en la estructura

de la proteína y sus interacciones, es extremadamente útil cuandohay que selecciónar la

técnica de separación más apropiada. En primer lugar, porque ayuda a determinar las

condiciones más adecuadas a emplear para aislar una proteína particular de una mezcla

de proteínas (por ejemplo, pH, fuerza iónica, temperatura, etc disolvente.), Y en

segundo lugar, porque puede ser importante para elegir las condiciones que

afectan negativamente a la estructura molecular de las proteínas.

3.1. Métodos basados en diferentes características de solubilidad

Las proteínas se pueden separar por las diferencias entre su solubilidad en

soluciones acuosas. La solubilidad de una molécula de proteína está determinada por su

secuencia de aminoácidos, ya que esto determina su tamaño, forma, hidrofobicidad y la

carga eléctrica. Las proteínas pueden ser selectivamente precipitadas o solubilizadas

mediante la alteración del pH, fuerza iónica, constante dieléctrica o la temperatura de

una solución. Estas técnicas de separación son los más sencillas de utilizar, cuando tenemos

grandes cantidades de muestra, porque son relativamente rápidas, baratas y no están

particularmente influenciada por otros componentes de los alimentos.

A menudo se utilizan como el primer paso en cualquier proceso de separación debido a

que la mayoría de los materiales contaminantes se puede quitar fácilmente.

Precipitacion proteínas con sulfato amónico

Algunas proteínas son más solubles en agua que otras. Si una proteína tiene regiones más

hidrofílicas ("que aman el agua"), serán más solubles que unas que sean más hidrofóbicas

("temerosas al agua"). A medida que aumenta la concentración de sal, las proteínas

hidrofóbicas menos solubles y más solubles precipitarán primero. Las proteínas estrechamente

relacionadas no se pueden separar por precipitación salina, porque van a precipitar a

aproximadamente la misma concentración de sal, pero las que tienen estructuras y

características muy diferentes a menudo se pueden separar de esta manera.

El sulfato de amonio es la sal más popular para este procedimiento, ya que tiene muy alta

solubilidad en agua, incluso a temperaturas muy bajas. Normalmente, deseas mantener tu

solución fría para inhibir la actividad de las proteasas, proteínas que cortan a otras proteínas.
La concentración de sal se describe generalmente por el porcentaje de saturación, donde el

25% es el 25% de saturación (la concentración a la que no se puede disolver más sal).

Por lo general, se añade la sal gradualmente a la solución de proteína mientras se agita con

rapidez (un agitador magnético es muy útil para este tipo de procedimiento). La solución se

centrifuga, lo que hace que algunas de las proteínas se precipiten. A menudo este

procedimiento se divide en varios pasos. Es posible, por ejemplo, comenzar con 25% de

saturación (un recorte del 25%), y luego ir a un corte de 75%. Este proceso permite dividir las

proteínas en tres grupos, las que precipitan a 25%, las que precipitan a 75% y las que se

precipitan en el medio.

La salazón supondrá una pérdida de la proteína que deseas aislar. Cada proteína tiene su

propia curva de solubilidad, la solubilidad de la proteína como una función de la concentración

de soluto ("fuerza iónica"). Por consiguiente, incluso si el aumento de la concentración de sal es

insuficiente para precipitar la totalidad de la proteína de interés, todavía se puede precipitar

algo de ella. Por otra parte, no se puede utilizar la salazón para aislar una proteína específica,

ya que otras proteínas se precipitan junto con ella. Por lo general, la salazón es sólo el primer

paso de un proceso de purificación de proteínas.

La precipitación isoeléctrica

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH donde la carga neta de la proteína es

cero. Las proteínas tienden a agregarse y precipitar a su pI porque no hay repulsión

electrostática para mantenerlos separadas. Las proteínas tienen diferentes puntos

isoeléctricos segun sus secuencias de diferentes aminoácidos (por ejemplo,su relación

de grupos aniónicos y catiónicos), y por lo tanto pueden ser separados por el

ajuste del pH de una solución. Cuando se ajusta el pH a la pi de una proteína particular,

se precipita dejando a las otras proteínas en solución.

 Fraccionamiento por solvente

La solubilidad de una proteína depende de la constante dieléctrica de la solución que lo

rodea, porque esto altera la magnitud de las interacciones electrostáticas entre los

grupos de cargas. Es fácil ver como la constante dieléctrica de una solución reduce la magnitud

de las interacciones electrostáticas entre las distintas especies . Esto tiende a reducir la

solubilidad de las proteínas en solución, ya que estan menos ionizadas,

y por lo tanto la repulsión electrostática entre ellas no es suficiente para evitar la

agregación. La constante dieléctrica de las soluciones acuosas se puede reducir

mediante la adición de disolventes orgánicos solubles en agua, como el etanol o

acetona. La cantidad de disolventes orgánicos necesarios para causar la precipitación

depende de la proteína y por lo tanto las proteínas se pueden separar en base a esto . La

cantidad óptima de disolventes orgánicos necesarios para precipitar una proteína varía

de 5 a 60%.

El fraccionamiento por solvente se realiza generalmente a 0 º C o menos, para

evitar la desnaturalización de proteínas, causada por el aumento de la temperatura que se

producen cuando los solventes orgánicos se mezclan con agua.

La desnaturalización de las proteínas contaminantes

Muchas proteínas se desnaturalizan y precipitado de una solución cuando esta se calienta por

encima de cierta temperatura o mediante el ajuste de una solución a pH muy ácido o

básico. Las proteínas que son estables a altas temperaturas o en los extremos de pH, son

más fáciles de separar por esta técnica debido a que las proteínas contaminantes pueden

ser precipitadas, mientras que la proteína de interés se mantiene en solución.

3.2. Separación por adsorción

La cromatografía de adsorción consiste en la separación selectiva de los compuestos por

adsorción-desorción en una matriz sólida que se encuentra dentro de una columna a

través de la cual pasa la mezcla. La separación se basa en las afinidades diferentes de

diferentes proteínas de la matriz sólida. Afinidad y cromatografía de intercambio iónico

son los dos principales tipos de cromatografía de adsorción de uso general para la
separación de las proteínas. La separación puede llevarse a cabo utilizando una

columna abierta o de alta presión de cromatografía de líquidos.

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico se basa en la adsorción reversible-desorción, de

iones en la solución de una matriz polimérica sólida . Esta técnica es la

técnica de cromatografía de uso mas común para la mayoría de separación de proteínas. Si la

matriz tiene carga positiva se llama un intercambiador de aniones, ya que a ella se unen iones

cargados negativamente (aniones). Si la matriz tiene carga negativa se llama intercambiador

catiónico porque se une iones cargados positivamente (cationes). Las

condiciones (pH y fuerza iónica) se ajustan a favor de la máxima unión de la proteína de

interés a la columna de intercambio iónico. Las proteínas contaminantesse unen

con menos fuerza y por lo tanto pasan más rápidamente a través de la columna. La

proteína de interés se eluye con otra solución tampón que favorece la desorción de la

columna ( por ejemplo, pH o fuerza iónica).

3. 4 Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad utiliza una fase estacionaria que consta de un ligando unido

covalentemente a un soporte sólido. El ligando es una molécula que tiene una afinidad

altamente específica para una proteína en particular. La muestra a

analizar se pasa a través de la columna y la proteína de interés se une al ligando,

mientras que las proteínas contaminantes pasan directamente a través. La proteína de

interés, a continuación se eluye con una solución tampón que favorezca la

desorción de la columna. Esta técnica es el medio más eficaz de separar una proteína

individual de una mezcla de proteínas, pero es el más caro, debido a la necesidad de

tener columnas con ligandos específicos para cada proteina.

Tanto la cromatografía de afinidad como de intercambio iónico, se usan comúnmente para

separar las proteínas y aminoácidos en el laboratorio. Se utilizan con menos frecuencia

para las separaciones comerciales porque no son adecuados para la rápida separación de
grandes volúmenes y son relativamente caros.

3.5. Separación Debido a las diferencias de tamaño

Las proteínas también pueden ser separados de acuerdo a su tamaño. Normalmente, los

pesos moleculares de las proteínas varían de cerca de 10.000 a 1.000.000 daltons. En la

práctica, la separación depende del radio de Stokes de una proteína, en lugar de

hacerlo directamente de su peso molecular. El radio de Stokes es el radio promedio de

una proteína que tiene en la solución, y depende de su estructura de tres dimensiones

moleculares. Para las proteínas con el mismo peso molecular aumenta el radio de

Stokes en el siguiente orden:

compacto <proteína globular <bastón (proteína flexible).

Diálisis

La diálisis se utiliza para separar las moléculas en solución mediante el uso de

membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas más pequeñas de un

determinado tamaño a través de ella , pero impide el paso de moléculas más grandes. Una

solución de la proteína se coloca en el tubo de diálisis que se sella y se coloca en un

gran volumen de agua o buffer que se agita lentamente. Las moléculas de peso molecular bajo

fluyen a través de la bolsa, pero las moléculas de proteína de alto peso molecular

permanecen en la bolsa. La diálisis es un método relativamente lento, necesitándose un

máximo de 12 horas para ser completada. Por tanto, es más frecuente en el laboratorio.

La diálisis se utiliza a menudo para eliminar la sal de las soluciones de la proteína

después de haber sido separados por precipitación salina.

Ultrafiltración

Una solución de la proteína se coloca en una celda que contiene una membrana

semipermeable, y se aplica presión . Las moléculas más pequeñas pasan a través de la

membrana, mientras que las moléculas más grandes permanecen en la solución. El

principio de separación de esta técnica es por tanto similar a la diálisis, pero

se aplica presión para la separación, porque es mucho más rápido. Las membranas

semipermeables están disponibles para varios volúmenes (entre 500 y 300 ml).
La parte de la solución que se mantiene por la membrana (moléculas grandes) se llama

retenidas , mientras que la parte que pasa a través de la membrana (moléculas pequeñas)

forma parte del ultrafiltrado.

La ultrafiltración se puede utilizar para concentrar una solución de proteína, eliminar las

sales , o fraccionar las proteínas en base a su tamaño.

Las unidades de ultrafiltración se utilizan en el laboratorio y a escala comercial.

Cromatografía de exclusión

Esta técnica, conocida a veces como filtración en gel, también separa las proteínas

según su tamaño. Una solución de la proteína se vierte en una columna que está llena

de granos porosos hechos de un material polimérico (por ejemplo,

dextrano o agarosa). las moléculas más grandes que los poros

se mueven rápidamente a través de la columna, mientras que el movimiento

de las moléculas que entran en los poros se retrasa. Así, las moléculas se eluyen de la

columna en orden decreciente de tamaño. Asi se usan polímeros de diferentes poros

para separar las proteínas de diferentes pesos moleculares. Los fabricantes de

estos polímeros proporcionan información sobre el rango de peso molecular

más adecuados para su correcta separación. Los pesos moleculares de proteínas

desconocidas se puede determinar mediante la comparación de sus volúmenes de elución con

los que tiene las proteínas de peso molecular conocido: una grafica de

volumen de elución frente a log (peso molecular), debe dar una línea recta. Un

problema que existe con este método, es que el peso molecular no está directamente

relacionadocon el radio de Stokes para proteínas de formas diferentes .

3.6 Separación por electroforesis

Electroforesis de zona: las proteínas son moléculas anfóteras: su carga neta depende del pH
del medio. Normalmente, la separación electroforética de proteínas se hace a pH alcalino, en el
que la mayoría de las proteínas presentan una carga global negativa. También, se puede
trabajar a pH ácidos, pero no demasiado bajos, ya que las proteínas precipitan en medio ácido
(básicamente se usa en la detección de variantes de la hemoglobina).

Como medio de soporte se puede usar (de más antiguo a más reciente): papel, acetato de
celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se
quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial
durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o
menos en función de su carga (que también determina hacia qué polo se dirigirá la proteína,
ánodo (+) o cátodo (-) y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de
migración.

Isoelectroenfoque: en lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se

separan en función de su punto isoeléctrico (pI): el pI es el pH en el que la carga neta de la
proteína es nula, y depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un
gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará
hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre,
isoelectroenfoque).

También se suelen utilizar acoplados a zimogramas si deseamos determinar el pI de una

enzima o en electroforesis bidimensional como primera dimensión.

Separación por tamaño: permite separar proteínas y ácidos nucleicos. En el caso de las
proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y
todas migren hacia el ánodo (no es necesario hacer eso con los ácidos nucleicos, ya que
tienen carga negativa); la separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un
tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas corran más que las más
grandes.

Una vez separadas las proteínas, deben fijarse y teñirse para poder ser visualizadas. Hay
diferentes protocolos en función de lo que se quiere estudiar: fijación por calor o química y
tinción en caso de estudios no específicos (proteinograma y electroforesis Hb, por ejemplo) o
fijación mediante anticuerpos previa a la tinción en caso de estudiar proteínas específicas
(inmunofijación).

Por lo general para la tinción de geles de poliacrilamida se utiliza tinción con plata, tinción de
Coomassie o tinción fluorescente. Dependiendo del fin de nuestro análisis. La tinción con plata
no es utilizada si se desean hacer análisis por espectrometría de masas (MS) pero es más
sensible que la tinción con Azul de Coomassie, por otro lado, la tinción fluorescente es muy
sensible y compatible con MS pero los costos de tinción son elevados.

Una tinción sensible y barata es la denominada "Blue Silver" o Coomassie G250.

Además, esta tinción es compatible con MS. Está compuesta por azul de coomassie diluido en
una solución coloidal y se utiliza agua destilada para destiñir el gel de poliacrilamida.

Pueden analizarse las proteínas contenidas en diferentes líquidos biológicos: sangre, plasma
(el líquido sanguíneo sin células), suero (plasma sin fibrinógeno), orina, LCR, líquido sinovial,
saliva, lágrimas. Así como alimentos, especialmente lácteos y cereales.

Este tipo de análisis electroforético tiene aplicaciones en investigación y en clínica, tanto

humana como animal. Además es una técnica muy empleada para el análisis de proteínas
alimentarias y últimamente se empleando para realizar genotipado y detección de OMG
(organismos modificados genéticamente)