PRÁCTICA N°2

ESTERILIZACIÓN, SIEMBRA E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

EN LA YUCA Y CHOCLO.

INTEGRANTES:
MAYRA ANGUISACA, NELLY ALLI , DIEGO DUY, JESSICA MUÑOZ
I PARTE
EMPAQUETADO Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL
1. INTRODUCCIÓN
El autoclave es un dispositivo utilizado para esterilizar material médico o de laboratorio se
colocan dentro de un dispositivo parecía a un vaso en el cual se eleva la temperatura a 121°C
y se aplica vapor a presión. Todo hospital debe contar con un sistema de esterilización donde
se realice lavado, desinfección y esterilización de todos los elementos necesarios para el
cuidado del paciente.
Este dispositivo surge de la necesidad de inactivar todo agente patógeno que pudiese
ocasionar al paciente enfermedades o infecciones posquirúrgicas.
Como solución se transforma la olla a presión tiene el perfecto principio del autoclave (es un
recipiente herméticamente cerrado que permite la esterilización por presión y vapor) que
permite la asepsia de los alimentos; Para convertirlo en un Autoclave para esterilizar material
médico y de laboratorio

2. OBJETIVO
Conocimiento sobre el procedimiento de empaquetado de materiales de uso en el Laboratorio
de Microbiología, así como también el proceso de esterilización.

3. MARCO TEÓRICO
Historia
La primera olla a presión fue inventada por Denis Papin en 1679, este invento no perduró en
el tiempo debido a las imperfecciones de las válvulas de seguridad que causaron graves
accidentes e incluso la muerte. Sin embargo este invento llegaría a ser el precursor de algo
más. El autoclave.
En 1820, M. Lemare, reveló un nuevo dispositivo de cocción que en realidad era el mismo
digestor de vapor de Papin con pequeñas modificaciones. Lemare lo llamó autoclave. Debido
a su falta de seguridad, muchas personas resultaron gravemente heridas o muertas por el
dispositivo mientras preparaban la comida.
En 1879 el microbiólogo francés Charles Chamberlain quien trabajó con el famoso Louis
Pasteur en sus investigaciones sobre la esterilización y pasteurización, reformó el digestor u
autoclave para convertirlo en un dispositivo médico y científico útil.
El Inventó el filtro Chamberlain que consistía en una pequeña barra de porcelana con
orificios más pequeños que las bacterias, al verter el líquido a través de el, las bacterias
quedan retenidas.
Actualmente el modelo más usado es el de Chamberlain.
Esteriliza a 120ºC a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el
material durante 20 a 30 minutos.
Equipo
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte
inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica. La caldera se
cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o
charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor
en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que
funciona por contrapeso o a resorte.

Precauciones
Antes de comenzar el proceso de esterilización es necesario remover todo el aire de la cámara
del autoclave.
El tiempo de esterilización se debe comenzar a contar una vez que se han alcanzado los
121ºC en la cámara interna del autoclave.
Si se van a esterilizar materiales tales como instrumentos quirúrgicos, equipos, etc. no se
deben cubrir con materiales impermeables al agua.
Para controlar la esterilización por vapor a presión se emplean indicadores físicos tales como
medidores de presión, termómetros, o termógrafos.
Entre los indicadores biológicos más utilizados para controlar el proceso de esterilización por
vapor a presión, se encuentran las esporas de Bacillus stearothermophilus que son altamente
resistentes a este proceso.
Se recomienda el uso de controles biológicos por lo menos una vez a la semana para verificar
el buen funcionamiento del autoclave.

PROCEDIMIENTO
Empaquetado del Material
1.- Lavado del material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente, enjuaga
con abundante agua de la llave y en seguida con agua destilada.
2.- Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado.
3.-Empaca el material correctamente.

4. MATERIAL
Pipetas de 10 ml.
Cajas de Petri
Medios de cultivo
Papel de Empaque
Papel aluminio
Cinta Masking

5. DESARROLLO
I. CAJAS DE PETRI
Se corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad de 2 a 3 cajas.
Colocar en la parte central y envolverlas.
 II. PIPETAS
Introducir una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando que quede lo
suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de ancho envolverlas, comenzando por
la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el final de la pipeta.

UTILIZACIÓN DEL AUTOCLAVE

1. Se rellena el autoclave con agua destilada hasta que esta pase la línea de llenado, que
en este caso, sería la bandeja.
2. Sacamos la cesta del interior del autoclave, metemos una especie de olla alargada y la
rellenamos con el material (cajas de petri, pipetas y medios de cultivos previamente
empacados).
3. Volvemos a introducir la cesta, ahora llena, en el autoclave y cerramos la puerta.
Seguidamente, comprobamos que la válvula del agua está cerrada y que la del aire
esté abierta.
4. Al alcanzar los 80º-100º, cerramos la válvula del aire.
5. Al finalizar el proceso de esterilización, vamos abriendo poco a poco la válvula del
aire, hasta dejarla completamente abierta.
6. Una vez hecho esto, esperamos hasta que la presión llegue a 0 y entonces, abrimos el
autoclave con los guantes de protección y sacamos la cesta del interior del aparato.

7. CONCLUSIÓN
El autoclave mostró ser rápido y eficaz además de utilización sencilla, es el agente
esterilizador más económico. De está práctica aprendimos el correcto empaquetado del
material de laboratorio, el uso del autoclave y la gran importancia de esté para evitar
contaminación en nuestros cultivos realizados a lo largo de la práctica.

8. ANEXOS
 II PARTE
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE DE ORIGEN ORGÁNICO

1. INTRODUCCIÓN

La calidad de la leche comercial y de sus derivados elaborados en una industrialáctea,

depende directamente de la calidad del producto original o materia prima.
La leche ha sido recomendada por la Organización de las Naciones Unidas para las
Agricultura y por la Organización de las Naciones Unidas para la Educación (FAO y
UNESCO, respectivamente) como un alimento indispensable en la alimentación humana,
principalmente para niños, por lo que su producción y abasto es parte de las estrategias de
seguridad alimentaria en muchos países, de acuerdo con los Fideicomisos Instituidos en
Relación con la Agricultura (FIRA) en 2001.

2. OBJETIVOS
• Analizar la importancia del control de calidad de la leche cruda
• Reconocer las pruebas que determinar la aceptación o rechazo de la leche cruda.
• Aplicar las pruebas utilizadas para determinar indirectamente la calidad sanitaria
de la leche cruda.

3. MARCO TEÓRICO

Factores que afectan la composición de la leche

La leche difiere en su composición que es muy difícil encontrar dos muestras idénticas.
Los factores que hacen variar la composición de la leche son: especie, raza, ordeño,
tiempo de ordeño, cuarto de la ubre, periodo de lactancia, estado nutricional, composición
del alimento, estaciones del año, temperaturas ambientales, edad, salud de la ubre,
enfermedades en general, condición de la vaca en el momento del parto, cambio de
sistema de ordeño, excitación, ejercicios, hormonas, drogas, selección genética, periodo
seco de la vaca e iluminación.
Contaminación de la Leche
1. Formas en que se Contamina la Leche
Desde el ordeño hasta que llega al consumidor o se elaboran sus productos, en la leche
caen muchos y diferentes microorganismos que, con una conservación duradera aumentan
la microflora y pueden provocar cambios, como son: aumento de acidez, coagulación,
etc., ya que la leche es un medio apropiado para el desarrollo de muchos
microorganismos. La cantidad adecuada de los componentes de la leche asegura las
sustancias alimenticias necesarias para el desarrollo de los microorganismos, también
ayuda la reacción ligeramente neutral que posee la leche en el momento del ordeño.
2. Glándula Mamaria
En la glándula mamaria casi siempre se encuentran microorganismos aunque se lave y se
desinfecte bien por su exterior. Por esta razón es que la primera leche que sale contiene
mayor cantidad de microorganismos, y cuando se quiere obtener una leche de buena
calidad se separan los primeros chorros en otro recipiente. Cuando la leche ha sido
obtenida en condiciones óptimas, su microflora es invariable y está compuesta
fundamentalmente de micrococos y estreptococos. La condición principal para obtener
una leche de buena calidad es la limpieza de la glándula mamaria y la salud del animal.
3. Piel de los Animales Lecheros.
La piel de los animales lecheros es una vía de transmisión de microorganismos en la
leche, ya que a ella pueden adherirse parte de excrementos y alimentos, los cuales pueden
caer en la leche durante el ordeño. La microflora que contiene la leche cuando se
contamina por suciedades de la piel puede ser de coliformes, bacterias proteolíticas,
estafilococos, etc.
4. Recipientes
Los recipientes que se utilizan para el colado y la conservación de la leche originan
diferentes tipos de microorganismos, y así desde que se obtiene la leche hasta que llega al
consumidor, va aumentando su microflora. La microflora que cae en la leche, cuando los
recipientes no han sido bien lavados, es de bacterias ácido lácticas. La leche es un medio
favorable para el desarrollo de las bacterias. La microflora que pasa a la leche cuando los
recipientes han sido lavados, pero no esterilizados, es variada. Cuándo los recipientes se
someten a una esterilización discontinúa la mayor parte de microorganismos que se
encuentran en la leche son los que forman esporas. Para evitar esto, los recipientes deben
ser lavados primeramente con agua fría y después con agua caliente y desinfectantes.
5. Manos de los Ordeñadores
Las manos son también transmisoras de microorganismos, principalmente patógenos; por
eso, el ordeñador debe lavárselas bien antes y después del ordeño y no introducirlas en la
leche.

4. MATERIALES Y REACTIVOS
a) Materiales
Petrifil
Tubos de ensayo
Puntas esterilizadas
Mechero
Pipeta
b) Reactivos

Agua peptonada
5. PROCEDMIENTO

ü Se tomó una muestra de leche cruda.

ü En 5 tubos de ensayo, se pipeteo 9ml de leche peptona con 1 ml de leche solución ésta
constituyó la primera dilución de la muestra (10-1).

ü Posteriormente se realizaron diluciones decuples seriadas, transfiriendo 1 ml de la

dilución inicial a 9 ml de agua peptonada estéril hasta la dilución 10-5.
 ü Para el análisis, se tomo del tubo 10-4, y posteriormente se sembró en petrifil.

6. RESULTADOS

Fig1. Colonias observadas

7. CONCLUSION

Con el analisis de la leche pudimos concluir que es una leche apta para el consumo ya que
no se observo la presencia de ningun microorganismo que afectara la misma, mediante
esta practica aprendimos a realizar soluciones (10-1).
8. BIBLIOGRAFIA

Blowey R., y P. Edmondson. 1995. Control de la Mastitis en Granjas de Vacuno de Leche.

Acribia. Zaragoza. 87 p.
Carter R. 1984. Diagnostic Procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology. Charles C
Thomas Publisher. 1984.

Norma Oficial Mexicana NOM-243-SSA1. 2010. Productos y Servicios. Leche, Fórmula

Láctea, Producto Lácteo Combinado y Derivados Lácteos. Disposiciones y Especificaciones
Sanitarias. Métodos de Pruba
 Parte III

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SIEMBRA DE HONGOS

1. INTRODUCCIÓN

Un medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de

los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar,
porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy
poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy
exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Las bacterias en la naturaleza, ocupan distintos nichos ecológicos que satisfacen sus
necesidades nutricionales. En el laboratorio, para conseguir que una determinada bacteria se
desarrolle adecuadamente, es necesario realizar medios de cultivo. Un medio de cultivo es
cualquier sustancia líquida o sólida, por ejemplo el "agar nutritivo" y se utiliza como agente
gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
Estos medios artificiales o sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes
individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que
solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición,
la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe
esterilizarse.

2. OBJETIVOS

Objetivo general

Desarrollar el conocimiento previo a la catedra de microbiologia, mediante

procedimientos prácticos de laboratorio.

Objetivos específicos
• Realizar el proceso de esterilización, a través del autoclavado para la obtención del
material esterilizado.
• Determinar las diferentes siembras de hongos a través del microscopio para identificar
sus diferentes características.
 3. MARCO TEÓRICO

Medios de Cultivo
Los medios de cultivo de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el
Laboratorio de Fitopatología por lo que a diario se preparan y utilizan. Los medios de cultivo
son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas
óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos

SABURO
Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de animales. Sirve para el
aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo inclinado. Debido a su composición, los
hongos crecen exuberantemente y esporulan bien. Es el medio estándar para observar la
morfología típica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la
esporulación.

Agar nutritivo
Es un medio de cultivo sólido no selectivo y no diferencial. En este medio crecen todo tipo de
bacterias no exigentes desde el punto de vista nutricional. Es un medio simple y, a pesar de
su nombre, contiene un valor nutritivo más bajo en comparación con otros medios similares,
como por ejemplo el agar infusión cerebro corazón o el agar soya tripticasa.

HONGO
Los hongos son protistas no fotosintéticos que crecen en forma de aglomeraciones de
filamentos ramificados y entrelazados hifas conocidos como micelios. los micelios se
denominan mohos de algunas variedade, las levaduras no forman micelios pero son
reconocidas fácilmente por su como hongos por su reproducción sexual y la presencia de
formas de transición.

Hongo de maíz
Cuitlacoche ( Ustilago maydis)
hongo que parasita plantas de maíz, produciendo tumores de hasta 10 cm de diámetro en las
inflorescencias, va cambiando de color blanco a negro denominado carbón de maíz, siendo el
color que le dan las esporas de resistencia, las teliosporas, una vez formadas.
forma soros en los tallos, hojas e inflorescencias( tanto masculinas como femeninas) a modo
de pústulas o manchas irregulares de tamaños considerables, al comienzo cubiertos por una
membrana lisa, fina, grisácea, que luego se hace parda y rompe liberando la masa de esporas.

ciclo biológico: las esporas de resistencia, diploides, pueden pasar, antes de germinar, un
estado de latencia esperando que las condiciones sean adecuadas. al germinar se origina un
micelio en el que sufre meiosis el núcleo de la espora, originando cuatro núcleos haploides
que se reparten por el micelio y entre los que se forman tabiques de separación.

4. PROCEDIMIENTOS
Procedimientos de muestras del hongo de choclo y yuca
Seleccionamos los medios y preparamos para la siembra.
Obtención de la muestras previo a la práctica.
Con la ayuda de una asa de siembra y mechero cojemos un poco de la muestra y depositamos
sobre el medio de cultivo (agar saburo).
Incubamos la muestra a 35°C o 37°C, durante varios días.
En el portaobjetos colocamos una gota de agua o agua peptona para la muestra.
Luego cojemos la muestra-siembra con la ayuda del asa y colocamos en el portaobjetos y se
homogeniza, entonce se coloca 1000uL azul de violeta durante 2 min y se pasa por un chorro
de agua suave.
Colocamos las muestras sobre la platina con una gota de aceite de inmersión y procedemos a
enfocar para determinar las características del hongo .

MATERIAL PARA SIEMBRA DE HONGOS

Erlenmeyer Varilla Microscopio óptico
Luna de reloj Mechero Balanza
Cajas petri Tubos de ensayo Incubadora

Medios selectivos
Muller Hinton Saburo Agar nutritivo

6. RESULTADOS

• En 28 g de agar nutritivo en 1L de agua destilada, para 10 cajas petri se preparó 5.8 g

del medio selectivo..
• En 38 g de agar Muller Hinton en 1L de agua destilada, para 15 cajas petri se preparó
11.4 del medio selectivo.
• En 65 g de agar saburo en 1L de agua destilada, para 10 cajas petri se preparó 13g
del medio selectivo.
• Se obtuvo unas muestras muy características del hongo huitlacoche ( Ustilago
maydis)
7. RECOMENDACIONES

• Mantener el cultivo cerca del calor, para evitar su extinción.

• Usar los implementos necesarios como el mandil, guantes, mascarilla y cofia.
• Esterilizar el material que se va a usar, ya que contiene varios microorganismos.
• Evitar desperdiciar los agares al momento que se va a colocar en las cajas Petri o en
cualquier otro objeto.
8. CONCLUSIONES
De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que; es de gran importancia
añadir la cantidad de solución exacta y disolver sin que quede residuos del agar.
Después de algunos días, observamos a las colonias que se formaron en las placas,
caracterizándose en sus diferentes aspectos. Esto nos ayudó a conocer a las diferentes
coloraciones, aspectos y consistencia que tienen los hongos y en la siembra del choclo
existían mohos.
9. BIBLIOGRAFÍA

• Tortora G.J., Funke B.R. and Case C.L., conceptos básicos de la Microbiología
• https://es.slideshare.net/jheezzihdtticsehuaman/informe-n-9-aislamiento-de-hongos-
grupo-n-i-1.
• Liliana Gomez. (2011). Concepto y practicas de microbiologia. Obtenido de
https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
 Parte IV
Identificación de microorganismos (Tinción de Gram)
Objetivos
● Aprender a preparar muestras utilizando la tinción de Gram.
● Identificar el tipo de microorganismos presentes en los cultivos sembrados.
● Volvernos más diestros en el uso y manejo del microscopio.

Introducción
La tinción de Gram es conocida como una tinción diferencial, porque utiliza dos colorantes y
clasifica a las bacterias en dos grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.
Esta técnica fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884. El
objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible diferenciar diferentes
grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas. La prueba resultó todo un éxito
y pronto se convirtió en una técnica muy útil no solo para el estudio de las bacterias, sino
también para poder identificarlas rápidamente en una infección y seleccionar el antibiótico
más adecuado para tratarla.

Marco teórico
Principio básico de la tinción de Gram
Esta técnica se basa en aplicar colorantes a una muestra de cualquier origen que contenga
bacterias no identificadas.
Estos colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos se
realiza un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la
pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanece el color morado, y se
trataría de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y
serían Gram negativas.

Gram negativas: Tiene una capa gruesa de Peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos
teicoicos: Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de
peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y Ácido teicoico de la Pared
que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano.

Gram positivas: Tiene una capa delgada de Peptidoglicano (mureina) unida a una membrana
exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y
lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y
el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero
el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado
Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo.
Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificación de la amplía
mayoría de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a cada tipo de
antibióticos, por eso es una técnica útil para seleccionar el fármaco antimicrobiano inicial
ante una infección. Hay que tener en cuenta que en ciertas situaciones (como la sepsis) es
muy importante iniciar un tratamiento antibiótico adecuado de forma precoz, por eso la
tinción de Gram se pide de urgencia en muchas ocasiones.
La tinción de Gram también tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen pared,
como por ejemplo las Clamidias, y no se podrán identificar, al igual que los virus.

Materiales: Reactivos:
● Algodón ● Cristal violeta
● Portaobjetos ● Alcohol acetona
● Asa bacteriológica ● Lugol
● Mechero ● Safranina
● Guantes ● Agua destilada
● Aceite de inmersión

Procedimiento
1. Preparamos nuestra área de trabajo, los medios de cultivos proporcionados y nos
colocamos los guantes.
2. Se preparan 2 porta objetos colocando una gota de agua destilada, se esteriliza el asa
bacteriológica en el mechero, posteriormente se enfría a un costado de la caja del
 medio para después tomar una colonia de bacterias, cerca del mechero para que no
se contamine; el mismo procedimiento con el segundo medio.
3. La colonia se coloca sobre el agua del porta y se realiza un extendido masivo por
todo el cubre dejando las esquinas libre para poder sujetarse.
4. Se flamean en el mechero 4 veces para sellarlo.
5. Se procede a realizar el tinción de Gram, preparándose el puente para tinción y
colocando el porta.
6. Se bañan con el colorante Cristal violeta y se deja reposar por 1 minuto,
posteriormente se lavan.
7. El mismo procedimiento con Lugol, por 1 minuto y se lavan.
8. Una vez lavado se coloca el alcohol solo por 30 segundos para quitar el exceso de
los demás colorantes y se lavan.
9. Por último se les agrega el colorante Safranina por 1 minuto.
10. Se deja secar y se observan en el microscopio agregándole aceite de inmersión a un
objetivo 100X para identificar de qué tipo de bacterias se tratan.

Resultados

Conclusiones
 ● En conclusión, la práctica nos ayudó a observar estructuras de los hongos, pero
tuvimos que realizar una tinción de Gram porque se sospechaba que tal vez existía
una posible contaminación de bacterias. Y si la tinción demostró como lo habíamos
sospechado, los cultivos se habían contaminado con bacterias, principalmente de
cocos y E. coli.
● El motivo de la contaminación tal vez se pudo dar en el momento de la siembra o en
el horno donde se dejo para que crecieran.
● Este contratiempo nos deja una valiosa lección para nuestras futuras prácticas en el
laboratorio y verificar que todo se encuentre descontaminado.

Bibliografía

▪ Aquiahuatl Ramos, M. A., y Pérez Chabela, M. L. 2004. Manual de prácticas del

Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana,
Unidad Iztapalapa. México. Departamento de Biotecnología. 116 p.

▪ Castaño-Zapata, J. y Del Río Mendoza, L. 1997. Manual para el diagnóstico de

hongos, bacterias, virus y nematodos fitopatógenos. Zamorano- Universidad de
Caldas. 210 p.