Resumen pasantías

“Determinación de la influencia del tiempo y la concentración en

la prueba de resazurina que se realiza en EMLACAB C.a”
Inicialmente “la calidad de la leche cruda se establece con base a parámetros
higiénicos, sanitarios y composicionales. La calidad higiénica resulta de especial
importancia, por tratarse del contenido microbiano que está presente en la leche
cruda, el cual se transfiere en buena medida a los productos que se elaboran a
partir de ella en la industria láctea y que inciden de manera representativa en la
vida útil tanto de la materia prima como del producto terminado. La vigilancia y
control del estándar microbiano es necesario en cada punto de la cadena láctea,
en la obtención de la leche cruda en los hatos lecheros, en el transporte y
manipulación, en el acopio y almacenamiento e incluso en las líneas de proceso”
Patrick Y Rodríguez México, 2004.

De la misma manera; “La calidad sanitaria de la leche, utilizada como materia

prima en la elaboración de productos lácteos, depende de factores como la calidad
del agua, buenas prácticas de ordeño, sanitización de equipos, utensilios y la
temperatura de enfriamiento”. Auclair (1990).

Actualmente se utiliza como prueba de plataforma en las industrias lácteas la

prueba de oxido-reducción con resazurina (es un colorante azul, débilmente
fluorescente hasta que se reduce irreversiblemente a la resorufina fluorescente de
color rosa y altamente roja. Se utiliza como un indicador de oxidación-reducción en
los ensayos de viabilidad celular para la respiración tanto aeróbica como
anaeróbica) que tiene su fundamento en :

Cuando se añade una pequeña cantidad de resazurina a la leche y la mezcla se

incuba a 37 ºC, se produce una decoloración debida al metabolismo bacteriano; la
velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al
número de gérmenes presentes. La reducción pasa por una serie de etapas
intermedias caracterizadas por diferentes coloraciones: azul, violeta, malva, rosa-
violeta, malva-rosa y rosa, hasta la transformación de la resazurina en resofurina;
en este momento la reacción es irreversible por la acción del oxígeno. La
reducción continúa con una última modificación que implica una decoloración
completa; la resofurina se transforma en dihidroresofurina incolora, que por la
acción del oxígeno atmosférico vuelve a tomar color rosa, en otras palabras ésta
es un indicador de pH que vira entre 3,8 (anaranjado) a 6,5 (púrpura) Es una
oxazona que imparte color azul a la leche normal. Por pérdida de oxígeno se
reduce en dos etapas: en la primera pasa por diversas tonalidades de violeta
hasta rojorosa, color éste que se atribuye a la formación de un compuesto
denominado resorufina; a diferencia del azul de metileno esta etapa de reducción
es irreversible, es decir, en contacto con el oxígeno del aire el color azul original
no se restituye. Si la pérdida de oxígeno continúa, la reducción pasa a una
segunda etapa reversible, en la cual la resorufina se reduce a dihidro-resorufina,
compuesto incoloro que por oxidación puede pasar de nuevo a resorufina (rojo-
rosa).

En el mismo orden de ideas; La prueba de la resazurina permite determinar

condiciones múltiples de circunstancias higiénicas y bacteriológicas de la leche
objeto de examen. Este complejo puede estar formado por tres tipos de
integrantes: gérmenes acidificantes y reductores, en especial coliaerogenes,
estreptococos y estafilococos; otras bacterias, y células a consecuencia de la
mastitis, los cuales no pueden ser identificadas por la resazurina debido al limitado
mecanismo de reacción de la prueba. Se ha demostrado que números elevados
de células somáticas, como algunos de los encontrados en este estudio, afectan la
composición de la leche, debido a los incrementos en la concentración de enzimas
proteolíticas, también las llamadas enzimas tipo plasminas y lipolíticas, esto como
consecuencia de la lisis sufrida por leucocitos y bacterias durante la acción de
defensa del sistema intramamario contra las infecciones bacterianas. Así es como
la plasmina rompe la kappa-caseína en fragmentos ineficientes a la hora de la
coagulación, disminuyendo la capacidad de formación de la cuajada, la firmeza y
calidad del queso, debido a la hidrolización y alteración de la estructura de la
micela de caseína (de alto valor industrial), disminuyendo su proporción en la
leche. Así mismo, puede producir gelificación y deterioro de la leche
ultrapasterizada debido a la reducción de la tolerancia de la leche a los
tratamientos térmicos causada por cambios en el perfil mineral y en la proporción
de lactosa porque la capacidad de filtración selectiva ejercida por el epitelio
mamario aumenta varias veces las concentraciones de sodio y cloro y disminuye
las concentraciones de calcio, fosfatos, magnesio y potasio, buscando mantener el
balance osmótico por la reducción de la lactosa en la leche calculada en un 10%.
Por otro lado, como consecuencia de la presencia de enzimas lipolíticas, a medida
que aumenta el Células Somáticas aparecen sabores rancios debido a la acción
de las lipasas sobre las grasas de la leche, deteriorándolas y liberando ácidos
grasos de bajo peso molecular que producen sabores desagradables.

Partiendo de esto, actualmente en el laboratorio de ENLACAB C.a se realiza la

prueba de Resazurina a una concentración de 0.01% y un tiempo de incubación
de 10 min. Tiempos de incubación y concentración no definidos por ninguna
norma entonces crece la necesidad de evaluar la reacción de óxido – reducción de
la resazurina a diferentes concentración a lo largo de intervalos del tiempo para
conocer su comportamiento y dar certeza de la lectura de los resultados.

Entonces; se realizó una matriz de experimentación 3x2 teniendo como variables

la concentración y el tiempo de reducción.

Concentraciones en % P/V:

 0,01%
 0.005%

Tiempo en minutos:

 10
 30
 60
Durante varias semanas re realizo la experimentación comenzando con un
diagnóstico inicial para conocer y tener referencia de cuáles son los valores que se
aprecian actualmente en el laboratorio de EMLACAB para esta prueba.

Resultados y análisis

1. Se Realizaron 90 pruebas de resazurina a 0.01%

Tiempo /Escala de 10min 30min 60min

mushel

buenas 80 77 27

regulares 15 17 42

Malas 5 5 16

Muy malas 0 1 5

2. Se Realizaron 90 pruebas de resazurina a 0.005%

Tiempo /Escala de 10min 30min 60min

mushel

buenas 80 77 27

regulares 15 17 42

Malas 5 5 16

Muy malas 0 1 5
Lo expuesto en las tablas se observa un comportamiento línea en función de la
concentración, es decir, no hubo variaciones en el grado de reducción de la
resazurina a concentraciones diferentes. En el caso de la variable tiempo si hubo
variación exponencial lo que se traduce en que el tiempo es directamente
proporcional a la reducción de la resazurina.

Se observó a través de los 90 ensayos que se hicieron a lo largo de esta

experimentación que despus del minuto 40 existe un punto de inflexión en donde
se acelera la reacción - reducción y un gran porcentaje pasa de Buena a regular y
las regulares a malas.