UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BÁSICAS

GUÍA DE PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA

SEGUNDO AÑO

SESIÓN I

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y LAS

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

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I. INTRODUCCIÓN

En el campo de la microbiología médica es necesario que el estudiante se familiarice desde el inicio con
el material y equipos empleados para el aislamiento e identificación de los microorganismos (bacterias,
hongos y virus). De forma básica, es necesario aplicar los procedimientos de esterilización que permitan
realizar prácticas que reúnan los requisitos exigidos para el trabajo microbiológico.

1.1. LOS AMBIENTES DE TRABAJO

El laboratorio de Microbiología clínica es aquel lugar donde que realiza determinaciones

microbiológicas, sobre muestras de origen humano, destinadas tanto a la promoción de la salud
como al diagnóstico, evolución y tratamiento de las enfermedades.

De la misma forma, el laboratorio de Microbiología clínica proporcionará a los estudiantes de

medicina información precisa relacionada con la sensibilidad o resistencia antibiótica, de principales
microorganismos, como agentes de enfermedades infecciosas. Siendo este un dato de inestimable
valor para la indicación de un tratamiento.

Las prácticas deben realizarse de acuerdo con los estándares técnicos y de seguridad propios de un
laboratorio de Microbiología clínica.

El laboratorio debe contar con:

 Área de trabajo para el análisis, cultivo y procesamiento de la muestra.
 Área de preparación de reactivos, lavado de material y esterilizaciones.
 Área de desechos de productos biológicos peligrosos y no peligrosos.

En el laboratorio de Microbiología clínica debe mantenerse la buena higiene, desinfectándose una

vez por semana, para evitar la humedad y proliferación de hongos u otros microorganismos. Se
deben seguir en todo momento y en todas las áreas, las normas de bioseguridad.

1.2. MATERIAL Y EQUIPO BÁSICO USADO EN LAS PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

 Asa y aguja de siembra: Material de alambre de platino, puede ser recto o terminar en
forma de pequeño anillo.
 Crioviales: Tubos cónicos pequeños de polipropileno. Usados para guardar muestras
biológicas. Ej.: suero, cepas virales, fúngicas, bacterianas y parasitarias.
 Filtros esterilizantes: No pueden ser sometidos a la acción del calor en sus diferentes
modalidades.
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  Gradilla: Soporte para tubos de ensayo, puede ser de plástico, de madera o de metal.
 Lámina portaobjetos: Lámina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos.
 Jarra de anaerobiosis: Instrumento con cierre hermético, útil para el aislamiento de
bacterias anaerobias.
 Matraces y balones: Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y
almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de cultivo, etc.
 Mechero de Bunsen: Mechero de gas, para esterilizar el asa de siembra.
 Pipetas: Tubos cilíndricos graduados para la transferencia de líquidos.
 Pipetas Pasteur: Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a 30 cm de longitud. Se les
emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra.
 Pipeteadores automáticos: Para aspirar pequeños volúmenes (1µl a 1 000 µl) de diversas
muestras.
 Placa de Petri: Recipiente de vidrio o plástico que, en general se usa para contener medio
de cultivo y proporciona una suficiente área para el crecimiento bacteriano.
 Tubos para cultivo: Tubo pequeño con tapón y rosca fabricado en vidrio borosilicato. Suelen
haber de muchos tamaños como 13 x 100, 15 x 100, 16 x 150, etc.

ASA DE SIEMBRA CRIOVIALES AGUJA Y MANGO DE KOLLE

FILTROS ESTERILIZANTES GRADILLAS LAMINAS PORTAOBJETOS Y LAMINILLAS

JARRA ANAEROBIOSIS MATRAZ BALÓN

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 MECHERO DE BUNSEN PIPETAS DE VIDRIO PIPETAS PASTEUR PLÁSTICO

PIPETA AUTOMÁTICA
PLACAS PETRI

TUBOS PARA CULTIVOS

1.3. REACTIVOS DE LABORATORIO

Medios de cultivo: Son sustancias nutritivas esenciales para el crecimiento de microorganismos,

similares a substratos naturales. En su composición se incluyen péptidos y carbohidratos,
ocasionalmente indicadores del cambio de pH e incluso del metabolismo bacteriano. De acuerdo con
su consistencia pueden ser líquidos, semisólidos y sólidos, en forma deshidratada. Se deben
almacenar en lugares secos y ventilados.

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1.4. EQUIPOS DE LABORATORIO

 Autoclave: Aparato para esterilización por vapor y presión, provisto de manómetro,

termómetro y regulador de presión
 Cabina de Flujo laminar: Equipo que proporciona área estéril, para los trabajos
microbiológicos, en especial en cultivos.
 Centrífuga: Equipo para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas en
líquidos.
 Contador de colonias: Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las colonias de
microorganismos.
 Estufa o incubadora: Aparato donde se incuban los cultivos, generalmente a 37ºC.
 Microscopio: Aparato óptico para la observación de microorganismos.

AUTOCLAVE CABINA DE FLUJO LAMINAR CENTRIFUGA

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 CONTADOR DE COLONIAS ESTUFA O INCUBADORA MICROSCOPIO

II. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

2.1. MATERIALES:

 Botiquín: Para primeros auxilios debe contener, gasa estéril, algodón absorbente, vaselina
borificada, sol. de ácido acético al 1%, sol. de ácido bórico al 2%, sol de bórax al 12%
tintura de yodo, alcohol, tijeras, etc.
 Extinguidor: Para casos de incendios
 Ventiladores o extractores de aire: mantener renovación del aire
 Cámara de flujo laminar o cámara de bioseguridad
 Pantalla contra salpicadura de sustancias o lentes protectores
 Duchas de seguridad: Sirve para lavarse si has tenido contacto con algún químico, debe
ser de fácil acceso.
 Campana: Sirve para extraer los gases contaminantes y llevarlos al exterior, pero antes
pasan por un filtro para no contaminar el ambiente.
 Tachos para desechos de residuos biocontaminados y tachos para objetos punzocortantes.

CABINA BIOSEGURIDAD
BOTIQUIN EXTINTOR VENTILADOR

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 TACHOS PARA
DESECHOS
PANTALLA DUCHA DE SEGURIDAD CAMPANA EXTRACTORA

2.2. EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL (EPP):

 Mascarilla: usar en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de
material biológico en la mucosa bucal y nasal.
 Guantes de látex: se deberá usar en todo procedimiento que implique el manejo de material
biológico o donde exista el riesgo de exposición a sangre o fluidos corporales, asi mismo
deberán usarse en los procesos de descontaminación y eliminación de residuos
contaminados.
 Mandil o bata: será obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual deberá ser
retirada antes de salir del laboratorio. Esta deberá ser de manga larga para protegerse de
cualquier reactivo o agente químico, o material biológico manipulado en el laboratorio.
 Zapatos cerrados: Usarlos dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel con
material contaminado o cualquier producto químico peligroso, por derramamiento o
salpicadura de algún agente tóxico.
 Gorro de tela: para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado o
sustancias químicas peligrosas.
 Gafas de seguridad o gafas de impacto

MASCARILLA GUANTES DESCARTABLES MANDIL o BATA

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 ZAPATOS GORRO DE TELA GAFAS DE SEGURIDAD

III. METODOS DE ESTERILIZACIÓN

La esterilización es el procedimiento por el cual se destruyen los microorganismos y sus formas

resistentes, mediante el uso de métodos físicos y químicos. El proceso de esterilización debe ser
diseñado, validado y llevado a cabo para asegurar que es capaz de eliminar la carga microbiana del
producto o un microorganismo más resistente.

Los agentes que matan microorganismos son denominados microbicidas (cida= “matar”) o más
comúnmente denominados “germicidas”. Si el agente específicamente destruye bacterias, es llamado
bactericida; si mata hongos es denominado fungicida. Tras una exposición del objeto esterilizado al aire a
sus alrededores, éste se habrá contaminado de nuevo con microorganismos.

Los agentes que inhiben el crecimiento de microorganismos son denominados microbiostáticos, igual que
el caso anterior si el agente que inhiben son bacterias es llamado bacteriostático y si mata hongos es
llamado fungistáticos.

3.1. METODOS FÍSICOS:

 CALOR SECO: El calor se transmite de un cuerpo de mayor temperatura a otro de grado

calorífico menor. El calor se propaga por conducción, por convención y por radiación. Formas de
esterilización:

Por Flameado: Acción directa de la llama de un mechero, sin que el material se altere ni sufra deterioro.
Se aplica a las asas de siembra, bocas de tubos, matraces, etc.

Por Aire caliente: En horno esterilizador, el calor se inicia por conducción y se propaga por convención.
Se aplica a vidrios y metales, evitando plásticos o gomas debido a las altas temperaturas que alcanza el
horno.

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Por radiación: La radiación incide sobre el material genético de los microorganismos destruyéndolos
rápidamente. Su acción depende del tipo, el tiempo y la dosis. Los tipos más comunes son: radiación
ultravioleta y/o ionizante.

 CALOR HÚMEDO: La esterilización ocurre debido a la coagulación de las proteínas del

protoplasma microbiano. Formas de esterilización:
Por Ebullición: El material es sometido a la acción directa del agua hirviendo a 100°C durante 30 minutos.
Por este método se puede esterilizar jeringas, guantes de jebe, sondas, ropa, etc.

Por Tyndalización: Es un tipo de ebullición fraccionada. Este método es práctico para esterilizar
sustancias orgánicas.

Por Vapor saturado a presión: Este método utiliza la autoclave a 121 ° C durante 15 a 20 minutos y a 15
libras de presión. Se eliminan las formas vegetativas o activas, como esporas de gérmenes.

3.2. METODOS QUÍMICOS

 ANTISÉPTICOS: Son sustancias químicas que previenen infecciones, ya que evitan el desarrollo de
microorganismos que se encuentran en la superficie de la piel y en las membranas mucosas, sin
causar irritación o daño. Por esta razón, también se les llaman "germicidas de superficie".

 ANTIMICROBIANOS: es una sustancia que elimina o inhibe el crecimiento de microorganismos,

tales como bacterias, hongos o parásitos.

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IV. NORMAS DE BIOSEGURIDAD

4.1. ¿QUÉ ES LA BIOSEGURIDAD?

Es un conjunto de medidas preventivas orientadas a mantener, controlar y reducir factores de riesgo

laborables procedentes de agentes de riesgo (biológicos, físicos o químicos) con el objetivo de
proteger la salud y la seguridad del personal que labora en un determinado establecimiento de salud,
laboratorio de diagnóstico o de enseñanza universitaria. En 1967 el científico Charles L. Baldwin
desarrolla una señal de advertencia para los peligros biológicos. Es así que, después de muchas
pruebas de fondo y la toma de decisiones por diversos científicos y psicólogos se crea dicho símbolo.
¿Qué significa el símbolo de Biohazard o símbolo de la Bioseguridad?
El símbolo internacional de BIOHAZARD viene de la contracción de “Biological Hazard” que significa
"peligros biológicos", tales como virus, bacterias y armas biológicas.

El símbolo de la bioseguridad, que es el símbolo de riesgo biológico, tiene una rica y fascinante
historia detrás de su creación.

V. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la

manipulación a la que es sometido. Por ello es básico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.
2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biológica.
6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.

Además, debemos considerar las medidas de bioseguridad:

 Ingresar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el
lugar que se les indique para tal fin.
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  No realizar acciones prohibidas en el laboratorio (comer, fumar, beber).
 No ingresar aparatos electrónicos prohibidos.
 Ingresar con el mandil cerrado y mantenerlo puesto en todo momento.
 Recoger el cabello largo.
 Mantener limpio el área de trabajo y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al
finalizar la sesión práctica.
 Lavarse las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir
del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son
contaminantes.
 Usar los recipientes de basura adecuados para los residuos.
 Conocer donde se encuentra el extintor en caso de incendios y el botiquín de primeros auxilios.
 Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase con su docente responsable.
 No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de estos y estar
seguro de cómo emplearlo.
 Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el docente responsable, no llevar a cabo
experimentos no autorizados.
 Reportar inmediatamente cualquier accidente (derrame de material contaminado, heridas,
quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.

VI. CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES BIOLÓGICOS POR GRUPO DE RIESGO

Los laboratorios de microbiología constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar
riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo
diario en el laboratorio es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante las
prácticas, así como el entrenamiento que posean en las técnicas requeridas para el manejo de material
contaminado, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y de la colectividad en
general.

Los accidentes en el laboratorio de microbiología pueden suscitarse debido a una condición insegura (el
propio ambiente), a un acto inseguro (de la persona) y a una condición de riesgo. Estos factores en
congruencia pueden ocasionar un accidente, razón por la cual todo el personal debe conocer las normas
de bioseguridad, para disminuir el riesgo. El Riesgo microbiológico se encuentra presente cada vez que
se realiza una actividad práctica en el laboratorio (cultivo de microorganismos). Para que se produzca un
accidente por un agente microbiológico deben estar presentes básicamente 4 elementos: un huésped
susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una ruta de transmisión
adecuada.

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Un programa de seguridad gestionado por profesionales bien entrenados, con un alto grado de
participación por parte de los trabajadores, puede llevar no sólo a una disminución del número de
lesiones y enfermedades, sino también a un incremento de la satisfacción del trabajador y de la
productividad.

La asignación de un agente a un nivel de bioseguridad para el trabajo de laboratorio debe basarse en una
evaluación del riesgo. Esa evaluación tendrá en cuenta el grupo de riesgo, además de otros factores, con
el fin de determinar el nivel de bioseguridad más apropiado.

La Organización Mundial para la Salud (OMS) clasifica los peligros relativos que entrañan los
microorganismos infecciosos en el trabajo de laboratorio en cuatro grupos de riesgo.

GRUPO DE RIESGO 1: Riesgo individual y poblacional escaso o nulo. Microorganismos que tienen pocas
probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales.

GRUPO DE RIESGO 2: Riesgo individual es moderado, riesgo poblacional bajo. Agentes patógenos que
pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar
un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La
exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y
terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.

GRUPO DE RIESGO 3: Riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo. Agentes patógenos que
suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un
individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.

GRUPO DE RIESGO 4: Riesgo individual y poblacional elevado. Agentes patógenos que suelen provocar
enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a
otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.

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VII. NIVELES DE BIOSEGURIDAD

7.1. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 1:

 Clasificación Laboratorio: Básico. Ej.: Laboratorio de Entrenamiento Básico
 Microorganismos: Todos los microorganismos que se utilizan en la industria de
la alimentación, para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos.
 Técnicas: Básicas-Corrientes
 Equipo de seguridad específico: Ninguno
El Nivel de Bioseguridad 1 representa un nivel básico de contención que se basa en prácticas
microbiológicas estándar sin ninguna barrera primaria o secundaria especialmente recomendada,
salvo una pileta para lavado de manos.

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 7.2. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2:

 Clasificación Laboratorio: Básico. Ej.: Laboratorio de diagnóstico clínico

 Microorganismos: Salmonella, Hepatitis B, Vibrio cholerae, Brucella, Estafilococos, Salmonella,
Toxoplasma, etc.
 Técnicas: Nivel I + acceso limitado (tener puerta y mantenerla cerrada) solo para el personal
adiestrado
 Equipo de seguridad específico: Equipo de protección personal completo (Primario).

En el Nivel de Bioseguridad 2, se debe contar con barreras secundarias, tales como piletas para
lavado de manos e instalaciones de descontaminación de desechos a fin de reducir la contaminación
potencial del medio ambiente.

7.3. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 3:

 Clasificación Laboratorio: De contención. Ej.: Laboratorio especializado

 Microorganismos: Virus encefalitis, Meningococo, SIDA, M. tuberculosis, Brucella, Coxiella
burneti, etc.
 Técnicas: Nivel II + acceso restringido (la puerta se abre sólo por dentro), ventilación especial.
 Equipo de seguridad específico: Equipos especialmente diseñados

En el Nivel de Bioseguridad 3, las principales medidas a tomar en consideración son la correcta

manipulación y la utilización de cabinas de seguridad. Sólo pueden ser procesados por personal
calificado y en una zona con la infraestructura para la recirculación de aire, con gradiente de presión,
cabinas de bioseguridad, etc.

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Al manipular agentes del Nivel de Bioseguridad 3 se pone mayor énfasis en las barreras primarias y
secundarias para proteger al personal en áreas contiguas, a la comunidad y al medio ambiente de la
exposición a aerosoles potencialmente infecciosos.

7.4. NIVEL DE BIOSEGURIDAD 4:

Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en el laboratorio de contención máxima. El

personal debe estar específica y acuciosamente adiestrado en el manejo de agentes
extremadamente de alto riesgo o ajenos a la flora habitual del país.

 Clasificación Laboratorio: de contención máxima. Ej.: Laboratorio diagnóstico patógenos

exóticos.
 Microorganismos: Virus Ebola, Virus Machupo, Arenavirus.
 Técnicas: Nivel III + Sistemas especiales de ingreso
 Equipo de seguridad específico: Equipos contención máxima, Gabinete Bioseguridad clase III
(herméticamente cerrado).

Además, deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios del grupo 3 que
adquieran propiedades patógenas que los categoricen como pertenecientes al grupo 4.

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VIII. SEÑALIZACIÓN EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Es un conjunto de estímulos que informan al individuo sobre cuál es la mejor conducta que seguir frente a
una determinada circunstancia (equipo de protección a utilizar, plan de emergencia a seguir, riesgos a
prevenir, etc.) que se pretende resaltar. Las señales para tener en cuenta son: Señales de advertencia de
un peligro, señales de prohibición, señales de obligación, señales relativas a los equipos de lucha contra
incendios.

Las normas de bioseguridad son dadas para prevenir accidentes y saber cómo actuar frente a ellos.
Seguir estas normas es indispensable para los laboratorios, ya que nadie quiere quedarse ciego o tener

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alguna infección, además según una encuesta el 100% son por no cumplir con las normas de
bioseguridad, ya que el humano no sigue las normas, el equipamiento no es seguro o se saltan algunos
procedimientos.

ACCIDENTES:
Accidentes debido a error humano 65%
Actos inseguros 15%
Problemas de equipamiento 20%

Edad más propensa 20–29 años, Hombres > mujeres

Encuesta de laboratorio y comportamiento (Phillips, 1965)

Actualmente las señalizaciones de peligro de reactivos químicos esta dado por el Sistema Globalmente Armonizado
(SGA).

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 FUENTES DE INFORMACIÓN

1. Arenas R. Micología Médica Ilustrada.2ª edición.2005. Editorial Mc Graw Hill

2. Bailey & Scott. Diagnóstico Microbiológico .11ª edición 2004.Editorial Médica Panamericana.
3. Granados R. Microbiología Tomo II.2ª edición. 2003 Editorial Thomson Paraninfo
4. Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica 18ª edición 2005 Editorial Manual Moderno
5. Koneman Diagnóstico Microbiológico 6ª edición. 2008. Editorial Médica Panamericana
6. Murray P. Microbiología Médica.5ª edición 2008.Editorial Elsevier
7. Sherris Microbiología Médica. 4ª edición. 2005. Editorial Mc Graw Hill
8. Baker F. J, Breach M.R. Manual de Técnicas de Microbiología Médica. 1990. Editorial Acribia
9. Cann A. Principios de Virología Molecular. 4ª edición.2005. Editorial Acribia
10. Organización Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional de la
Organización Mundial de la Salud. Garantía de calidad en el diagnóstico serológico de la
Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana. Publicación Nº 42
11. Ministerio de Sanidad y Política Social. Cataluña. España. Prueba de detección rápida de la
infección por VIH. AATRM Núm. 2007/3
12. Cristhopher Donat’s Cruz Malpica. Estandarización de la prueba de Ensayo
13. Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos para el virus
Phlebotomus fever. Tesis para optar el título de químico farmacéutico. Universidad Nacional
Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioquímica2001
14. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica.
15. Procedimientos en Microbiología Clínica.
16. Moura AC Diversidade genética, densidade populacional e potencial de promoҫão de
crescimento de rizobactérias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestría]. Bahia: Universidade
Federal do Rencôcavo; 2007
17. Chaves L Aspectos bioquímicos e moleculares de bacterias isoladas de terra preta
antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira. [Tesis Maestría] Piracicaba:
Universidade de Sâo Paulo; 2007

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