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microorganismos
Artículo

Aplicación de un fago lítico de amplio rango LPST94 para
Control biológico de Salmonella en alimentos
Md. Sharifull Islam 1,2,3  , Yang Zhou 3,4  , Lu Liang 5  , Ishatur Nime 1  , Ting Yan 1  ,
Stephan P. Willias 6  , Md. Zakaria Mia 7  , Weicheng Bei 2,3  , Ian F. Connerton 5

, Vincent A. Fischetti 8 y Jinquan Li 1,3,8, *

Laboratorio clave de dietología correlativa del medio ambiente, Facultad de Ciencia y Tecnología de Alimentos,
1
Universidad de Agricultura de Huazhong, Wuhan 430070, China; smbgb101287@yahoo.com (MSI);
smbgb101287@gmail.com (IN); yantingau@163.com (TY)

2
Colegio de Medicina Veterinaria, Universidad de Agricultura de Huazhong, Wuhan 430070, China;
beiwc@mail.hzau.edu.cn
3
Laboratorio Estatal Clave de Microbiología Agrícola, Universidad Agrícola de Huazhong, Wuhan 430070,
China; zhouyang@mail.hzau.edu.cn
4 4
Colegio de Pesca, Universidad de Agricultura de Huazhong, Wuhan 430070, China
5 5
División de Microbiología, Cervecería y Biotecnología, Universidad de Nottingham, Campus Sutton Bonington,
Loughborough, Leicestershire LE12 5RD, Reino Unido; sbzll3@nottingham.ac.uk (LL);
scziac@exmail.nottingham.ac.uk (IFC)
6 6
Departamento de Enfermedades Infecciosas e Inmunología, Universidad de Florida, Gainesville, FL 32611­2015, Estados Unidos;
swillias@ehs.ufl.edu
7 7
Departamento de Microbiología, Universidad de Jagannath, Dhaka 1100, Bangladesh; mmzakaria@yahoo.com
8
Laboratorio de patogenia bacteriana e inmunología, la Universidad Rockefeller, Nueva York, NY
10065­6399, Estados Unidos; vaf@mail.rockefeller.edu
* * Correspondencia: lijinquan2007@gmail.com

Recibido: 10 de enero de 2020; Aceptado: 11 de febrero de 2020; Publicado: 13 de febrero de 2020

Resumen: La Salmonella, uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más comunes, es un importante problema de salud pública.
y carga económica en todo el mundo. Los fagos líticos son alternativas viables a las tecnologías alternativas.
para el biocontrol de patógenos en productos alimenticios. En este estudio, se aislaron 40 fagos de Salmonella de
Muestras de agua de origen ambiental. Caracterizamos el rango lítico contra Salmonella y
entre todos los aislamientos, el fago LPST94 mostró el espectro lítico más amplio y la actividad lítica más alta.
La microscopía electrónica y la secuenciación del genoma indicaron que LPST94 pertenece a Ackermannviridae
familia Otros estudios específicos que este fago es robusto, tolerando un amplio rango de pH (4–12) y
temperatura (30–60 ◦ C) durante 60 min. La eficacia del fago LPST94 como agente de control biológico fue
evaluado en varios productos alimenticios (leche, jugo de manzana, pechuga de pollo y lechuga) inoculados con
especies de Salmonella no tifoideas a diferentes temperaturas. Curiosamente, la eficacia anti­Salmonella
de fago LPST94 fue mayor a 4 ◦ C de 25 ◦ C, aunque la eficacia varió entre diferentes alimentos
modelos. Agregar fagos LPST94 a la leche inoculada con Salmonella disminuyó el recuento de Salmonella en 3 log 10
UFC / ml a 4 ◦ C y 0,84 a 2,56 log 10  UFC / ml a 25 ◦ C utilizando una MOI de 1,000 y 10,000, respectivamente.
En jugo de manzana, pechuga de pollo y lechuga, el recuento de Salmonella se redujo en 3 log 10  UFC / ml a
tanto 4 ◦ C como 25 ◦ C después de aplicar el fago LPST94 a un MOI de 1000 y 10,000, dentro de una escala de tiempo de
48 h. Los resultados demostraron que el fago LPST94 es un candidato prometedor para el control biológico.
agentes contra la Salmonella patógena y tiene el potencial de manipulación en diferentes matrices de alimentos.

Palabras llave : fago; LPST94; Salmonela caracterización; control biológico
 Microorganisms 2020 , 8, 247; doi: 10.3390 / microorganismos8020247 www.mdpi.com/journal/microorganisms

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1. Introducción

La enfermedad diarreica por salmonelosis causada por Salmonella spp. No tifoidea. es uno de los más
frecuentes enfermedades transmitidas por alimentos en todo el mundo [1] Los principales síntomas de la infección por Salmonella son abdominales.
dolor, vómitos, diarrea inflamatoria, fiebre y dolor de cabeza [2, 3] Solo en los Estados Unidos, Salmonella
es responsable anualmente del 11% de las enfermedades, el 35% del total de hospitalizaciones y el 28% de las muertes asociadas
con enfermedades transmitidas por alimentos [4 4] Informó se informó un brote en Iowa, EE. UU., Donde más de 250 personas
estaban enfermos por consumir ensalada de pollo contaminada con Salmonella. Entre ellos, una persona murió y
más de 90 personas más fueron hospitalizadas [5 5] En China, Salmonella spp. No tifoidea. son motivo de preocupación
con un estimado de 414.8 casos que ocurrieron anualmente en la provincia de Guangdong [6 6] Salmonella afectados
contamina una amplia gama de productos alimenticios, incluidos carne, huevos, leche, verduras y frutas
jugos La contaminación por Salmonella en las preparaciones alimenticias generalmente surge de la asociación natural de
bacterias con productos de origen animal y contaminación cruzada durante los servicios de procesamiento [7 7, 8]
Las medidas de control estándar como el tratamiento térmico o los conservantes químicos pueden controlar
patógenos, incluidos varios serotipos de Salmonella, en productos alimenticios [9 9­ 11] Sin embargo, estas medidas corren
El riesgo de afectar negativamente el sabor de los productos alimenticios y reducir también la disponibilidad nutricional [12, 13]
Se ha informado que muchos conservantes químicos tienen el potencial de tener efectos secundarios adversos, incluidos
dermatitis alérgica de contacto, convulsiones, urticaria, asma, diarrea, hemorragia intestinal, etc. [14 , 15]
El procesamiento térmico puede influir negativamente en la calidad de los productos alimenticios al destruir las vitaminas.
reduciendo su valor nutricional [13] Además, los productos finales de glicación avanzada (AGE) que son
producidos por el tratamiento térmico han sido tratados como complicaciones que amenazan la salud [dieciséis] Real
Los métodos para tratar la gastroenteritis aguda por Salmonella dependen de la atención de apoyo y antibióticos.
regímenes La aplicación excesiva de antibióticos, especialmente en el entorno de la granja, ha llevado a la
selección de cepas resistentes a los antimicrobianos [17 , 18], que han contaminado los sistemas de alimentos y agua,
y plantean una amenaza mundial. En estas circunstancias, las medidas empleadas para controlar la Salmonella
no debe conducir a la resistencia a los antimicrobianos, lo que ha despertado interés en los controles biológicos.
Aunque el uso de fagos con fines terapéuticos o como agentes de biocontrol no es del todo nuevo
idea, en los últimos años, impulsado por el creciente desarrollo de bacterias resistentes a los medicamentos, interés en el fago
la terapia ha sido reavivada [19, 20] El fago como terapia ofrece muchas ventajas atractivas que incluyen
objetivo de patógenos, especificidad de huésped, muerte rápida y potencial de autorreplicación [21, 22] Hijo de los fagos
obligan a los parásitos virales de las bacterias que, a través de interacciones con receptores de superficie bacteriana únicos,
infectar procariotas específicas con las distintas firmas moleculares. Como tal, los fagos exhiben extremos
Especificidad del huésped que permite la selección selectiva de ciertos géneros o especies bacterianas. Considerando
Los fagos solo infectan a las bacterias, provocan poco daño a las células eucariotas, lo que proporciona un alto grado de
la seguridad [23, 24]
Los fagos se han utilizado para la inactivación y el control de patógenos transmitidos por los alimentos, como la Salmonella.
en diversas matrices alimentarias [25­ 30] Además, los productos de fagos disponibles comercialmente, como SalmoFresh,
Armamento, Salmonelex se ha utilizado para inactivar y controlar Salmonella en productos alimenticios [30, 31]
Como las bacterias y los fagos han evolucionado evolucionado durante millas de millones de años, las bacterias han desarrollado múltiples
sistemas de defensa contra fagos [32, 33] Nos obliga a proporcionar continuamente nuevos fagos prometedores
con rango lítico relativamente amplio y alta actividad lítica para aplicación práctica. En el presente estudio,
Se aislaron y cribaron 40 fagos adquiridos ambientalmente para determinar su rango lítico bacteriano
y actividad lítica. El fago recientemente aislado LPST94 mostró el mayor potencial con respecto al control
Salmonella zoonótica en diversas matrices alimentarias.

2. Materiales y métodos
 2.1. Cepas y condiciones de cultivo bacteriano

Se usó Salmonella enterica (UK­1, ATCC 13311) como la cepa huésped para el aislamiento de fagos. Un total de
65 cepas bacterianas diferentes, que consiste en 40 cepas de Salmonella que abarcan 11 serovares distintos como
así como una cohorte de 25 cepas que no son son de Salmonella, use usar para determinar el rango lítico del fago (Tabla S1).

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Todas las cepas bacterianas se cultivan mediante el método de placa de rayas en agar de soja tríptico (TSA; Difco TM , BD,
EE.UU.), seguido por incubación durante la noche a 37 ◦ C.

2.2. Enriquecimiento, aislamiento, purificación y preparación de fagos

Se aisló un total de 40 fagos diferentes supuestos del agua de origen ambiental.
muestras recogidas en Wuhan, China, de conformidad con los métodos previamente establecidos [34 , 35]
El enriquecimiento para el aislamiento de fagos se modificó de los métodos previamente publicados [36] En breve,
Se mezclaron 10 ml de cultivos de Salmonella en fase de crecimiento exponencial con 40 ml de medio de caldo 2­YT
(1,6 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura y 0,5 g de NaCl, en 100 ml de agua destilada; pH 7,4) y 10 ml
de muestra de agua filtrada en una proporción de 1: 4: 1 (v / v / v) para amplificar los fagos recolectados. Fagos amplificados
se aislaron por centrifugación a 8000 × g durante 15 minutos y filtración usando un tamaño de poro desechable de 0,22 µm
filtros de jeringa estériles (Millipore, Irlanda). Se usó el método de agar de doble capa para determinar el
título del stock de fagos. Las diluciones del stock de fagos (100 µl cada una) se aplican en tampón SM estéril
(NaCl 10 mM, MgSO 4  10 mM , Tris 50 mM: HCl, pH 7.5), mezclado con una suspensión de exponencial
Salmonella (aproximadamente 10 9  UFC / ml, 100 µL) y se agrega a 4 ml de fondo (45 ◦ C ≤ temperatura ≤
50 ◦ C) caldo de triptona de soja (TSB) con agar (0,7%). Las mezclas se vertieron sobre la superficie.
de placas de agar de soja tríptico (TSA) y se dejaron fraguar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de eso,
las placas se incubaron a 37 ◦ C durante 24 h, y se cuantificaron placas resultantes. Para purificar el
fagos, las placas individuales se reconocen con una pipeta o una asa de alambre, y luego se suspenden en TSB
con fase exponencial Salmonella a 37 ◦ C durante 24 h. La suspensión se centrifugó (8000 × g para
15 min) y se filtró nuevamente utilizando filtros de 0,22 µm utilizados como un cultivo de fago único. El proceso de purificación
Se repite al menos cuatro veces y luego se confirma el stock de fago individual puro. Acciones de alto título
de fagos se prepararon mezclando 100 µL del stock de fagos (aproximadamente 9 log 10  UFP / ml) con 100 µL
cultivo de Salmonella en 50 ml de caldo TSB incubado durante 12 ha 37 ◦ C. El cultivo se centrifuga
a 10.000 × g durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa estéril desechable
(0,22 µm de poro Millipore, Irlanda). Los fagos purificados se almacenaron a 4 ◦ C.

2.3. Cribado de fagos basado en pruebas puntuales y capacidad lítica

2.3.1. Determinación del espectro lítico por prueba puntual

La capacidad de los fagos para lisar diferentes serotipos de bacterias se determina mediante prueba puntual. En breve
Se detectaron 5 µL de lisados ​
de fagos en los céspedes formados por las 65 cepas bacterianas previamente afectadas en
​
Placas TSA. Las placas se incubaron a 37 ◦ C durante 24 h. Después de la incubación, cualquier césped bacteriano con
La formación de placas transparentes se considera sensible a los fagos.

2.3.2. Actividad lítica del fago LPST94

Los experimentos de actividad crítica se realizaron de acuerdo con el método descrito previamente [35 , 37]
En resumen , agregue 100 µL de cultivos frescos de Salmonella durante la noche (7 log 10  UFC / mL) a 100 µL de fago
suspensiones (MOIs 100, 10, 1 y 0.1) en una placa de 96 pocillos. El grupo de control consiste en TSB simple
medio en lugar del fago LPST94. La densidad óptica (OD 600  ) se midió con un lector de microplacas.
(Infinito M200 Pro, Tecan, 140 Suiza) a 37 ◦ C, con una lectura determinada cada 1 h para un total
duración de 24 h. Las curvas de respuesta de la actividad crítica se generaron utilizando el software PRISM.

2.4. Eficiencia de la galjanoplastia
 La eficiencia del enchapado (EOP) se determinó como se describió anteriormente [35, 38] Prueba de cepas bacterianas
se cultivaron durante la noche a 37 ◦ C y se usaron 100 µL de cada uno de los cultivos bacterianos de prueba en doble
ensayos de capa junto con 100 µL de lisado de fago diluido 10 6  –10 9  veces. Las placas fueron incubadas
durante la noche a 37 ◦ C. Después de la incubación, se contó el número de placas y la EOP relativa fue
posteriormente estimado (PFU promedio en bacterias de prueba / PFU promedio en bacterias huésped). La EOP promedio
los valores se clasifican de la siguiente manera: +++, EOP 0.5 a 1.0; ++, EOP 0.2 a <0.5; +, 0,001 a <0,2; ­, (<0.001).

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2.5. Observación morfológica del fago LPST94

Antes de la microscopía electrónica de transmisión, se obtuvo el fago de alto título LPST94 mediante granulación
fago con ultracentrifugación a 40,000 × g durante 1 h, seguido de resuspender el sedimento en pequeños volúmenes.
El fago LPST94 se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se tiñó negativamente con
0,5% de ácido fosfotunglástico (PTA) [34, 39] Posteriormente, el fago se fijó en una rejilla de cobre y el
Se capturaron imágenes de los fagos utilizando un microscopio electrónico de transmisión Philips CM12 (Hitachi
H­7000FA, Tokio, Japón), en el Instituto de Virología de Wuhan (Academia de Ciencias de China, Wuhan, China)
y analizado a través del software Digital Micrograph Demo 3.9.1.

2.6. Análisis genómico del fago LPST94

El ADN genómico del fago LPST94 se extrajo y purificó como se describió previamente [40]
El genoma fue secuenciado en la plataforma HiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) Mediante un
biblioteca de extremo emparejado con una longitud de lectura de 150 pb. Las secuencias se ensamblaron utilizando Newbler (v3.0)
resultando en un contig único. Las secuencias de ADN de codificación putativas (CDS) fueron identificadas por Glimmer
3.0 [41] Las anotaciones funcionales de CDS se identifican mediante la búsqueda en la base de datos de proteínas nr
usando BLASTP [42] La base de datos ARG­ANNOT ( http://backup.mediterranee­infection.com/article.
php? laref = 282 & titre = arg­annot) se detectaron para detectar los genes resistentes a los antimicrobianos (ARG) en fagos.
La base de datos VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm) se detectaron para detectar el factor virulento en
fago El mapa del genoma construido utilizando el software BRIG.jar. La secuencia completa del genoma de
El fago LPST94 se ha depositado en GenBank con el número de acceso MH523359.

2.7. Curva de crecimiento de un paso

Se realizó un cabo de curva de crecimiento de un paso para determinar el período latente del fago LPST94
y el tamaño de la explosión exactamente como se describió anteriormente [43 , 44] Brevemente, S. Typhimurium UK­1 creció hasta
la fase de registro medio y 1 ml de cultivo bacteriano (aproximadamente 7,3 log 10  UFC / ml) se combinan en 1 ml de fago
lisado (aproximadamente 4,3 log 10  UFP / ml) para lograr una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001. La mezcla fue
se incubaron durante 20 min a 37 ◦ C y se centrifugó posteriormente a 7000 × g durante 2 min. El sobrenadante
se descartó y el sedimento se lavó dos veces con caldo TSB. El sedimento se suspendió entonces en
10 ml de caldo TSB y se incubaron a 37 ◦ C, y 200 muestras mu l reconocidas a intervalos de 10 min durante
3 horas desde las cuales se determinaron los títulos de fagos mediante el método de placa de agar de doble capa [45] establecer
Una curva de un paso. El período latente se definió como el intervalo de tiempo entre la absorción y la
comienzo del primer estallido. El tamaño de la explosión se calculó como la relación del número final de fagos
partículas al número inicial de células huéspedes infectadas al comienzo de la prueba [33, 34]

2.8. pH y tolerancia térmica del fago LPST94

Para determinar el efecto del pH sobre la estabilidad del fago LPST94, los lisados ​
de fagos (8,49 log 10  UFP / ml)
​
se agregaron a tubos que contenían agua de peptona tamponada estéril (BPW) con valores de pH que parámetros de 2
a 13 ajustado con NaOH o HCl. Los tubos se dejan incubar a 37 ◦ C durante 60 min. Después de eso,
las soluciones de fagos se diluyeron en serie y los títulos de fagos recuperados se determinaron usando S.
Typhimurium UK­1 como huésped mediante el método de agar de doble capa [46] Para la evaluación
de Estabilidad Térmica, los lisados de fagos LPST94 (8,49 log 10  PFU / ml) se incubaron a 30 ◦ C, 40 ◦ C,
50 ◦ C, 60 ◦ C, 70 ◦ C y 80 ◦ C durante 1 h [37] Después de 30 o 60 minutos de incubación, se extrajeron alícuotas para
determinar títulos de fagos mediante la aplicación del método de agar de doble capa.
 2.9. Estabilidad de fagos en diversas muestras de alimentos

Los experimentos de estabilidad de fagos se acordaron con un método previamente descrito [47] con
pequeña modificación Brevemente, el fago se modifica a la leche, jugo de manzana, pechuga de pollo y lechuga.
para alcanzar un título final de 7 log 10  PFU / mL. Todas las muestras inoculadas (leche, jugo de manzana, pechuga de pollo,
y lechuga) se incubaron a 25 ◦ C durante 0, 1, 3, 6, 12, 24, y 48 h. En cada punto de tiempo, muestras de alimentos.

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Microorganismos 2020 , 8, 247 5 de 18

(leche o jugo de manzana o pechuga de pollo o lechuga precortadas) se tomaron para medir el título del fago usando
método de agar de doble capa.

2.10. Habilidad de formación lisogénica del fago

Para confirmar que el fago LPST94 no pudo formar el lisógeno, se realizó una inducción lisogénica.
con colonias bacterianas resistentes a los fagos [48] Una sola colonia de bacterias purificadas se inoculó en
tubo con medio de TSB de 5 ml e inducido por estrés con mitomicina C (Sigma Chemical, St. Louis, MO,
EE. UU.) Hasta una concentración final de 1 µg / ml. Las muestras se incubaron durante la noche a 37 ◦ C. Después
incubación, las bacterias se sedimentaron por centrifugación a 10.000 × g durante 10 minutos y el sobrenadante
fue examinado por la presencia de fagos. La presencia de una zona despejada después de inducir el estrés indica
que las bacterias contienen profhage en su genoma.

2.11. Control biológico de Salmonella en alimentos utilizando fagos LPST94

2.11.1. Prueba en leche y jugo de manzana

La leche pasteurizada y el jugo de manzana se compran en un supermercado local. Biocontrol de Salmonella
experimentos usando LPST94 fagos se tuvieron a 4 ◦ C (temperatura de enfriamiento) y 25 ◦ C (habitación
temperatura) descrita previamente [49] Los grupos experimentales se aclimataron a temperatura durante 20 min.
antes de agregar 9 ml de leche o jugo de manzana con S. Typhimurium ATCC 14028 o con una mezcla de S.
Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076 hasta un recuento final de 3,5 log 10  UFC / ml. Fago
LPST94 se agrega luego a un MOI de 1000 o 10,000. Se extrajeron alícuotas después de 0, 1, 3, 6, 12, 24.
y 48 h de incubación. Para la enumeración de Salmonella, sembraron en placa 100 µL de muestras diluidas en serie 10 veces,
dando el límite de detección de 1 UFC / 100 ml, y las placas se incubaron durante 48 ha 37 ◦ C.

2.11.2. Prueba en pechuga de pollo y lechuga

La pechuga de pollo y la lechuga se obtuvieron de un supermercado local y luego se cortaron asépticamente en el
laboratorio La pechuga de pollo se cortó en trozos (1 cm × 1 cm cuadrado y 0,5 cm de grosor) usando un estéril
bisturí en la placa de la estación estéril. Del mismo modo, las hojas internas de la lechuga se cortaron en pedazos.
(1 cm × 1 cm cuadrado) con un cuchillo filoso estéril. Las secciones de alimentos de 1 cm 2  se colocarán en el centro de
las placas de Petri estériles y el S. Typhimurium ATCC 14028 inoculado o una mezcla de S. Typhimurium
ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076 hasta un recuento final viable de 3 log 10  UFC / cm 2  . Phage LPST94
luego se transfirió a la superficie de la muestra con un MOI de 1000 o 10,000. Estas placas de Petri fueron
se incubó a 4 ◦ C o 25 ◦ C durante 48 h con la tapa en. Después de la incubación, la muestra se transfirió a 2 ml.
Se agregó a la muestra de tubo Eppendorf y 1 ml de tampón PBS en un ambiente estéril. El pollo
Las muestras de pechuga y lechuga se homogeneizan con barras estériles y se someten a un vórtice. Las proporciones de
Las bacterias recuperables entre el grupo de control y el grupo experimental se determinaron directamente
métodos de placa de distribución [47]

2.12 Análisis estadístico

Los recuentos de bacterias y fagos se determinaron por placas duplicadas, y todos los experimentos fueron
completado utilizando un mínimo de tres repeticiones biológicas. Los resultados se presentan como valor medio
y la varianza se determina por la desviación estándar de la media. Los análisis estadísticos fueron
 realizado con el software PRISM. Las comparaciones multivariadas se utilizan utilizando no paramétrico
análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba posterior de comparación múltiple de Bonferroni.

3. Resultados

3.1. Aislamiento y cribado de fagos

Se aisló un total de 40 fagos supuestamente diferentes a partir de muestras de agua de origen ambiental.
con Salmonella enterica serovar Typhimurium UK­1 o ATCC 13311 como bacteria huésped. Las diferencias

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en el tamaño de la placa y la turbidez se observaron entre cada aislamiento. Una colección de cepas de Salmonella
se aplicó para determinar el rango de huéspedes de todos los aislados de fagos con el mismo título. Los resultados de spot
La prueba mostrada que, de estos fagos, el 22.5% de los aislamientos (9 de 40) formaron placas transparentes y fueron
capaz de lisar más del 50% de las cepas de prueba de Salmonella (Tabla 1), mientras que el resto eran específicos
al host de aislamiento inicial. Las pruebas puntuales indicaron que el fago LPST94 tenía el rango lítico más amplio. Fago
LPST94 muestra las 40 cepas de Salmonella probadas en este estudio que representan 11 serotipos de Salmonella y
Incluye Salmonella resistente a los medicamentos. Sin embargo, todos los aislamientos de fagos no requeridos lisar E. coli o ninguno de
Las bacterias Gram­positivas y Gram­negativas probadas (Tabla 1)

Tabla 1. Sensibilidad de diferentes serotipos de Salmonella y otras cepas bacterianas contra fagos seleccionados
determinado por pruebas puntuales.

Cepas bacterianas % de prueba de manchas positivas contra Serovares de Salmonella y otras cepas bacterianas

LPSTSA LPSTSD LPSTSF LPST94 LPSTSH LPSTSK LPSTSN LPSTSP LPSTSV

Serovares de Salmonella

Typhimurium (N = 7) 85,7 100 100 100 85,7 71,4 71,4 85,7 85,7
Enteritidis (N = 5) 80 60 60 40 100 80 60 60 80 60 60 80
Dublín (N = 2) 50 100 100 100 50 100 50 100 50
Cóleraesuls (N = 1) 0 0 100 0 0 100 100 0 0 0 0 100 100
Newport (N = 1) 100 0 0 100 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0
Paratyphi B (N = 1) 100 100 0 0 100 100 100 0 0 100 100
Anatum (N = 1) 0 0 0 0 100 100 0 0 0 0 0 0 100 0 0
Pullorum (N = 1) 0 0 0 0 0 0 100 0 0 100 100 0 0 100
Javiana (N = 1) 0 0 100 100 100 0 0 0 0 100 0 0 100
Kentucky (N = 1) 100 0 0 100 100 100 0 0 100 100 0 0
S. arizonae (N = 1) 0 0 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100 100

Serovares de Salmonella resistentes a los medicamentos.

Typhimurium (N = 10) 60 60 80 90 100 80 70 90 80 90

Enteritidis (N = 8) 37,5 62,5 50,0 100 62,5 50,0 62,5 87,5 37,5

Otras cepas bacterianas

E. coli (N = 6) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A. hydrophila (N = 4) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
C. sakazakii (N = 3) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S. flexneri (N = 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
V. parahaemolyticus (N = 2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
P. aeruginosa (N = 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S. aureus (N = 3) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Listeria (N = 2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
S. Suis (N = 2) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L. acidophilus (N = 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

La actividad lítica de estos 9 fagos de rango lítico más amplio se evaluó adicionalmente utilizando un desafío
prueba contra su aislamiento inicial huésped Salmonella enterica serovar Typhimurium UK­1. Como se muestra en
Figura 1A, LPST94 inhibió con éxito el crecimiento de bacterias huésped durante 12 h, mientras que el crecimiento
de las bacterias huésped reiniciaron 4 h (p <0.05) después de la infección con todos los otros fagos (LPSTSA, LPSTSD,
LPSTSF, LPSTSH, LPSTSK, LPSTSN, LPSTSP y LPSTSV). Para establecer aún más la actividad inhibitoria
de LPST94, examinamos dos S. Typhimurium (Figura 1B, C) y dos S. Enteritidis (Figura 1D, E) cepas
durante 24 h en un rango de MOI (0.1, 1, 10 y 100). El crecimiento de S. Typhimurium y S. Enteritidis
 fueron inhibidos durante 11­12 h (p <0.05) después de agregar el fago LPST94 a MOIs de 0.1, 1, 10 y 100. Aunque
la bacteria comenzó a crecer después de 12 h, se observaron diferencias específicas al aplicar diferentes
MOI (p <0.05; ANOVA emparejado). En general, se observaron mayores efectos inhibitorios sostenidos cuando
El fago se aplicó a MOI más altos.

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Se observaron los efectos cuando el fago se aplicó a MOI más altos.

Figura 1. ( A ) Comparación de la capacidad lítica de fagos seleccionados usando S. enterica serovar Typhimurium
(UK­1) como huésped en multiplicidad de infección (MOI) de 1 en caldo de triptona soja; Capacidad lítica del fago
LPST94 para lisar S. Typhimurium y S. Enteritidis en medio de caldo de triptona soja con MOI de 100, 10, 1,
y 0,1 a 37 ◦ C in vitro. ( B ) S. Typhimurium UK­1, ( C ) S. Typhimurium ATCC 14028, ( D ) S. Enteritidis
ATCC 13076 y ( E ) S. Enteritidis SGSC 4901. Los valores representados medios con la desviación estándar de
tres réplicas de cada punto de tiempo.

3.2. Eficacia de replicación relativa del fago LPST94

Como lo señalan Mirzaei et al. Las pruebas puntuales de dilución única pueden mostrar resultados positivos falsos por lisis
desde afuera, bacteriocinas en el lisado de fagos, o la existencia de profágicos [50] Aquí, una EOP
 Se realizó una prueba para confirmar el rango de hospedante del fago LPST94 (Tabla 2) Este fago tuvo un alto
eficiencia (0.5 a 1.0) para infectar la mayoría de las cepas de S. Typhimurium en comparación con su huésped de aislamiento
S. Typhimurium UK­1, pero los valores de EOP fueron moderados (0.2 a <0.5) para algunos S. Enteritidis y
cepas de Salmonella resistentes a los medicamentos. La EOP del fago LPST94 también se analizó en 18 farmacorresistencia.
Cepas de Salmonella de nuestra colección (los perfiles de resistencia a los medicamentos de los 18 aislamientos de Salmonella son
presentado en la Tabla S4). Se observaron placas claras para las 18 cepas con valores de EOP parámetros
de 0.001 a <0.2. Estos resultados pueden ser el fago LPST94 es capaz de lisis en un rango de
Salmonella que contamina los alimentos (Tabla 2)

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Microorganismos 2020 , 8, 247 8 de 18

Tabla 2. Eficiencia del recubrimiento (EOP) del fago LPST94 contra diferentes serotipos de Salmonella.

Resistencia a las drogas
Cepas bacterianas EOP de LPST94 EOP de LPST94
Salmonela

S. Enterica serovar S. Enterica serovar
Typhimurium Typhimurium

ATCC 14028 +++ LST10 +

ATCC 13311 +++ LST11 ++
Reino Unido­1 +++ LST12 ++
ST8 +++ LST13 ++
SGSC 4903 +++ LST14 +
SL 1344 +++ LST15 +
LT2 +++ LST16 +
S. enterica serovar ++
LST17
Enteritidis
ATCC 13076 ++ LST18 +
SJTUF 10978 + LST19 +
S. enterica serovar
SJTUF 10984 +
Enteritidis
LK5­3820 ++ LSE6 +
SGSC 4901 ++ LSE7 +
S. enterica serovar Dublín LSE8 ++
3710 + LSE9 ++
3723 + LSE10 +
S. enterica serovar +
LSE11
Choleraesuis
ATCC 10708 + LSE12 +
S. enterica serovar +
LSE15
Newport
E20002725 +
S. enterica serovar
Paratyphi B
CMCC 50094 ++
S. enterica Serovar
Pullorum
CVCC 519 +
S. enterica serovar Javiana
CVM 35943 +
S. enterica serovar Anatum
ATCC 9270 +
S. enterica serovar Kentucky
CVM 29188 +
S. enterica Arizonae
CDC 346­86 +
+++, EOP 0.5 a 1.0; ++, EOP 0.2 a <0.5; +, 0.001 a <0.2.

3.3. Morfología de fagos y análisis genómico
 El examen microscópico de transmisión electrónica del fago LPST94 seleccionado que tiene un icosaédrico
cabeza y una cola contráctil larga, rígida y relativamente gruesa que termina en una placa base con púas. Sus
la cabeza tiene 67.60 ± 2.30 nm de diámetro (n = 6) y su cola tiene 116.30 ± 4.10 nm de largo (n = 6) (Figura 2UNA).
La morfología específicamente que LPST94 pertenece a la familia Ackermannviridae o Myoviridae, en el
orden de Caudovirales. El tamaño del genoma de LPST94 fue de 156.548 pb con un contenido de GC del 44,6%. ExplosiónN
El análisis muestra que el genoma del fago LPST94 tiene un alto grado de homología con el fago PhiSH19 es
la base de datos (Genbank Acc. No. JN126049). En comparación con el fago PhiSH19, LPST94 tiene adicional
ORF que codifica la fibra de la cola y las proteínas de la punta de la cola. Las múltiples fibras de la cola y las proteínas de la punta de la cola podrían ser
La razón del amplio rango lítico observado. El genoma del fago LPST94 contenía 197 predichos
ORF (Figura 2B y Tabla S2) responsables de la estructura, replicación / recombinación / reparación, nucleótido

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metabolismo, transcripción, traducción y funciones adicionales de fagos. También incluye estructural
genes para el ensamblaje de fagos, que incluye la proteína principal de la cápside, la proteína núcleo prohead, la proteasa prohead
proteína de terminación de la cabeza y proteínas de la estructura de la cola / cuello. El genoma codifica todos los componentes.
necesario para completar la estructura del fago. Los módulos de genes de replicación / recombinación / reparación codifican
proteínas de replicación (helicasas de ADN, ADN polimerasas, proteínas rIIA y rIIB, ADN primasa, etc.) y
proteínas de recombinación / reparación (proteína de unión a ADN monocatenaria, proteína de recombinación similar a RecA,
ADN reparación / proteína de recombinación, subunidad de proteína de recombinación), lo que proteínas que este fago tiene su
propio sistema de replicación / recombinación / reparación. El módulo para el metabolismo de nucleótidos codifica supuestos
dUTP difosfatasa, timidilato sintasa, subunidades beta de ribonucleótido difosfato reductasa, etc.
Las funciones genéticas para la transcripción / traducción están codificadas por un factor de transcripción sigma, Gp33 tardío
factor de transcripción del promotor y proteína represora traduccional RegA. El genoma LPST94 codifica
una serie de proteínas adicionales, como serina / treonina fosfatasa para la biosíntesis de aminoácidos,
Proteína similar a PhoH para el hambre de fosfato y glutaredoxina (Figura 2B y Tabla S2). ARG­ANNOT
la base de datos, la base de datos VFDB y las búsquedas BLASTP indican que el genoma LPST94 no codifica
factores de virulencia reconocibles, toxinas, genes codificadores resistentes a fármacos o integrasa, lo que requieren que
El fago es seguro y tiene el potencial de ser desarrollado como un agente antimicrobiano alternativo. EXPLOSIÓN
El análisis confirmó que LPST94 pertenece a la familia Ackermannviridae, en el orden de Caudovirales
(Tabla S3). La secuencia completa del genoma del fago LPST94 se depositó en GenBank bajo el
número de acceso MH523359.
número de acceso MH523359.

Figura 2. Características morfológicas y genómicas del fago LPST94. ( A ) Imagen TEM de fago
 LPST94; Barra de 100 nm, y ( B ) Mapa del genoma del fago LPST94. Los patrones se dividieron en cuatro círculos:
la longitud total del genoma se indicó en el primer círculo; El marco de lectura abierto se especificó en
el segundo círculo, y la flecha en sentido horario y la flecha en sentido antihorario representaban el avance
marco de lectura y el marco de lectura inversa, respectivamente; El contenido de GC se seleccionó en el tercer círculo;
mientras que en el cuarto círculo, la desviación de GC de GC / G + C se indica como verde y morado, y verde significaba
los valores de inclinación de GC mayores que 0 y púrpura significaron valores menores que 0. La lectura abierta
Los marcos marcados con el color de cada gen se modifica a la categoría funcional: estructura del fago (azul),
replicación / recombinación / reparación (amarillo), metabolismo de nucleótidos (granate), transcripción (naranja),
función adicional de traducción (verde) (púrpura) y proteínas hipotéticas (gris). El mapa del genoma
generado por el software BRIG.jar.

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3.4. Características del fago LPST94

Las características del fago LPST94 se muestran en la Figura 3. De acuerdo con el crecimiento de un paso
curva, el período de latencia fue de aproximadamente 10 minutos y el tamaño promedio de la explosión fue de 145 ± 10 UFP / célula
(Figura 3UNA). Este fago es muy estable con un rango de pH de 4 a 12, sin embargo, los títulos de los fagos fueron
reducido cuando el pH estaba en los rangos más altos (pH> 12) o más bajos (pH <4) (Figura 3SI). El fago
tenía un alto grado de tolerancia térmica, la estabilidad tan alta como 60 ◦ C pero reducida a 70 ◦ C y 80 ◦ C
(Figura 3C). Al incubar el fago dentro de las matrices de alimentos, incluida la leche, la pechuga de pollo y la lechuga,
El fago no seleccionó diferencia o una reducción de título mínimo dentro de la escala de tiempo experimental de 48 h.
Sin embargo, el título del fago se redujo en aproximadamente 2.5 log UFP / ml después de 48 h de incubación en jugo de manzana.
(Figura 3RE). Los resultados del ensayo de inducción lisogénica afectados que la Salmonella resistente a fagos era LPST94
incapaz de lisógenos (Figura S1). En resumen, el fago LPST94 se estableció estable en todas las condiciones de prueba
descrito anteriormente y puede ser un candidato prometedor para controlar Salmonella en los alimentos.
condiciones descritas anteriormente y pueden ser un candidato prometedor para controlar Salmonella en los alimentos.

Figura 3. Características del fago LPST94. ( A ) Curvas de crecimiento de un paso del fago LPST94 con Salmonella
 enterica serovar Typhimurium UK­1 huésped infectado a 37 ◦ C, ( B ) Tolerancia de pH de LPST94 fago (pH 2 a
13), ( C ) Tolerancia a la temperatura de LPST94 fago (30 ◦ C a 80 ◦ C), y ( D ) Estabilidad de LPST94 fago en
cuatro muestras de alimentos (leche, jugo de manzana, pechuga de pollo y lechuga) a 25 ◦ C. Los valores representan la media con
desviación estándar de tres determinaciones de cada punto.

3.5. Aplicación de Phage LPST94 en el control de S. Typhimurium y S. Enteritidis transmitidos por alimentos

Los brotes atribuidos a Salmonella a menudo se asocian con productos animales, incluidas aves de corral,
carne cruda, producción de lácteos, pero también incluye productos como aderezos para ensaladas y jugos de frutas [51] En esto
estudio, la eficacia del fago LPST94 se ensayó en diferentes matrices alimentarias contra S. Typhimurium
y S. Enteritidis.

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3.5.1. Leche

La leche se inoculó con S. Typhimurium (ATCC 14028) solo o una mezcla de Salmonella (S.
Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) hasta un recuento final viable de 3,5 log 10  UFC / ml.
Después de la incubación con el fago LPST94, se redujo el recuento viable de S. Typhimurium en la leche.
por debajo del límite de detección (<1 UFC / 100 l) después de 12 hy 24 ha 4 ◦ C utilizando una MOI de 10 000 a
1000, respectivamente (Figura 4UNA). A los 25 ◦ C después de 48 h de incubación, el recuento viable de Salmonella se redujo
desde 3.5 log 10  CFU / mL hasta 2.56 y 0.84 log 10  CFU / mL con fago agregado a un MOI de 10,000
y 1000, respectivamente (Figura 4SI). Se observaron resultados similares al usar el fago LPST94 para infectar
la mezcla de Salmonella (S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076). Hubo
eliminación casi completa de bacterias viables en la leche después de 24 hy 48 ha 4 ◦ C con una MOI de
10,000 y 1000 (Figura 4C). El biocontrol por LPST94 resultó en una disminución de los recuentos viables de Salmonella de
menos 2,48 log 10  UFC / ml y 1,22 log 10  UFC / ml con un MOI de 10.000 y 1.000 a 25 ◦ C, respectivamente
respectivamente (Figura 4D).
(Figura 4RE).

Figura 4. Efectividad del fago LPST94 en la reducción de S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis
ATCC 13076 en leche. ( A ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14.028 en leche a
4 ◦ C, ( B ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 en la leche a 25 ◦ C, ( C ) Efecto
del fago LPST94 sobre el crecimiento de la mezcla de Salmonella (S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis
 ATCC 13076) en la leche a 4 ◦ C, y ( D ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de la mezcla de Salmonella (S.
Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) en leche a 25 ◦ C. Los valores representan la media
con desviación estándar de tres determinaciones. ** Importancia de p <0.01; * Importancia de p <0.05.

3.5.2. Jugo de manzana

Similar al modelo de leche, el jugo de manzana fue inoculado artificialmente con S. Typhimurium (ATCC
14028) solo o como una mezcla de Salmonella (S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076)
un 3 log 10  UFC / mL. En relación con los controles no tratados, los recuentos viables de Salmonella (S. Typhimurium)
se redujo mediante el uso de LPST94 a un MOI de 10 000 y 1000. Cuando se incubó a 4 ◦ C, la información adicional
de LPST94 a un MOI de 10,000 y 1000, resultó en que los recuentos viables de Salmonella caen por debajo del
umbral de detección después de 12 hy 24 h, respectivamente (Figura 5UNA). También se observaron resultados similares.
CUANDO las Muestras se incubaron a 25 ◦ C, Donde se eliminaron los recuentos de Salmonella Despues de 12 hy 24 h

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tras la aplicación de fagos a una MOI de 10,000 y 1000, respectivamente (Figura 5SI). Figura 5C muestra
que cuando fago LPST94 se aplicó a 4 ◦ C contra una mezcla de S. Typhimurium ATCC14028 y
ATCC13076 con un MOI de 10,000 y 1000, el recuento viable de la bacteria se reduce significativamente a
niveles indetectables después de 12 hy 24 h respectivamente, lo que fue consistente con la Salmonella única
modelo de cepa. Sin embargo, cuando LPST94 se aplicó a la mezcla de anfitrión Salmonella en 25 ◦ C, el fago
la eficacia antibacteriana se vio perjudicada comparativamente, ya que el tiempo para alcanzar niveles indetectables fue
correspondientes a 24 hy 48 husando los MOI similares de 10,000 y 1000 (Figura 5RE).

Figura 5. Efectividad del fago LPST94 en la reducción de S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis
ATCC 13076 en jugo de manzana. ( A ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 es
jugo de manzana a 4 ◦ C, ( B ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 en jugo de manzana
a 25 ◦ C, ( C ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de la mezcla de Salmonella (S. typhimurium ATCC 14028
y S. Enteritidis ATCC 13076) en zumo de manzana a 4 ◦ C, y ( D ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de
Mezcla de Salmonella (S. typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) en zumo de manzana a 25 ◦ C.
Los valores representados por los medios con la desviación estándar de tres determinaciones. ** Importancia de p <0.01;
* Importancia de p <0.05.
 3.5.3. Pechuga de pollo
El fago LPST94 confirmó una reducción apreciable de los recuentos viables de Salmonella en las pechugas de pollo en
tanto 4 ◦ C como 25 ◦ C con MOI de 10,000 y 1000 (Figura 6) Cuando se administra una MOI de 10,000,
fago LPST94 reducir Salmonella viable por debajo del nivel de detección a 4 ◦ C después de 6 h (Figura 6A) y en
25 ◦ C después de 12 h de incubación (Figura 6SI). En el caso de una MOI de 1000 inoculaciones, se eliminó LPST94
Sobrevivir Salmonella Debajo de los Límites detectables Despues de 12 h de Incubación un Ambos un 4 ◦ C (Figura 6A) y
25 ◦ C (Figura 6SI). La mezcla de Salmonella también se eliminó con MOI de 10,000 y 1000 en ambos
4 ◦ C (Figura 6C) y 25 ◦ C (Figura 6D), aunque, el período de incubación para esta reducción completa
fueron 12 h para cada uno.

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la reducción fue de 12 h para cada uno.

Figura 6. Efectividad del fago LPST94 en la reducción de S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis
ATCC 13076 en pechuga de pollo. ( A ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028
en pechuga de pollo a 4 ◦ C, ( B ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 es
pechuga de pollo a 25 ◦ C, ( C ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de la mezcla de Salmonella (S. Typhimurium
ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) en el pecho de pollo a 4 ◦ C, y ( D ) Efecto de LPST94 fago en
crecimiento de la mezcla de Salmonella (S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) en pollo
mamá a 25 ◦ C. Los valores representan la media con la desviación estándar de tres determinaciones. ** SIGNIFICADO
de p <0,01; * Importancia de p <0.05.

3.5.4. Lechuga

La capacidad del fago para reducir la contaminación artificial de Salmonella de la lechuga también fue
detectado, con reducciones por debajo del nivel de detección de Salmonella en 4 ◦ C y 25 ◦ C después de 6 h
usando un MOI de 10,000 y 1000, respectivamente (Figura 7A, B). El efecto del fago contra una mezcla de
Salmonella en la lechuga era comparable sin Salmonella viable observa a 4 ◦ C después de 6 hy 12 h
usando un MOI de 10,000 y 1000, respectivamente (Figura 7C). Igualmente, hubo una reducción completa de
la mezcla de Salmonella en 25 ◦ C después de 12 h (Figura 7RE).
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Microorganismos 2020 , 8, 247 14 de 18

Figura 7. Efectividad del fago LPST94 en la reducción de S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis
ATCC 13076 en lechuga. ( A ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 es
lechuga a 4 ◦ C, ( B ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de S. Typhimurium ATCC 14028 en la lechuga en
25 ◦ C, ( C ) Efecto del fago LPST94 sobre el crecimiento de la mezcla de Salmonella (S. Typhimurium ATCC 14028
y S. Enteritidis ATCC 13076) en la lechuga en 4 ◦ C, y ( D ) Efecto de LPST94 fago en el crecimiento de
Mezcla de Salmonella (S. typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis ATCC 13076) en la lechuga a 25 ◦ C.
Los valores representados por los medios con la desviación estándar de tres determinaciones. ** Importancia de p <0.01;
* Importancia de p <0.05.

4. Discusión

En este estudio, se aislaron 40 supuestos fagos diferentes del agua de origen ambiental.
muestras y cribados para identificar un nuevo fago de acción amplia contra especies de Salmonella [52, 53] Establecido
En el análisis del espectro lítico, el fago LPST94 seleccionado un amplio rango lítico y actividad lítica relacionada contra
los 11 serotipos de Salmonella probados, incluidos S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum, S. Dublin,
S. Anatum, S. Arizonae, S. Javiana, S. Kentucky, S. Newport, S. Paratyphi B y S. Choleraesuls.
Curiosamente, el fago LPST94 también podría ser la Salmonella resistente a múltiples fármacos. Placas claras fueron
 observamos para las 18 cepas de Salmonella resistentes a múltiples fármacos analizadas después de la infección por fagos LPST94.
El fago LPST94 tenía una alta actividad crítica contra todas las Salmonella in vitro y podría inhibir la
crecimiento de 4 Salmonella (S. Typhimurium UK­1, S. Typhimurium ATCC 14028, S. Enteritidis ATCC
13076 y S. Enteritidis SGSC4901) durante un máximo de 11 h con MOI de 0.1, 1, 10 y 100. En comparación, el
Se informó que el fago FGCSSa1 inhibe el crecimiento de su huésped (S. Typhimurium PT160) durante hasta 2 ha
MOI de 0.3 y 2.5 [52]
La microscopía electrónica de transmisión y el análisis del genoma confirmaron que el fago LPST94 pertenencia
a la familia Ackermannviridae. La morfología del fago con colas largas se considera profesionalmente
tipos de fagos líticos [54], que puede aplicarse en estrategias antibacterianas basadas en fagos [ 55] Phage LPST94
era robusto, que exhibe estabilidad sobre el rango de pH 4 a 12 y capaz de mantener la lisis actividad a 60 ◦ C
durante al menos 60 min. El pH y la estabilidad térmica del fago LPST94 indican que puede limitar.
para el biocontrol sobre una variedad de condiciones empleadas en el procesamiento de alimentos. Este estudio identificado que
el fago permaneció estable durante 48 h en leche, pechuga de pollo y lechuga, pero fueron 2.5 log 10  PFU / mL de pérdidas
visto en jugo de manzana potencialmente debido a la presencia de ácido débil. Sin embargo, pequeñas pérdidas en títulos de fagos

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en diversas muestras de alimentos (col china, pechuga de pollo, mariscos mixtos y leche con chocolate) tienen
sido observado por otras investigaciones [28, 47] Estos resultados afectados que el fago LPST94 tiene un potencial claro
para ser aplicado en muestras de alimentos crudos y procesados.
Además, determinamos la eficiencia de este fago para reducir los recuentos de Salmonella en los alimentos.
En experimentos con leche, fago LPST94 redujo los recuentos de Salmonella viables 3 log 10  en 4 ◦ C y 2,56 log 10
UFC / ml a 25 ◦ C después de 48 h de incubación, que es la mayor eficiencia en comparación con el fago PA
13076 que se informó para reducir S. Enteritidis ATCC13076 por 1 log 10  UFC / ml a 4 ◦ C y 25 ◦ C después de
5 h de incubación en la leche [28] Dentro de jugo de manzana, fago LPST94 reduce Salmonella por 3 log 10  en 4 ◦ C después de
Incubación de 12 h usando un MOI de 10,000, similar al reportado para el fago P22 [56] En pechuga de pollo
y la lechuga, los recuentos de Salmonella cayeron por debajo de los niveles detectables (<1 UFC / 100! l) a 4 ◦ C y 25 ◦ C a partir de
6 ha 12 h de incubación. Esto se puede comparar con una reducción de 3 log 10  en el recuento viable de Salmonella
informado después del tratamiento con fagos para la col china [28], 1,7 log 10  reducción para lechuga [26], 1.37 log 10
para mostaza y reducción de 0,55 log 10  para brócoli [57]
El análisis de secuencia genómica del fago LPST94 reveló similitud con el fago PhiSH19 pero con
características novedosas que confieren funciones prospectivas para infección y proliferación. Phage LPST94
genoma contenía genes para estructura y replicación / recombinación / reparación, metabolismo de nucleótidos,
transcripción, traducción y funciones adicionales para fagos. Estos resultados indicaron que este fago
pudo replicarse eficientemente pero no pudo formar un lisógeno en Salmonella [58­ 60] Además, una característica
del fago LPST94 fue que codificó varias proteínas diferentes de pico de cola que se hipotetizan
como indicador de un amplio rango lítico [61] Las puntas de la cola reconocen, unen y cortan el
LPS O­antígeno de S. Typhimurium [62] : Además, el genoma del fago no codificó Ninguna virulencia.
genes, toxinas, marcadores resistentes a los medicamentos o genes de integración, lo que indica que este fago tiene el potencial
por desarrollarse como un agente antimicrobiano alternativo sin ningún efecto dañino en humanos
y animales.

5. Conclusiones

Hemos aislado un nuevo fago lítico huésped amplio LPST94 contra diversos serotipos de Salmonella.
El fago LPST94 exhibió tolerancia contra un rango de pH, condiciones térmicas y estabilidad durante 48 h tras
incubación con diferentes muestras de alimentos, propiedades que son un requisito previo para un agente de biocontrol que pueda
ser aplicado directamente en muestras de alimentos. Estudios posteriores evaluados que este fago puede controlar efectivamente la Salmonella
cepas en una variedad de muestras de alimentos (leche, jugo de manzana, pechuga de pollo y lechuga), lo que muestra fago
LPST94 es un candidato principal para el control biológico de Salmonella.

Materiales complementarios: los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/2076­2607/8/2/247/s1 .
Figura S1. La confirmación de LPST94 no pudo formar lisógeno. Inducido por mitomicina C, que se encuentra que contiene
fago lisogénico. Tabla S1. Lista de cepas bacterianas utilizadas en este estudio. Tabla S2. Anotación funcional de LPST94
 CDS que utilizan BLASTP y dominios conservados. Tabla S3. Comparación de fagos contra el genoma LPST94.
Tabla S4. Perfiles de resistencia a antibióticos de los síntomas clínicos de Salmonella.

Contribuciones de los autores: este trabajo se realizó en colaboración con todos los autores. Conceptualización, MSI,
YZ y JL; Conservación de datos, MSI, IN, YZ y TY; Análisis formal, MSI y JL; Adquisición de fondos, JL;
Investigación, MSI, YZ y JL; Metodología, MSI, YZ e IN; Administración de proyectos, MSI y JL;
Recursos, MSI, JL; Software, MSI y JL; Supervisión, JL; Validación, MSI y JL; Visualización, MSI,
YZ y JL; Redacción: borrador original, MSI; Redacción: revisión y edición, JL, MSI, LL, SPW, MZM, WB,
IFC, VAF e YZ Todos los autores han publicado y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Financiación: Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772083),
Fondo especial para la innovación tecnológica de la provincia de Hubei (2019AHB07), el National Key Research y
Programa de Desarrollo de China (2017YFC1600100), los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales
(2662017JC040, 2662016QD010), Consejo de Becas de China (201806765004) y Innovación nacional y
Programa de formación empresarial para estudiantes universitarios (S201910504071, 201810504087).

Conflictos de intereses: todos los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

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© 2020 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es de acceso abierto.

artículo distribuido bajo los términos y condiciones de Creative Commons Reconocimiento
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