Fisiología Microbiana

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Prof. Aura Falco
Correo-e: aura.falco00@usc.edu.co
 Quiz virtual - Moodle

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• Este cuestionario se cerrará el jueves, 2 de abril de 2020, 18:45

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 Taller

1. Indique 2 características microbiológicas de cada uno de los

siguientes microorganismos: Lactococcus lactis, Lactobacillus

plantarum e Eimeria tenella.

2. ¿Cuál es la importancia del manitol a nivel industrial?

3. ¿Cuál es el objetivo del trabajo?

4. Realice un esquema en el que se observen de forma ordenada,

los pasos que se realizaron para llevar a cabo la investigación.

3
5. Indique 2 conclusiones del trabajo.
 Escucho sus
opiniones sobre
el artículo

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 Microorganismos

Lactococcus lactis
• Son cocos, Gram positivos.
• Se agrupa en pares o forma cadenas cortas.
• Anaerobio facultativo.
• Bacteria ácido láctica, homofermentativa.
• No esporula y no es motil
• Habita en superficie de animales y plantas.
• Cromosoma circular (2,36x106 pb).

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 Microorganismos

Lactobacillus plantarum
• Son cocos, Gram positivos.
• Se encuentra sola o formando cadenas cortas.
• Es una bacteria ácido láctica, heterofermentativa:
ácido láctico, acético, succínico y etanol.
• No motil.
• Anaerobio facultativo.
• Habita el tracto gastrointestinal (probiótico), en
frutas y en vegetales.
• Se emplea para hacer yogurt y quesos como el
mozzarella.
• Tamaño del cromosoma: 3,5 Mpb.
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 Microorganismos

Eimeria tenella
• Es un protozoario parásito.
• Tiene un solo hospedero:
pollos.
• Causa diarreas conocidas como
coccidiosis.
• Transmisión: fecal-oral.
• Produce esporas.
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 Sobreproducción de Manitol 1-Fosfatasa heteróloga: un
factor clave para la producción de manitol por L. lactis

• El manitol es una forma reducida de la fructosa.

• Los microorganismos lo emplean para mantener el
equilibrio REDOX y como osmoprotector (tienen
un papel en el mantenimiento del volumen celular
y el equilibrio de fluidos).
• Mejora la viabilidad de cultivos de L. lactis
(durante el proceso de secado), que se emplea a
diario en la industria alimentaria.
• El uso de L. lactis productora de manitol puede
resultar en productos fermentados con un valor
agregado debido a que tiene un efecto beneficioso
porque funciona como antioxidante y puede
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reemplazar a la sacarosa como edulcorante de
bajo contenido calórico.
 Antecedentes

• Detectaron la formación de altas concentraciones de manitol y de la

enzima Manitol 1-fosfatasa (M1Pasa) en cultivos en fase estacionaria de

una cepa de L. lactis deficiente en la enzima Lactato DH.

• En esta misma cepa, pero fase exponencial, se detectó baja

concentración de manitol extracelular.

• La inactivación del sistema de transporte de manitol en esta misma cepa,

resultó en una alta producción de manitol extracelular.

• Cerca de ⅓ de la glucosa fue convertida en manitol por células en estado

estacionario, y no se observó la utilización indeseada de manitol, tras el 9

agotamiento de la glucosa.
 La pregunta de investigación

¿Qué hacer?
L. lactis no produce manitol

Fosfoglucosa M1Pase
isomerasa (M1-fosfatasa)

M1PDH
(Manitol-1-fosfato dehidrogenasa)
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Figura 1. Vía propuesta para el metabolismo de glucosa y manitol en L. lactis.
 Motivación - Justificación

• Basados en el modelo anterior y, tomando en cuenta los resultados

previos, el clonamiento y la expresión del gen que codifica para la M1Pasa

en L. lactis, parecía un paso lógico para aumentar la producción de manitol.

• Sin embargo, no había un gen bacteriano que estuviera anotado en la base

de datos y que codificara para la M1PAsa. Sin embargo, había una M1Pasa

disponible para el protozoario parásito llamado Eimeria tenella.

• En estos parásitos, el manitol es muy importante pues lo emplea como un

candidato de reserva para el proceso de esporulación.

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 Objetivo

Investigar el efecto de la sobrexpresión del gen que codifica para

la M1Pasa en E. tenella, en tres cepas de L. lactis:

• En una productora de manitol: NZ9000,

• En una Lactato DH deficiente: NZ9010 y,

• En una con actividad fosfofructoquinasa reducida: HWA217

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 2. Metodologías de forma ordenada

1.
Clonamiento
de genes e
incorporarlos
en las cepas
bacterianas

2.
5. Análisis de Sobrexpresión
los resultados de los genes
clonados

4. Análisis de
los productos
3. Ensayos
de 13
enzimáticos
fermentación
de la gsa
 Dicho en otras palabras…

M1Pasa
(gen heterólogo)
Actividad M1PDH
Fosfofructoquinasa (Manitol-1-fosfato
reducida dehidrogenasa)

Lactato DH

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 Plan de trabajo: Construcción de plásmidos

+ mtdL (Manitol-1-
Fosfatasa DH) de
Lactobacillus plantarum +
+ M1Pasa (Manitol-1-
Fosfatasa) Eimeria tenella
= pWW003

+ M1Pasa (Manitol-1-
Fosfatasa) Eimeria tenella
= pWW002
Inductor: nicina (antibiótico
de naturaleza peptídica)
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 Plan de trabajo: Electroporación de plásmidos

+ M1Pasa (Manitol-1-
Fosfatasa) Eimeria tenella • L. lactis NZ9000: cepa capaz de
= pWW002
producir manitol.
• L. lactis NZ9010: cepa Lactato DH
deficiente.
• L. lactis HWA217: actividad
+ mtdL (Manitol-1- fosfofructoquinasa reducida.
Fosfatasa DH) de
Lactobacillus plantarum +
M1Pasa de Eimeria
tenella = pWW003
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Resultados: Sobrexpresión de los genes MP1asa y M1PDH

• La inducción de
NZ9000(pWW002) no formó
manitol, todo se dirigió a la
formación de ácido láctico.
• Ocurrió lo mismo con las cepas
NZ9010 y HWA217.

El aumento en la expresión del gen M1Pasa, no

resultó en la producción de manitol.
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Resultados: Sobrexpresión de los genes MP1asa y M1PDH

• La sobrexpresión simultánea de los

genes M1Pasa y M1PDH resultó en
la producción de manitol.
• La baja actividad M1Pasa se debe a
la falta de un sitio de unión a
ribosoma hacia el extremo 5´ del
gen M1Pasa clonado en pWW003.

El aumento en la expresión de los genes M1Pasa y M1PDH,

resultó en la producción de manitol, a pesar de las
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diferencias genéticas (%GC) entre E. tenella y L. lactis NZ9000
 Plan de trabajo: Análisis de los productos de fermentación y
del consumo de glucosa

Cromatografía líquida +
Cultivos de L. lactis Detección de índice de
1 min a 10.000g
refracción

Lactato, acetato, glucosa,

manitol, entre otros.

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Plan de trabajo: Extractos celulares para ensayos enzimáticos

Cultivos de L. lactis a Ruptura celular con perlas

DO600nm 2 horas de vidrio con agitación
después de inducir vigorosa a 4°C durante 5
con nisina min

2 min a 10.000g
4°C

Sobrenadante
Ensayos enzimáticos
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Plan de trabajo: Ensayos enzimáticos – Reducción de la fructosa

Mezcla de rx:
M1PDH
Fructosa-6-P + NADH + Extracto celular NAD

340 nm
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Plan de trabajo: Ensayos enzimáticos – Actividad M1Pasa

Mezcla de rx:
M1Pasa
Manitol-1-P + Extracto celular Pi

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 Resultados: Producción de manitol a través de la sobrexpresión
de M1PDH y M1Pasa

Las células fueron crecidas anaeróbicamente y se indujo la producción de

ambas enzimas con concentraciones crecientes de nisina.
µmoles/min por mgr de proteína

NZ9000(pWW003) HWA217(pWW003) NZ9010(pWW003)

Barra negra: M1Pasa

Barra gris: M1PDH

Concentración de nisina (ngr/ml)

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Hubo un aumento en la actividad de ambas enzimas
Resultados: Producción de manitol a través de la sobrexpresión
de M1PDH y M1Pasa

NZ9000(pWW003) HWA217(pWW003) NZ9010(pWW003)

Hubo un aumento en la actividad de ambas enzimas 24

Resultados: Producción de manitol a través de la
sobrexpresión de M1PDH y M1Pasa

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Resultados: Producción de manitol de forma M1Pasa dependiente

0,11 mol de
manitol por
mol de gsa

Barra negra: M1Pasa

Barra gris: M1PDH

• A mayor concentración de nisina, se obtuvo un nivel alto y estable de M1PDH y el

aumento en la actividad M1Pasa.
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• A mayor actividad de M1Pasa, mayor producción de manitol.
 Conclusiones

• Se ha demostrado que la sobreproducción combinada de las enzimas

M1PDH y M1Pase es una estrategia exitosa para obtener una cepa de L.
lactis productora de manitol.
• Este es el primer trabajo que presenta la producción de manitol de forma
elevada y estable en cultivos celulares de L. lactis es fase de crecimiento y
no en fase estacionaria
• Los resultados obtenidos enfatizan la importancia de la actividad de la
enzima M1Pasa para la producción de manitol en L. lactis, e indica que
una cepa deficiente en LDH pero con elevada actividad de las enzimas
M1PDH y M1Pasa, podría ser un buen candidato para la producción de
manitol en productos alimenticios.
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