Guía Unificada de Laboratorios Código FLA-23 v.

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Departamento de Bacteriología y Lab. Clínico
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1. Título

Guía 10. Diversidad Metabólica de los microorganismos II. Utilización de Otras Fuentes de
Carbono. Utilización de aminoácidos

2. Objetivo

Determinar la habilidad de los microorganismos de utilizar diversas fuentes de carbono y

energía.

2.1Objetivos Específicos

- Diferenciar microorganismos con capacidad o no de utilizar el citrato como única fuente

de carbono.
- Identificar los microorganismos capaces de oxidar el aminoácido triptofano por la
síntesis de diversas enzimas intracelulares (triptofanasas).
- Diferenciar los organismos capaces de utilizar el aminoácido lisina ya sea por
descarboxilación o desaminación.
- Reconocer los microorganismos con capacidad de metabolizar el malonato.
- Reconocer los microorganismos con capacidad de desaminar la fenilalanina .

3. Marco Teórico

UTILIZACIÓN DE OTRAS FUENTES DE CARBONO Y ENERGÍA

PRUEBA DE UTILIZACIÓN DEL CITRATO
Fundamento: El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, un compuesto orgánico
simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Algunas bacterias pueden obtener energía por vías diferentes a la fermentación de
hidratos de carbono, utilizando el citrato como única fuente de carbono. El metabolismo
del citrato, realizado por algunas bacterias, se realiza por el ciclo del ácido cítrico (Krebs o
ATC) y requiere del desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetato-
liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y la presencia de
transportadores como citrato permeasas. Generalmente un microorganismo que utiliza
citrato como su única fuente de carbono utiliza también sales de amonio como su única
fuente de nitrógeno.

La citritasa actúa sobre el citrato produciendo ácido oxalacético y acetato; productos que
son convertidos enzimáticamente a piruvato y dióxido de carbono. Durante esta reacción
el medio comienza a alcalinizarse por el dióxido de carbono que se genera, el cual se
combina con el agua y el sodio para formar carbonato, un producto alcalino, este
carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH del medio
de verde a azul prusia oscuro (indicador: El azul de bromotimol, amarillo a pH menor de
6.0 y azul a pH mayor de 7.6). El medio incluye citrato, como una fuente de carbono y
fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.
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Medio de cultivo : Agar citrato de Simmons

Técnica: Inocular el tubo con Agar Citrato de Simmons realizando siembra por estría
tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37ºC por 24 horas.

Interpretación: El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba
positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en el
medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva en ausencia
de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de la estría de
inoculación.

Citrato  ácido oxalacético + acetato  Piruvato + CO2 + exceso de Na  Na2CO3

PRUEBA DEL MALONATO

Fundamento: El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias
como única fuente de carbono con formación de productos alcalinos que se evidencia por
un viraje de verde a azul del indicador del medio, azul de bromotimol. Si un organismo es
capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, al mismo tiempo
que utiliza el sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, se produce un aumento de la
alcalinidad que se debe a la formación de hidróxido de sodio (NaOH).

Medio de Cultivo: Caldo Malonato

Técnica: Inocular 1-2 asadas en el Caldo Malonato de una colonia del microorganismo en
estudio. Incubar a 37ºC por 24 horas.

Interpretación: El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva.

UTILIZACIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas son polímeros de gran tamaño y peso molecular, por lo tanto los
microorganismos necesitan inicialmente hidrolizar estas macromoléculas empleando
enzimas específicas para llevarlas a sus unidades monoméricas, los aminoácidos, los
cuales contienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.

Existen microorganismos que utilizan compuestos orgánicos diferentes a hidratos de

carbono como fuente de energía y carbono. Ellos usan un sólo compuesto para este fin y
encuentran que un aminoácido puede actuar como donador y aceptor de electrones
suministrando así la energía necesaria para su crecimiento. Los productos resultantes de
su descarboxilación y/o desaminación producen olores penetrantes y putrefactos.
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CALDO DESCARBOXILASA DE MÖELLER

Fundamento: El caldo descarboxilasa de Möller es el medio base más comúnmente
utilizado para determinar la capacidad de descarboxilación de aminoácidos por las
Enterobacterias.
El aminoácido por ensayar se añade al medio base antes de inocular el microorganismo
en estudio. Se debe emplear paralelamente un control que consiste en un tubo con medio
base sin el aminoácido. Ambos se incuban anoxigénicamente adicionando una capa de
aceite mineral estéril.

Durante las etapas iniciales de incubación ambos tubos se vuelven amarillos debido a la
fermentación de la pequeña cantidad de glucosa del medio (pH de 5.6). Si el aminoácido
es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio retorna a su color púrpura
inicial. Los aminoácidos Lisina, Arginina y Ornitina son tres aminoácidos ensayados y
producen las siguientes aminas específicas:

Lisina  Cadaverina (descarboxilasa)

Ornitina
Arginina


Putrescina
Citrulina
(descaboxilasa)
(dehidrolasa)

Medio de Cultivo: Caldo descarboxilasa de Möller

Técnica: Inocular con material de una colonia de un cultivo axénico del microorganismo en
estudio, dos tubos de caldo de Möeller, uno con el aminoácido y otro sin aminoácido
(control). Cubrir ambos tubos con 1 ml de aceite mineral estéril. Incubar a 37ºC por 24
horas.

Interpretación: El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el

microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente como para
activar las enzimas descarboxilasas. El retorno al color púrpura o violeta del tubo que
contiene el aminoácido indica una reacción positiva debida a la liberación de aminas por
descarboxilación.

PRUEBA DE INDOL: MEDIO DE SIM (SULFURO-INDOL-MOVILIDAD)

Fundamento: El indol, es uno de los productos de la degradación metabólica del
aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco.

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol

reacciona con el grupo aldehído p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo
del reactivo de Kovac’s.

Medio de cultivo: Medio de SIM (puede emplearse un caldo triptofano).

Revelador: Reactivo de Kovac’s.

Técnica: Inocular el medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a
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partir de un cultivo axénico del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37ºC. Al

finalizar este período, añadir 5 gotas del reactivo de Kovac’s por la pared del tubo.

Interpretación: El desarrollo de un color rojo fuscia en la interfase del reactivo y del medio,
segundos después de añadir el reactivo de Kovac´s indica la presencia de indol y por lo
tanto una prueba positiva.

PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA

Fundamento: La fenilalanina es un aminoácido que por desaminación forma un cetoácido,
el ácido fenilpirúvico. La prueba se basa en la detección del ácido fenilpirúvico en el
medio, tras el desarrollo del microorganismo en estudio. La prueba es positiva si aparece
un color verde visible por adición de una solución de cloruro férrico al 10%.

Medio de cultivo: Agar Fenilalanina

Revelador: Cloruro férrico al 10%.

Técnica: Inocular el agar en pico de flauta con una colonia del microorganismo en estudio
realizando siembra por estría. Incubar 24 horas a 37ºC. Después de este tiempo adicionar
5 gotas de Cloruro Férrico al 10% directamente sobre la superficie del agar.

Interpretación: La inmediata aparición de un color verde intenso indica la presencia de

ácido fenilpirúvico y una prueba positiva. Un color amarillo en el sitio de inoculación, indica
una prueba negativa.

AGAR LISINA - HIERRO (LIA)

Fundamento: Es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la
lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, además la presencia de sales de hierro sirve
para detecta la producción de H2S por algunos microorganismos entéricos.

La descarboxilación de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico, o sea en el fondo del tubo

y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo un viraje del indicador
púrpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina
primero una reacción de fermentación, produciendo acidificación y cambio de color del
medio a amarillo y el pH favorable para la reacción de descarboxilación que ocurre
después, volviendo a su color violeta original el fondo del tubo.

La desaminación de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus y

Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo ácido  cetocarbónico
que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxígeno forma un color violeta
rojizo.
La producción de ácido sulfhídrico se evidencia por la presencia de un precipitado negro
por utilización de las sales de hierro.
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Medio de cultivo: Medio LIA

Técnica: Inocular realizando siembra mixta (con doble picadura) a partir de una colonia de
un cultivo axénico del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37ºC.

Interpretación:

A: reacción ácida. Color amarillo K/K: Descaboxilación de la lisina

K: reacción alcalina. Color K/A: Descarboxilación negativa.Fermentación de la
violeta glucosa.
R: reacción alcalina. Color rojo R/A: Desaminación de la lisina. Fermentación de la
glucosa.

4. Materiales, equipos e Insumos

Equipos:
 Incubadora

Materiales:
 Implementos de bioseguridad: guantes, careta o gafas de protección, bata manga
larga.
 Asas bacteriológicas
 Cinta de enmascarar
 Mechero de bunsen
 Fósforos
 Lápiz marcador
 Pipetas pasteur estériles
 Pipetas de 1ml estériles
 Macropipeteadores

5. Reactivos y Medios de cultivo

 Aceite mineral estéril.

 Cepas bacterianas en Agar nutritivo y Mac Conkey de: Escherichia coli, Enterobacter
cloacae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter sp.
 Medios de Cultivo: Agar citrato de Simmons, Caldo malonato, Medio fenilalanina,
Medio de SIM, caldo triptofano, Caldo Möller con aminoácidos Lisina, Arginina y
Ornitina, Medio LIA.
 Reveladores: Cloruro férrico 10%, Reactivo de Kovac’s.
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6. Procedimiento

Primer día:
1. Cada grupo de estudiantes recibirá una bacteria y una batería de medios de cultivo.
Realice las siembras en los medios de cultivo suministrados según la técnica para cada
prueba.
2. Incubar a 37ºC por 24 horas.

Segundo día
1. Observe, interprete y reporte los resultados de las reacciones ocurridas en cada medio
de cultivo.
2. Compare los resultados obtenidos con los de otros grupos de Laboratorio

Informe: Reporte y analice los resultados obtenidos.

Causas de error
 Incorrecta realización de la técnica de siembra.
 Fallas en la lectura e interpretación de las reacciones bioquímicas

7. Nivel de Riesgo

Nivel 2 (Riesgo Medio)

8. Bibliografía

Koneman, E. et al. 2003. “Diagnóstico microbiológico”. Argentina. 5a edición. Editorial

Médica Panamericana
CULTIMED. Manual básico de Microbiología en:
http://www.ictsl.net/downloads/microbiologia.pdf
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U3c_PruebasBioquimicas_17461.PDF

9. Anexos

CONSULTA

1. Busca la composición de cada uno de los medios de cultivo y de los reveladores

empleados en la práctica de laboratorio.
2. Realice un cuadro resumen de cada una de las pruebas realizadas, que incluya
fuente de energía,medio de cultivo, reacciones, reveladores, lectura e
interpretación