 Diagnóstico y detención de Staphylococcus aureus 

 Diagnostico

Los datos clínicos y epidemiológicos son fundamentales para orientar el diagnóstico microbiológico, así como la
sospecha del agente etiológico causante de la infección, por lo que se requiere del aislamiento y la identificación de S.
aureus a partir de muestras clínicas. Entre dichas muestras se encuentra en la sangre, tejidos, líquidos normalmente
estériles, aspirados de abscesos, las cuales al ser teñidas con la tinción de Gram permiten observar la forma y
agrupación, así como una respuesta inflamatoria con la presencia de leucocitos polimorfonucleares.

Interpretación de los resultados:  la detección de Staphylococcus aureus en un hemocultivo siempre debe considerarse
clínicamente significativa, incluso si solo se observa un único frasco de hemocultivo positivo. La identificación de
hemocultivos positivos debe impulsar el inicio de la terapia empírica, así como una evaluación clínica adicional.
Hemocultivos de seguimiento: los hemocultivos deben extraerse cada 24 a 48 horas hasta que se demuestre la
eliminación.
La bacteriemia persistente por S. aureus a pesar de la terapia antibiótica adecuada es importante para el pronóstico. En
una gran cohorte europea que incluía a más de 900 pacientes, se observó una duración de la bacteriemia de al menos un
día adicional después de comenzar la terapia antibiótica adecuada en el 32 por ciento de los casos; entre estos
pacientes, la mortalidad a los 30 días fue el doble que la de los pacientes cuyos hemocultivos se aclararon
inmediatamente (28 frente a 13 por ciento)

 Detección

La enzima se encuentra presente en dos formas. 

-Coagulasa libre: Es una proteína extracelular, que se encuentra presente en los filtrados de cultivos, la misma reacciona
con el factor reactivo de la coagulasa (FRC) presente en el plasma, para formar una sustancia similar a la trombina
(estafilotrombina), actúa indirectamente en la conversión del fibrinógeno en fibrina.
-Coagulasa ligada: La coagulasa ligada o factor de aglutinación no está presente en filtrado de cultivos. Convierte el
fibrinógeno en fibrina insoluble de forma directa sin intervención de los factores plasmáticos.

La función de la coagulasa in vivo no ha sido todavía aclarada y aún queda en el campo especulativo, aunque está bien
esclarecido, que esta enzima está implicada en el desarrollo de los abscesos, mediante la formación de una capa de
fibrina alrededor de la lesión, lo que impide la localización y fagocitosis del agente patógeno. 2

Se identificaron otros factores que intervienen en la patogenicidad del mismo mediante el mecanismo de la coagulación.
La expresión de estos factores empleando las técnicas de recombinación genética en microorganismos poco patógenos
como Lactococcus lactis, permitió conocer que los mismos se encuentran directamente asociados a su patogenicidad. 

Para la identificación de S. aureus es necesario utilizar algunas pruebas bioquímicas y medios de cultivo especiales que
permitan su fácil determinación. Esta identificación se basa en las enzimas y las toxinas que produce el microorganismo.
Aprovechando estas características se han diseñado medios para aislar esta bacteria, ques son Baird-Parker, agar salado
manitol, agar estafilococos N° 110, agar DNAsa.

8.1 Agares y medios de enriquecimiento para Staphylococcus aureus

-Agares:
 Agar Baird-Parker. Es un medio excelente para el recuento de Staphylococcus aureus, incluso,
aunque se trate de células que sufrieron un daño subletal (33). Además, es el medio
moderadamente selectivo más corrientemente usado. Su composición consta de piruvato sódico el
cual ayuda a recuperar las bacterias lesionadas; su poder selectivo se debe a la presencia de telurito,
cloruro de litio y glicina. En el medio, Vol. 25, No. 3, septiembre-diciembre de 2014 la característica
 positiva de la presencia de Staphylococcus aureus es la presencia de un aspecto negro, debido a la
reducción del telurito (34), con un halo transparente que revela la actividad lipolítica sobre la yema
de huevo; sin embargo, las colonias deben confirmarse mediante un examen de frotis teñido con
coloración de Gram.
 Agar Salado Manitol. Se emplea para el aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus. El agar sal
manitol contiene una concentración de cloruro sódico de 7.5%, el cual es el agente activo (34) del
medio e inhibe parcial o completamente a los organismos bacterianos diferentes de los
estafilococos. Los estafilococos coagulasa (+) (Staphylococcus aureus) producen colonias de color
amarillo y un medio circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la
coagulasa producen colonias de color rojo y no provocan cambios en el color del indicador rojo fenol
 Agar estafilococos N° 110. Es un medio selectivo para aislar estafilococos patógenos a partir de
muestras clínicas y no clínicas, basado en la fermentación de manitol, la formación de pigmento y la
actividad gelatinasa. Este medio también se utiliza para el aislamiento de estafilococos que
contaminan una amplia variedad de alimentos y producen una intoxicación alimentaria. Los
estafilococos coagulasa (+) patógenos crecen en altas concentraciones de NaCl y forman colonias
amarillas y doradas. Por otra parte, la fermentación de manitol se detecta por medio de la adición
de unas gotas de azul de bromotimol a la placa, buscando las colonias con un halo amarillento
alrededor. Los estafilococos licúan la gelatina produciendo zonas claras alrededor de las colonias.
Para esta prueba, se le agrega a la caja Petri 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio o
adicionando una gota de ácido sulfosalicílico al 20% e incubando 12 minutos para observar la
hidrólisis de la gelatina. Una zona clara-transparente alrededor de la colonia constituye una
hidrólisis (+) (Stone’s reaction).
 Agar DNAsa. Es utilizado para identificar estafilococos potencialmente patógenos; manifiesta la
actividad de la desoxirribonucleasa, la cual es indicadora de su patogenicidad (34). Asimismo, se
investiga la capacidad del microorganismo de producir enzimas que hidrolicen el ADN. La aparición
de halos transparentes alrededor del área de crecimiento se considera resultado positivo, ya que
estas corresponden a zonas de hidrólisis del ADN. La prueba es considerada negativa en caso de que
los halos característicos no estén presentes (37). De manera complementaria a lo anterior, se
emplean pruebas bioquímicas como coagulasa y catalasa entre otras.

- Medios de enriquecimiento

ha movido a numerosos investigadores a ensayar y proponer una variedad de medios selectivos y diferenciales. 110 y
agar Chapman-Stone. También, haciendo uso del cloruro de sodio al 10 por ciento, Maitland y Martyn formularon un
medio líquido de enriquecimiento selectivo para los estafilococos que se encuentran en material altamente contaminado
con flora mixta. Finegold y Sweeney presentaron un medio base de agar nutritivo con 75 µg por ml de polimixina B
como agente selectivo, al cual atribuyen una serie de ventajas sobre los medios desarrollados por Chapman.

Este medio fue modificado por Deneke y Blobel reemplazando el caldo nutritivo con infusión de cerebro y corazón
y, para darle además el carácter de diferencial, sobre el agar ya solidificado esparcieron una pequeña cantidad de
plasma de conejo o de solución de fibrinógeno bovino, lo cual permite observar la capacidad de producción de
coagulasa de cada colonia.

8.2 pruebas bioquímicas

 Catalasa. Se utiliza para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima catalasa, la cual facilita
la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo de utilidad para evitar la formación de
radicales tóxicos por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas (38). La prueba es positiva
cuando la bacteria reacciona produciendo la liberación de burbujas, que es la característica dada por la
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Otras pruebas son específicas de especie como la fermentación del manitol y la producción de la fosfatasa
alcalina. S. aureus también puede identificarse a través de técnicas moleculares como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real, utilizando genes específicos de especie. Sin embargo, estas técnicas
son caras y laboriosas. En ocasiones, se requiere identificar cepas o grupos de cepas con fines epidemiológicos
para lo cual se pueden emplear técnicas fenotípicas y genotípicas.

8.3 pruebas moleculares

El diagnóstico molecular juega un papel importante que se ha incrementado tanto para la detección del agente
etiológico, como para determinar la resistencia a los antimicrobianos, resultados que se obtienen en pocas horas por
estas técnicas comparadas con las técnicas tradicionales. 21 Otro método utilizado para establecer la relación entre
clonas de aislados de S. aureus es la electroforesis en campos pulsados que es el «estándar de oro», método de
referencia para la tipificación molecular de S. 22,23 El análisis multilocus de la secuenciación del DNA por tipificación
de secuencias por MLST es una técnica desarrollada y diseñada para identificar clonas y/o líneas clonales en
poblaciones bacterianas. Sin embargo, no tiene poder para discriminar clonas. Otro método de tipificación es la
proteína A .

 Procedimientos para la detección de Staphylococcus aureus de acuerdo con el tipo de muestra.

Recogida de muestras Según estudios previos, las localizaciones que se aconsejan para la recogida de las muestras son:

 Exudado nasal: toma mediante torunda. Es la localización más adecuada, aunque puede sustituirse por exudado
faríngeo, donde la toma de muestras resulta más incómoda para el paciente. Con mayor sensibilidad está la triple
muestra de exudados nasal, faríngeo y perirrectal o perineal.

 Exudado de piel de la zona perineal-perirrectal: tiene alta sensibilidad, pero no se aconseja como muestra única.

 Muestras de secreciones respiratorias en pacientes con ventilación mecánica o traqueostomía.

 Exudado de úlceras o heridas en pacientes con solución de continuidad de piel.

 Urocultivo en pacientes con sonda vesical.

9.1 Métodos de detección en muestras de alimentos

-Prueba de la coagulasa en lámina

Se utiliza para determinar la coagulasa ligada. Constituye una forma rápida de identificación del S. aureus,  aunque es
solo presuntiva, deben verificarse mediante la prueba en tubo todos aquellos cultivos que den resultados negativos o
positivos tardíos, ya que algunas cepas no producen factor de aglutinación. No es recomendable realizar el ensayo de la
coagulasa de S. aureus en lámina, pues a pesar de ser más rápida y económica, presenta los siguientes inconvenientes: 

- Entre un 10 y un 15 % de las cepas de S. aureus  pueden dar un resultado falso negativo.
- Las reacciones deben leerse rápidamente porque aparecen resultados falsos positivos si los tiempos de incubación
exceden los 10 s.

- Las cepas en estudio no deben provenir de medios que contengan altas concentraciones de sal (agar-manitol salado)
porque se presentan reacciones de autoaglutinación.

9.2 Métodos de detección en muestras clínicas.

Utilizan medios selectivos donde MRSA se identifica fácil y rápidamente. Los más empleados son los de agar
cromogénico9,11-13. Existen distintos tipos de medios cromogénicos pero es recomendable usar los que están
suplementados con oxacilina (o cefoxitina), que actúa como agente selectivo impidiendo el crecimiento de las cepas de
MRSA. Se usan diferentes concentraciones de oxacilina (desde 0,5 a 6mg/L) o de cefoxitina (desde 4 a 8mg/L). Estos
medios deben almacenarse a 2-8ºC y se recomienda realizar controles de calidad de los medios con las cepas S aureus
ATCC 29213 (sensible a meticilina) y S aureus ATCC 43300 (resistente a meticilina)18. Proporcionan resultados en 24
horas.
Se realiza una primera lectura a las 24 horas del cultivo y si en las placas no se detecta crecimiento de microorganismos,
se prolonga la incubación hasta las 48 horas. Cualquier microorganismo con una coloración compatible con lo
especificado por el fabricante se identificará como MRSA. Posteriormente se subcultiva en agar sangre para realizar
pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y los estudios que se consideren oportunos.

Para la confirmación de la resistencia a meticilina se pueden emplear métodos fenotípicos o genotípicos.

 Fenotípicos: o Método de difusión en disco6,8,11: disco de cefoxitina (30µg) que es un potente inductor de la
producción de PBP2a, transpeptidasa con baja afinidad por los antibióticos betalactámicos pero que conserva su función
en la síntesis de la pared celular, siendo responsable de la resistencia a la meticilina.

Se trata de un método más precoz que la propia oxacilina en la detección de resistencias. Además, la lectura de su halo
de inhibición es más fácil. o Sistemas automatizados o comerciales como los sistemas Vitek 2 (BioMérieux) y Phoenix
(BD)17 que emplean oxacilina y cefoxitina para la detección de MRSA.

 Genotípicos: la confirmación de resistencia a meticilina en una placa de cultivo se puede realizar detectando el gen
mecA (que codifica la PBP2a) por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional o en tiempo real. También
puede hacerse mediante aglutinación con látex para detectar la presencia de la PBP2a. Estos métodos de confirmación
requieren de una identificación previa de la especie del microorganismo (S aureus) porque la resistencia a meticilina en
cepas de estafilococos coagulasa negativa también está mediada por el gen mecA y su producto, la PBP2a.

Referencias:

 https://www.aetsa.org/download/publicaciones/antiguas/AETSA_2011_2_5_MRSA.pdf
 https://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2014/pt141e.pdf
 https://www.binasss.sa.cr/revistas/rccm/v2n2/art2.pdf
 https://www.medigraphic.com/pdfs/revbio/bio-2014/bio143d.pdf